Method Article

عزل ومعالجة الخلايا الشحمية البيضاء الفئران لتحليلات النسخ والإبجينوم

DOI:

10.3791/64128

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Van Andel Institute, 2Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 3Department of General and Visceral Surgery, Medical Center-University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلخص البروتوكول الحالي طريقة عالمية لعزل وتنقية ومعالجة المنبع للخلايا الشحمية البيضاء الفئران المحسنة لتسلسل الحمض النووي الريبي الكلي ، واستخراج النوى عن طريق SONication (NEXSON) ، و ChIP-seq.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السمنة مرض معقد يتأثر بعلم الوراثة وعلم التخلق والبيئة وتفاعلاتها. تمثل الخلايا الشحمية الناضجة نوع الخلايا الرئيسي في الأنسجة الدهنية البيضاء. يعد فهم كيفية عمل الخلايا الشحمية والاستجابة للإشارات الجينية والبيئية (epi) أمرا ضروريا لتحديد سبب (أسباب) السمنة. تم عزل الحمض النووي الريبي والكروماتين سابقا من الخلايا الشحمية باستخدام الهضم الأنزيمي. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير بروتوكولات للعزل النووي ، حيث يتم تحقيق التنقية عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للمراسلين المعدلين وراثيا الخاصين بالخلايا الشحمية. أحد أكبر التحديات لتحقيق إنتاجية عالية وجودة خلال هذه البروتوكولات هو الكمية الكبيرة من الدهون الموجودة في الأنسجة الدهنية. يصف البروتوكول الحالي إجراء محسنا لعزل الخلايا الشحمية الناضجة التي تستفيد من الهبتان لفصل الدهون عن الأهداف ذات الأهمية (الحمض النووي الريبي / الكروماتين). يتمتع الحمض النووي الريبي الناتج بسلامة عالية ويولد نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي عالية الجودة. وبالمثل ، يعمل الإجراء على تحسين معدل إنتاجية النوى ويولد نتائج ChIP-seq قابلة للتكرار عبر العينات. لذلك ، توفر الدراسة الحالية بروتوكولا موثوقا وعالميا لعزل الخلايا الشحمية في الفئران مناسبا لدراسات نسخ الجينوم الكامل ودراسات الجينوم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عادة ما تفهم السمنة على أنها مرض تراكم الدهون الزائدة الذي يساهم في زيادة خطر الإصابة بمرض السكري من النوع 2 ، وأمراض القلب والتمثيل الغذائي ، وعدة أشكال من السرطانات1،2،3. في حين أن الفهم الحالي للسمنة متجذر بشكل كبير في علم الوراثة (من كل من الدراسات البشرية والقوارض) ، فإن حوالي 30٪ -70٪ من الاستعداد لأمراض التمثيل الغذائي غير وراثي في الأصل4،5،6،7،8 ولا يزال غير محدد.

تلعب الأنسجة الدهنية دورا مهما في السمنة وأمراض التمثيل الغذائي الأخرى9،10. تتكون الأنسجة الدهنية من الخلايا الشحمية الناضجة وجزء الأوعية الدموية اللحمية ، بما في ذلك الخلايا الشحمية والخلايا البطانية والخلايا المناعية. لا يزال من غير الواضح كيف يساهم كل نوع من الخلايا في السمنة وكيف يساهم خلل تنظيم الخلايا الشحمية في السمنة. تعتبر بروتوكولات العزل والتنقية القابلة للتكرار والفعالة لدراسات epigenome الخلايا الشحمية الناضجة ذات أهمية في هذا المجال.

