Method Article

عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة

DOI:

10.3791/64135

⸱

September 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Science, Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, 3Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية التمثيلية (exosomes و microvesicles) من MSCs البشرية المستزرعة. يتم شرح المزيد من التطبيقات لهذه المركبات الكهربائية أيضا في هذه المقالة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات نانوية غشائية غير متجانسة تطلقها معظم أنواع الخلايا ، ويتم التعرف عليها بشكل متزايد كمنظمات فسيولوجية للتوازن العضوي ومؤشرات مهمة للأمراض. وفي غضون ذلك، بدأت تظهر إمكاناتها الهائلة لإنشاء علاجات للأمراض يمكن السيطرة عليها ويمكن السيطرة عليها. يمكن للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) إطلاق كميات كبيرة من EVs في الثقافة ، والتي أظهرت وعدا ببدء تجديد الأنسجة بشكل فعال وتسهيل التطبيقات العلاجية واسعة النطاق مع قابلية جيدة للتوسع والتكاثر. هناك طلب متزايد على بروتوكولات بسيطة وفعالة لجمع وتطبيق MSC-EVs. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل يعتمد على الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية التمثيلية من MSCs البشرية المستزرعة ، والإكسوسومات ، والحويصلات الدقيقة لمزيد من التطبيقات. تظهر قابلية التكيف لهذه الطريقة لسلسلة من الأساليب النهائية ، مثل وضع العلامات ، والزرع المحلي ، والحقن الجهازي. سيعالج تنفيذ هذا الإجراء الحاجة إلى جمع MSC-EVs وتطبيقها بشكل بسيط وموثوق في الأبحاث الانتقالية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية هي خلايا متعددة القدرات غير متمايزة ذات قدرة على التجديد الذاتي وإمكانات متعدية1. يتم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بسهولة وزراعتها وتوسيعها وتنقيتها في المختبر ، والتي تظل مميزة للخلايا الجذعية بعد ممرات متعددة. في السنوات الأخيرة ، دعمت الأدلة المتزايدة الرأي القائل بأن MSCs تعمل في وضع paracrine في الاستخدام العلاجي 2,3. يلعب إفراز الحويصلات خارج الخلية (EVs) بشكل خاص دورا حاسما في التوسط في الوظائف البيولوجية ل MSCs. كجسيمات نانوية غشائية غير متجانسة يتم إطلاقها من معظم أنواع الخلايا ، تتكون EVs من فئات فرعية تسمى exosomes (Exos) ، والحويصلات الدقيقة (MVs) ، وحتى الأجسام المبرمج الأكبر 4,5. من بينها ، Exos هو EV الأكثر دراسة على نطاق واسع بحجم 40-150 نانومتر ، وهو من أصل endosomal ويفرز بنشاط في الظروف الفسيولوجية. تتشكل MVs عن طريق سفك مباشرة من سطح غشاء بلازما الخلية بقطر 100-1000 نانومتر ، والتي تتميز بالتعبير العالي عن الفوسفاتيديل سيرين والتعبير عن العلامات السطحية للخلايا المانحة6. تحتوي EVs على الحمض النووي الريبي والبروتينات والجزيئات النشطة بيولوجيا الأخرى ، والتي لها وظائف مماثلة للخلايا الأم وتلعب دورا مهما في اتصال الخلايا والاستجابة المناعية وإصلاح تلف الأنسجة7. تم التحقيق على نطاق واسع في MSC-EVs كأداة علاجية قوية خالية من الخلايا في الطب التجديدي8.