لطالما تم عزل الخلايا الشحمية الناضجة لتحليلات التعبير الجيني11 ودراسات epigenome12،13. هناك استراتيجيتان رئيسيتان لعزل الخلايا الشحمية. الأول هو استخدام الهضم الأنزيمي لفصل الخلايا الشحمية الناضجة عن بقية أنواع الخلايا في الجزء الوعائي اللحمي11،14. والثاني هو التخلص من الأنسجة الدهنية لإطلاق نوى سليمة ثم استعادة النوى بناء على مراسل الفلورسنت عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) 12،13 ، الأمر الذي يتطلب نماذج متخصصة للمراسلين المعدلين وراثيا. التحدي التقني في كل حالة هو أن الخلايا الشحمية الناضجة تحتوي على تركيزات عالية من الدهون (الشكل 1) ، مما يقلل من جودة و / أو عائد إجمالي الحمض النووي الريبي15،16 والنوى17. هنا ، يتم وصف إجراء الهضم الأنزيمي المحسن لعزل الخلايا الشحمية الناضجة ، حيث تتمثل ميزة الهبتان في إذابة وإزالة الدهون بسرعة وكفاءة18 قبل استخراج الحمض النووي الريبي أو خطوات عزل النوى عن طريق استخراج النوى بواسطة SONication (NEXSON) 19. يضمن البروتوكول انتعاشا ممتازا وجودة الحمض النووي الريبي الكلي للدراسات على مستوى الجينوم ويحسن بشكل كبير إنتاجية النوى السليمة ل ChIP-seq القابل للتكرار.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) ، رقم البروتوكول: 18-10-028. تم قتل الفئران الذكور C57BL / 6J البالغة من العمر 12 أسبوعا بثاني أكسيد الكربون2 وتشريحها لجمع الضمادات الدهنية من الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية (eWAT).

1. عزل الخلايا الشحمية

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للهضم (الجدول 1) وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. ضع الوسادة الدهنية من الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية (eWAT) في طبق بتري. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة (5 مم × 5 مم) باستخدام ملقط ومشرط في 5 مل من DMEM.
    ملاحظة: يفضل طبق بتري الذي لا يحتوي على طلاء التصاق الخلية. من المهم أيضا إمساك وسادة الدهون برفق لتجنب إتلاف الخلايا. كلما تم التعامل مع الأنسجة الدهنية ، زاد ضعف العائد. يفضل استخدام طريقة المشرط / الملقط على قطع الضمادات الدهنية بالمقص أو الملقط وحده لأنها يمكن أن تلحق الضرر بالخلايا الشحمية.
  3. استنزاف DMEM الزائد دون إزعاج بقايا الأنسجة.
    ملاحظة: لا تلتقط بقايا الأنسجة من سطح طبق بتري.
  4. أضف 5 مل من محلول الهضم إلى طبق بتري ، وقم بتحريكه لتحرير شظايا الأنسجة من الطبق ، واسكب المحتوى بالكامل في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. كرر العملية حتى يتم نقل جميع شظايا الأنسجة إلى أنبوب الطرد المركزي.
  5. أضف المخزن المؤقت المتبقي للهضم إلى أنبوب الطرد المركزي بحيث يكون الحجم النهائي ~ 20 مل.
  6. احتضان شظايا الأنسجة في حمام مائي مهتز 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 20-30 دقيقة ، أو حتى تصبح شظايا الأنسجة أصغر من 1 مم × 1 مم.
  7. أضف 0.4 مل من 0.5 M EDTA و 0.2 مل من 0.5 M EGTA إلى أنبوب الطرد المركزي ، واستمر في الاهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  8. انقل معلق الخلية بماصة سعة 10 مل من خلال مرشح مصفوفة دقيقة (420 ميكرومتر، انظر جدول المواد) فوق أنبوب طرد مركزي آخر سعة 50 مل لإزالة الأنسجة غير المهضومة.
  9. جهاز الطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل الخلايا الشحمية النقية (العائمة في الأعلى) عن جزء الأوعية الدموية اللحمية (الحبيبات في الأسفل) (الشكل 2 أ).
  10. صب طبقة الخلايا الشحمية العائمة في أنبوب جديد سعة 50 مل ، مع الحرص على عدم تعطيل الحبيبات.
    ملاحظة: تجنب استخدام أطراف الماصة لنقل الخلايا الشحمية العائمة لأنها يمكن أن تلتصق بجدار طرف الماصة (وبالتالي تقليل الإنتاجية). سوف ينتقل بعض عازلة الهضم إلى الأنبوب الجديد. استخدم حقنة وإبرة لإزالة المخزن المؤقت المتبقي للهضم من تحت طبقة الخلايا الشحمية.
  11. استخدم الخلايا الشحمية المنقاة لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي (الخطوة 2.) و / أو ChIP-seq (الخطوة 3. والخطوة 4.) على الفور.
    ملاحظة: يمكن للمستخدم أن يقرر استخدام مستخلص الخلايا الشحمية بالكامل للخطوة 2. أو الخطوة 3 ، اعتمادا على الغرض من البحث. يمكن للمستخدم أيضا تقسيم استخراج الخلايا الشحمية بأكملها إلى جزأين ومواصلة الخطوة 2. والخطوة 3. بالتوازي مع الحصول على نتائج التحليل من العينات المتطابقة بيولوجيا.

2. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة في غطاء كيميائي.

  1. أضف كاشف عزل الحمض النووي الريبي (1 مل) (انظر جدول المواد) إلى الخلايا الشحمية المنقاة في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل (الخطوة 1.11).
  2. الماصة لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل لإذابة الخلايا الشحمية تماما في كاشف عزل الحمض النووي الريبي ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
  3. احتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. أضف 0.5 مل من السباع إلى أنبوب الطرد المركزي والدوامة بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: سوف تذوب الدهون في السباع (الشكل 2 ب).
  5. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. احصل على الطبقة السفلية من كاشف عزل الحمض النووي الريبي باستخدام حقنة وإبرة 30 جم ، وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
  7. أضف 0.1 مل من 1 برومو -3 كلورو بروبان (انظر جدول المواد) إلى مستخلص كاشف عزل الحمض النووي الريبي والدوامة بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  8. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استخدم ماصة لجمع المرحلة المائية العلوية ونقلها إلى أنبوب جديد.
  9. أضف 0.5 مل من الأيزوبروبانول واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: سيتم ترسيب الحمض النووي الريبي على شكل حبيبات في قاع الأنبوب.
  10. استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية ، مع الحرص على تجنب لمس الحبيبات.
  11. أضف 1 مل من 75٪ EtOH والدوامة بأقصى سرعة لفترة وجيزة.
  12. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 7,500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام طرف ماصة. لا تزعج الحبيبات.
  13. جفف الحبيبات بالهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق أو حتى تصبح الحبيبات شفافة / شفافة.
  14. قم بإذابة الحبيبات في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.

3. تثبيت الخلايا الشحمية ل ChIP-seq

ملاحظة: نفذ الخطوة 3. في غطاء كيماو.

  1. أضف 0.3 مل من 0.5 M EDTA ، و 0.2 مل من 0.5 M EGTA ، و 14.8 مل من DMEM ، و 10 مل من الهبتان في أنبوب 50 مل يحتوي على خلايا شحمية معزولة (الخطوة 1.11).
  2. أضف 0.7 مل من الفورمالديهايد 16٪ (0.7٪ النهائية) وقم بتدويرها على دوار أنبوبي (انظر جدول المواد) عند 10 دورات في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قم بإعداد مؤقت والعد لمدة 5 دقائق. في حالة معالجة عينات متعددة ، أضف الفورمالديهايد بالتتابع على فترات 30 ثانية لتمكين توقيت دقيق وقابل للمقارنة للتثبيت عبر جميع العينات.
  3. أضف 1.78 مل من 1.25 م جلايسين (0.125 م نهائيا) واخلطه على الدوار عند 10 دورات في الدقيقة لمدة لا تزيد عن 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يظل الفورمالديهايد نشطا حتى بعد إضافة الجلايسين. لذلك ، من المهم فصل الطبقات عن طريق الطرد المركزي (الخطوة 3.4) مباشرة بعد خطوة الحضانة لمدة 5 دقائق. إذا كان هناك أكثر من عينة واحدة ، أضف الجلايسين إلى كل عينة لإيقاف التفاعل بالتتابع في فجوات زمنية مدتها 30 ثانية.
  4. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك ثلاث طبقات سائلة واضحة ومنفصلة (الشكل 2 ج). تحتوي الطبقة البيضاء الوسطى على الخلايا الشحمية الثابتة.
  5. استخدم طرف ماصة سعة 1 مل لنقل طبقة الخلايا الشحمية (البيضاء) إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل، مما يقلل من كمية المثبت والسبتين المنقولة في الأنبوب الجديد.
  6. املأ الأنبوب ب 10 مل (درجة حرارة الغرفة) DMEM مكملا بكوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني (الموافقة المسبقة عن علم ، انظر جدول المواد). تخلط جيدا عن طريق الانعكاس.
  7. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند ≤200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. حافظ على قوة الطرد المركزي عند 100 × جم لتقليل انفجار الخلايا.
  8. كرر الخطوات 3.5.-3.7. 1x قبل الانتقال إلى الخطوة 3.9.
  9. استخدم طرف ماصة سعة 1 مل لنقل طبقة الخلايا الشحمية (البيضاء) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل أو 2 مل.
  10. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 100-200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واستخدم طرف ماصة سعة 1 مل لإزالة الهبتان (الطبقة العليا) و DMEM (الطبقة السفلية).
  11. قم بتخزين الخلايا الشحمية الثابتة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر حتى الاستخدام.

4. استخراج النوى وقص الكروماتين

ملاحظة: تم اقتباس هذا الإجراء من Arrigoni et al.19.

  1. قم بتشغيل جهاز الصوتنة (انظر جدول المواد) واضبط طاقة الذروة على 75 واط ، وعامل العمل على 2٪ ، و 200 دورة / انفجار ، مع ضبط مبرد حمام الماء على 20 درجة مئوية.
  2. أضف كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني (PIC) إلى مخزن فارنهام المؤقت ومخزن القص (الجدول 1).
    ملاحظة: يرجى التحقق من عدد قليل من الصوتيات والمعلمات المقترحة في Arrigoni et al.19.
  3. أعد تعليق الخلايا الشحمية الثابتة (من الخطوة 3.) مع 750-800 ميكرولتر من المخزن المؤقت فارنهام البارد في أنبوب صوتنة 1 مل (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يوصى بعدم ملء الأنبوب بكامل طاقته. خلاف ذلك ، سوف تطفو الخلايا الشحمية إلى الجزء العلوي من الأنبوب ، مما يقلل من كفاءة الصوتنة.
  4. صوتنة العينة لمدة 2.5 دقيقة.
    ملاحظة: تحقق من استخراج النوى على مجهر تباين الطور لتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الصوتنة. يجب أن تكون النوى مستديرة وسليمة ، كما هو موضح في الشكل 2 د.
  5. قبل المضي قدما ، اضبط قوة الذروة للصوتنة على 140 واط ، وعامل العمل على 5٪ ، و 200 دورة / انفجار ، مع ضبط مبرد حمام الماء على 4 درجات مئوية.
  6. استخدم ماصة لنقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بإزالة المادة الطافية بعناية من الحبيبات (النوى) واحتفظ بالحبيبات.
  8. اغسل الحبيبات ب 1 مل من مخزن فارنهام المؤقت على الثلج.
  9. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واستخدم ماصة لإزالة المادة الطافية ، واحتفظ بالحبيبات.
  10. كرر الخطوات 4.8.-4.9. 1x قبل الانتقال إلى الخطوة 4.11.
    ملاحظة: يمكن تخزين النوى المعزولة والمغسولة عند -80 درجة مئوية لمدة 3 أشهر حتى الاستخدام الآخر.
  11. أعد تعليق النوى المعزولة في 1 مل من المخزن المؤقت للقص ، ونقلها إلى أنبوب صوتنة جديد سعة 1 مل. تأكد من عدم وجود فقاعات في الأنبوب.
  12. قم بتقطيع النوى في الصوتنة بقوة قصوى تبلغ 140 واط ، وعامل واجب 5٪ ، و 200 دورة / انفجار لمدة 12 دقيقة لقص الكروماتين عند 4 درجات مئوية.
  13. انقل المحللة إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: يتم إطلاق الكروماتين المنفصم من النوى ويتم احتواؤه في المخزن المؤقت (المحللة).
  14. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الحطام غير القابل للذوبان. انقل المادة الطافية (الكروماتين) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل.
  15. يمكن تخزين الكروماتين المنفصم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 أيام أو عند -80 درجة مئوية لمدة 3 أشهر حتى الاستخدام الآخر.
    ملاحظة: فحص جودة إضافي: Aliquot 25 ميكرولتر من الكروماتين المنفصم لفك الارتباط المتقاطع وإزالة الحمض النووي الريبي باستخدام RNase خال من DNase بعد التقرير المنشورسابقا 19. بالنسبة للدراسة الحالية ، تم تنقية الحمض النووي الناتج باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وتم قياس الحمض النووي باستخدام مجموعة قياس كمية الحمض النووي على أداة القياس الكمي للحمض النووي ، وتم تقييم حجم الجزء بواسطة أداة الرحلان الكهربائي الآلي (انظر جدول المواد). يجب أن يكون حجم الكروماتين المنفصم في حدود 100-800 نقطة أساس. يمكن متابعة بقية كروماتين القص لتطبيق ChIP-Seq المدرج.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل الخلايا الشحمية من ست وسادات دهنية ، وتم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي القائم على الهبتان (الخطوة 2.) ، وتم تحليل الحمض النووي الريبي الناتج على أداة الرحلان الكهربائي الآلي. كان رقم سلامة الحمض النووي الريبي المحسوب (RIN) لجميع العينات >8 (الشكل 3 أ) ، مما يشير إلى تحضير الحمض النووي الريبي عالي الجودة والقابل للتكرار. ثم تم استخدام مجموعة إعداد الحمض النووي الريبي الإجمالية لإعداد مكتبات الحمض النووي الريبي ، وتم تسلسل كل عينة على جهاز التسلسل من الجيل التالي للوصول إلى عمق قراءة يبلغ ≥40 مليون قراءة. كانت درجة Phred لجميع العينات (الشكل 3 ب) ولكل تسلسل (الشكل 3 ج) ≥30 ، مما يدل على تسلسلات الحمض النووي عالية الجودة20. وبالتالي ، فإن إزالة الهبتان تدعم عزل الحمض النووي الريبي عالي الغلة وعالي الجودة المناسب لتسلسل الحمض النووي الريبي.

في خطوة تثبيت الفورمالديهايد ، تم أيضا إجراء ثلاثة مستحضرات عزل نووي تحتوي على الهبتان وتحضير تحكم واحد بدون هيبتان. ثم تم تحليل الكروماتين المنفصم على أداة الرحلان الكهربائي الآلي. في كلتا الحالتين ، تم قص الكروماتين إلى نطاق حجم 100-800 نقطة أساس (الشكل 4 أ) ، وهو مثالي لإجراءات ChIP-seqالنهائية 19. الأهم من ذلك ، تم الحصول على ~ 5 أضعاف الكروماتين من العينات المعالجة بالهيبتان (11.5 نانوغرام / ميكرولتر ، 9.42 نانوغرام / ميكرولتر ، و 9.6 نانوغرام / ميكرولتر) بالنسبة للعينات غير المعالجة (2.2 نانوغرام / ميكرولتر). تم إجراء H3K4me3 و H3K27me3 ChIP-seq بعد Arrigoni et al.19. كما هو موضح في الشكل 4 ب ، كانت مسارات الإشارة من ثلاث عينات مستقلة معالجة بالهيبتان قابلة للمقارنة مع مسار العينة غير المعالجة بالهيبتان لكل من علامات الهيستون. لا يتداخل علاج الهبتان مع جودة ChIP-seq ولكنه يحسن بشكل كبير من إنتاج النوى (والكروماتين المنفصم).

figure-results-1
الشكل 1: الخلايا الشحمية المعزولة. تم تلطيخ الخلايا الشحمية المعزولة ب DAPI (الأزرق) لتلطيخ النواة و BODIPY (الأخضر) للدهون. تشكل قطرات الدهون العصارية الخلوية ما يصل إلى 95٪ من حجم الخلايا الشحمية وتشكل تحديا تقنيا لتحقيق عوائد عالية أثناء استخراج الحمض النووي الريبي والكروماتين. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التدفق التخطيطي لعزل الخلايا الشحمية لتحليل النسخ والجينوم. يتم تصوير سير العمل بأكمله ، من عزل الخلايا الشحمية إلى تطبيق النسخ أو الإبيجينوم. يتم عرض الخطوات الرئيسية والنتائج التمثيلية. (أ) تطفو الخلايا الشحمية المعزولة على الطبقة العليا ، وتنفصل عن جزء الأوعية الدموية اللحمية على شكل حبيبات في قاع الأنبوب. (ب) استخدام الهبتان لإزالة الدهون قبل استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام كاشف عزل الحمض النووي الريبي. (ج) استخدام السباع لإزالة الدهون أثناء تثبيت الخلايا الشحمية. (د) يجب أن تكون الصورة التمثيلية لنوى الخلايا الشحمية المعزولة سليمة ومستديرة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تم إنشاء المخطط مع BioRender.com. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: مخطط كهربية تمثيلي لسلامة الحمض النووي الريبي ودرجات الجودة بعد تسلسل الحمض النووي الريبي. (أ) تمثل العينات 1-6 ستة نسخ مكررة من الخلايا الشحمية المعالجة بالهيبتان ، وتم إجراء تحليل سلامة الحمض النووي الريبي الخاص بها على أداة الرحلان الكهربائي الآلي. استند رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) إلى نسب الحمض النووي الريبي الريبوزومي 18S و 28S ويمثل جودة الحمض النووي الريبي. المقياس من 1 (تدهور كثيرا) إلى 10 (الأقل تدهورا). (ب ، ج) تم تحديد درجة جودة القراءة المتسلسلة عن طريق تحليل QC المتعدد (B) لمتوسط درجة الجودة على الأسس (C) ودرجة الجودة لكل تسلسل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مخطط كهربية تمثيلي للكروماتين المنفصم وقمم التخصيب من ChIP-seq. (أ) ملامح تمثيلية من أداة الرحلان الكهربائي الآلي توضح توزيعات حجم الكروماتين للتحكم (العينة 1 ، أعلى اليسار) ومستحضرات كروماتين الخلايا الشحمية المعالجة بالهيبتان (العينات 2 و 5 و 8 ، أعلى اليمين والسفليين). يشار إلى تركيزات الكروماتين في المستحضرات النهائية في الجزء العلوي الأيسر من كل صورة. (ب) لقطة شاشة لمتصفح الجينوم تم إجراؤها باستخدام عارض الجينوم التكاملي (IGV). يظهر الجزء العلوي من المؤامرة ملفات تعريف H3K4me3 ChIP-seq لثلاث عينات (حمراء) معالجة بالهيبتان وعنصر تحكم واحد (أزرق). تظهر اللوحة السفلية نفس الشيء بالنسبة ل ChIP-seq ل H3K27me3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخزن مؤقتتكوين
عازلة الهضم (ل 3000 مجم أو أقل من وسادة الدهون / 20 مل)20 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)
0.3 غرام من BSA الخالي من الأحماض الدهنية
0.1 جرام كولاجيناز من النوع 2
عازلة مختبر فارنهامأنابيب 5 ملم (درجة الحموضة 8)
85 ملي كيلوسيلتر
0.5٪ إيجيبال
المخزن المؤقت للقص10 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك 8
0.1٪ SDS
1 ملي EDTA

الجدول 1: تكوين المحاليل المؤقتة المختلفة المستخدمة في هذه الدراسة.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد بروتوكول عزل الخلايا الشحمية المقدم هنا على طرق الهضم الأنزيميالمقبولة جيدا 11،14 لفصل الخلايا الشحمية الناضجة (العائمة) عن الجزء الوعائي اللحمي المتبقي للأنسجة الدهنية البيضاء. يوفر نهجا مباشرا وعالميا لتنقية الخلايا الشحمية الناضجة في أي طراز من طراز الفأر. كما هو موضح أعلاه ، فإن البروتوكول مناسب للاستخدام النهائي لتحليلات النسخ الكاملة و ChIP-seq. يوفر عائدا كافيا لتوليد ملفات تعريف جينية متعددة (على سبيل المثال ، العديد من تعديلات الهيستون بالإضافة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي) من نفس وسادة الدهون الفردية.

لضمان الغلة العالية التي تمكن من إعداد بيانات الإبيجينوم المتطابقة ، تتمثل الخطوة الحاسمة في استخدام الهبتان لإذابة الدهون بعيدا عن الخلايا الشحمية السليمة ومن الخلايا الشحمية التي تتحلل أثناء العملية. في تجربتنا ، تزيد هذه الخطوة بشكل كبير من قابلية التكاثر والعائد عن طريق منع فقدان الحمض النووي الريبي والنوى في طبقة الدهون. يعد الدوران المستمر للأنابيب التي تحتوي على الخلايا الشحمية التي تخضع للتثبيت بنفس القدر من الأهمية لأنه يعزز التجانس الذي تتم به إزالة الدهون من الخلايا الشحمية. بدلا من المخزن المؤقت المثبت للفورمالديهايد بنسبة 1٪ الذي تم الإبلاغ عنه في الكثير من أدبيات ChIP-seq21،22 ، وجد أن تقليل التركيز إلى 0.7٪ فورمالديهايد ضروري لتجنب الإفراط في التثبيت. تم تحسين وقت قص الكروماتين أيضا إلى 12 دقيقة لتحقيق نطاق حجم الكروماتين الأمثل (100-800 نقطة أساس) ل ChIP-seq.

تم تحسين البروتوكول لدراسات النسخ السائبة ودراسات الإبيجينوم. لا يزال للبروتوكول الحالي قيوده الخاصة على تطبيقات النسخ أحادية الخلية وتطبيقات الإبجينوم. بالنظر إلى عدم تجانس الخلية المبلغ عنه في مجال السمنة23،24 ، يمكن تطوير طريقة العزل هذه بشكل أكبر لتكييفها مع فحوصات الخلية الواحدة. في مثل هذه السياقات ، يمكن أن تكون العلامات المقيدة بالخلايا الشحمية مثل البورون ثنائي البيروميثين (BODIPY) 25 و perilipin-1 (PLIN1) 26 و ASC-127 أو علامات النوى الخاصة بالخلايا الشحمية ذات قيمة في تمكين تحديد كمية المعلمات الخلوية الإضافية والوظيفية ذاتالصلة 28. بصرف النظر عن التطبيق على الدراسات الجينومية ، قد يحسن هذا البروتوكول أيضا الدراسات البروتينية للخلايا الشحمية ، والتي تواجه عقبة إضافية بسبب ارتفاع محتوى الدهون في الخلايا الشحمية29.

يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لاستخراج نوى الخلايا الشحمية البشرية بنجاح (البيانات غير معروضة) ، مما يوسع تطبيقه ليشمل البحث عن السمنة البشرية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن مدينون للتصوير البصري MPI-IE ، والتسلسل ، ونواة المعلوماتية الحيوية ، والموظفين. تم دعم هذا العمل بتمويل من MPG ، ومعهد أبحاث Van Andel ، وأبحاث Horizon 2020 التابعة للاتحاد الأوروبي ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01HG012444 و R21HG011964) ، واتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie رقم 675610 ، والوزارة الفيدرالية للتعليم والبحث في إطار المشروع رقم 01KU1216 (Deutsches Epigenom Programm ، DEEP).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16٪ محلول الفورمالديهايد (وزن / حجم). ThermoFisher SCIENTIFIC28908
1-bromo-3-chloropropane SIGMAB9673
5 M NaClinvitrogenAM9759
أداة الرحلان الكهربائي الآلي (2100 أداة محلل حيوي)Agilent TechnologiesG2939BA
BODIPY ThermoFisher SCIENTIFICD3922
كولاجيناز نوع 2شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية.43D14184B
كوكتيل مثبط البروتياز الكامل ، الخالي من EDTA (PIC)   ؛Roche4693159001EDTA مجانا
DAPI ThermoFisher SCIENTIFICD1306
DMEM (+ GlutaMAX)  Life Technologies61965-026
طقم تنقية الحمض النووي (طقم تنقية PCR)أداةQiagen28104
(مقياس الفلور Qubit 4)مجموعةFisher SCIENTIFICQ33238
(مقايسة حساسية عالية للحمض النووي)Agilent Technologies5067-4626
EDTAFisher chimicalE478-500
EGTAفيشر شيميكالO2783-100
EtOHPHARMCO111000200
BSA الخالي من الأحماض الدهنية   ؛SERVA11932.01جزء الألبومين البقري V ، خالي من الأحماض الدهنية المجفف
بالتجميد GlycineSIGMAG7126-100G
HeptaneSIGMAH2198-1L
الحمض النووي الريبي عالي الحساسيةAgilent Technologies5067-1513
IgepalSIGMA18896-50ML
KClSIGMAP3911-25G
مرشح المصفوفة (420um)Tisch ScientificME17238
الجيل التالي من التسلسل (HiSeq 3000 Sequencer) من نوكلياز Illumina
 Invitrogen4387936
PIPESACROS العضوية5625-37-6
Proteinase K & nbsp ؛النووي الريبي ThermoFisher SCIENTIFICEO0491
(Trizol) ThermoFisherSCIENTIFIC15596026
RNase A ، خالي من DNase   ؛ThermoFisher SCIENTIFICEN0531
الدوار (مسدس أنبوب حراري علمي دوار) ThermoFisherSCIENTIFIC88881001
SDS ، كبريتات دوديسيل الصوديومSIGMA8170341000
أنبوب صوتنة (1 مل مللي تيوب مع ألياف AFA)Covaris520135
Sonicator (Evolution Focused ultra-sonicator (S220 أو E220))Covaris500217 أو 500239
مجموعة إعداد الحمض النووي الريبي الكلي (مجموعة إعداد الحمض النووي الريبي الكلي Illumina Stranded)Illumina20040525
Tris-HCl الكواشف الحيوية فيشرBP153-500
الخالي من الميثانول قياس كمية الحمض النووي قياس الحمض النووي تحليل مياه خالية كاشف عزل الحمض

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albuquerque, D., Stice, E., Rodríguez-López, R., Manco, L., Nóbrega, C. Current review of genetics of human obesity: From molecular mechanisms to an evolutionary perspective. Molecular Genetics and Genomics. 290 (4), 1191-1221 (2015).
  2. Weihrauch-Blüher, S., Schwarz, P., Klusmann, J. H. Childhood obesity: Increased risk for cardiometabolic disease and cancer in adulthood. Metabolism. 92, 147-152 (2019).
  3. Weihrauch-Blüher, S., Wiegand, S. Risk factors and implications of childhood obesity. Current Obesity Reports. 7 (4), 254-259 (2018).
  4. Gluckman, P. D. Epigenetics, the life-course and metabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 8 (2), 74-76 (2012).
  5. Loh, M., Zhou, L., Ng, H. K., Chambers, J. C. Epigenetic disturbances in obesity and diabetes: Epidemiological and functional insights. Molecular Metabolism. 27, 33-41 (2019).
  6. Sayols-Baixeras, S., et al. DNA methylation and obesity traits: An epigenome-wide association study. The REGICOR study. Epigenetics. 12 (10), 909-916 (2017).
  7. Xia, Q., Grant, S. F. A. The genetics of human obesity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1281 (1), 178-190 (2013).
  8. Yokoi, N. Epigenetic dysregulation in pancreatic islets and pathogenesis of type 2 diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (3), 475-477 (2018).
  9. Frayn, K. N. Obesity and metabolic disease: Is adipose tissue the culprit. Proceedings of the Nutrition Society. 64 (1), 7-13 (2005).
  10. Kawai, T., Autieri, M. V., Scalia, R. Adipose tissue inflammation and metabolic dysfunction in obesity. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (3), 375-391 (2021).
  11. Cat, A. N. D., Briones, A. M. Hypertension: Methods and Protocols. Touyz, R. M., Schiffrin, E. L. , Springer. New York. 283-295 (2017).
  12. Ambati, S., et al. Adipocyte nuclei captured from VAT and SAT. BMC Obesity. 3, 35(2016).
  13. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  14. Jacobsen, M. J., et al. Epigenetic and transcriptomic characterization of pure adipocyte fractions from obese pigs identifies candidate pathways controlling metabolism. Frontiers in Genetics. 10, 1268(2019).
  15. Janke, J., Engeli, S., Gorzelniak, K., Sharma, A. M. Extraction of total RNA from adipocytes. Hormone and Metabolic Research. 33 (4), 213-215 (2001).
  16. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472(2013).
  17. Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, 49501(2019).
  18. Buddrick, O., Jones, O. A. H., Morrison, P. D., Small, D. M. Heptane as a less toxic option than hexane for the separation of vitamin E from food products using normal phase HPLC. RSC Advances. 3 (46), 24063-24068 (2013).
  19. Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: A simple and universal method for ChIP-seq. Nucleic Acids Research. 44 (7), 67(2016).
  20. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  21. Schmidt, D., et al. ChIP-seq: Using high-throughput sequencing to discover protein-DNA interactions. Methods. 48 (3), 240-248 (2009).
  22. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  23. Rondini, E. A., Granneman, J. G. Single cell approaches to address adipose tissue stromal cell heterogeneity. Biochemical Journal. 477 (3), 583-600 (2020).
  24. Corvera, S. Cellular heterogeneity in adipose tissues. Annu Review of Physiology. 83, 257-278 (2021).
  25. Katz, L. S., Geras-Raaka, E., Gershengorn, M. C. Heritability of fat accumulation in white adipocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 307 (3), 335-344 (2014).
  26. Hansen, J. S., de Maré, S., Jones, H. A., Göransson, O., Lindkvist-Petersson, K. Visualization of lipid directed dynamics of perilipin 1 in human primary adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 15011(2017).
  27. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  28. Onogi, Y., Khalil, A. E. M. M., Ussar, S. Identification and characterization of adipose surface epitopes. Biochemical Journal. 477 (13), 2509-2541 (2020).
  29. Kim, E. Y., et al. Recent advances in proteomic studies of adipose tissues and adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 4581-4599 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

White Adipocyte IsolationMurine AdipocytesTranscriptome AnalysisEpigenome AnalysisAdipose TissueRNA IsolationChromatin IsolationNuclear IsolationFACS SortingChIP Seq
Video Coming Soon

Related Articles