يعد عزل وتنقية المركبات الكهربائية المشتقة من MSC مشكلة شائعة في مجال البحث والتطبيق. في الوقت الحاضر ، الطرد المركزي التفاضلي والكثافة9 ، عملية الترشيح الفائق 10 ، الفصل المغناطيسي المناعي 11 ، كروماتوجراف الاستبعاد الجزيئي12 ، ورقاقة الموائع الدقيقة13 هي طرق مستخدمة على نطاق واسع في عزل وتنقية المركبات الكهربائية. مع مزايا وعيوب كل نهج ، لا يمكن تلبية كمية ونقاء ونشاط المركبات الكهربائية المجمعة في نفس الوقت14,15. في هذه الدراسة ، يتم عرض بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية من MSCs المستزرعة بالتفصيل ، مما دعم الاستخدام العلاجي الفعال16،17،18،19،20. كما تم تقديم مثال على قابلية هذه الطريقة للتكيف مع سلسلة من الأساليب النهائية ، مثل وضع العلامات الفلورية ، والزرع المحلي ، والحقن الجهازي. سيعالج تنفيذ هذا الإجراء الحاجة إلى جمع وتطبيق MSC-EVs بشكل بسيط وموثوق في الأبحاث الانتقالية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في الجامعة الطبية العسكرية الرابعة وتم تنفيذها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام الفئران C57Bl / 6 البالغة من العمر ثمانية أسابيع (لا يوجد تفضيل للإناث أو الذكور). تم الحصول على MSCs المشتقة من الحبل السري البشري المحفوظة بالتبريد (UCMSCs) ، المستخدمة في هذه الدراسة ، من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تمت الموافقة على استخدام الخلايا البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في الجامعة الطبية العسكرية الرابعة.

1. زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSCs)

  1. قم بإعداد الملحقات والحلول اللازمة للعمل التجريبي ، بما في ذلك الماصات ، وأطراف الماصة ، وطبق بتري 10 سم ، والمعدات الحرارية (حمام مائي) ، والقفازات المطاطية ، والكحول بنسبة 75٪ ، ووسط الاستزراع (المحتضن عند 37 درجة مئوية) ، ومصل الأبقار القاتل (FBS) ، ومحلول 100x البنسلين والستربتومايسين (P / S) (انظر جدول المواد).
  2. قم بإعداد وسيط ألفا الأدنى الأساسي المتاح تجاريا (α-MEM) عن طريق المكمل ب 20٪ FBS و 1٪ P / S.
    ملاحظة: قم بتخفيف جميع المحاليل المستخدمة لعزل وتحليل المركبات الكهربائية في المياه المفلترة عالية النقاء التي يصنعها نظام تنقية المياه المصفاة عالية النقاء (انظر جدول المواد).
  3. استرجع MSCs المشتقة من الحبل السري البشري المحفوظة بالتبريد (UCMSCs) من النيتروجين السائل عن طريق إذابتها في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  4. انقل معلق الخلية الذائبة بسرعة ورفق إلى أنبوب سعة 15 مل مع 5 مل من وسط الاستزراع (الخطوة 1.2). أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 500 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. إزالة طافي مع ماصة معقمة والحفاظ على راسب الخلية. أضف 2 مل من وسط الاستزراع في أنبوب الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا برفق.
  6. بذر الخلايا في طبق بتري 10 سم ، وأضف 8 مل من وسط الثقافة إلى إجمالي 10 مل.
  7. MSCs الثقافة في 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO2 في حاضنة الخلية.

2. الطرد المركزي التفاضلي لعزل Exos و MVs

  1. عندما تنمو MSCs إلى التقاء >90٪ ، استبدل وسط الاستزراع ب α-MEM المكمل ب 20٪ من FBS المستنفد للمركبات الكهربائية و 1٪ P / S مقابل 8 مل من كل طبق.
    ملاحظة: أجهزة الطرد المركزي FBS عند 4 درجات مئوية ، 1،50،000 × ز بين عشية وضحاها لإزالة المركبات الكهربائية والشوائب الأخرى.
  2. بعد 48 ساعة من الاستزراع ، اجمع وسط الاستزراع (الخطوة 2.1) في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل.
  3. أجهزة الطرد المركزي وسط ثقافة MSC عند 4 درجات مئوية ، 800 × جم لمدة 10 دقائق.
  4. قم بإزالة شظايا الخلايا والحطام الخلوي عن طريق نقل المادة الطافية لتنظيف الأنابيب المخروطية سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: يعد استخدام الأنابيب المخروطية سعة 1.5 مل ضروريا لزيادة إنتاجية EV.
  5. جهاز طرد مركزي طاف عند 4 درجات مئوية ، 16000 × جم لمدة 30 دقيقة. تم إعادة تعليق MVs من كل طبق من الخلايا ب 50 ميكرولتر من PBS.
  6. نقل المادة الطافية التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي في الخطوة 2.5 بواسطة ماصة لتنظيف أنابيب الطرد المركزي الفائقة. أجهزة الطرد المركزي عند 1،50،000 × ز لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  7. تخلص من المادة الطافية واجمع البقايا ، وهي Exos. إعادة تعليق Exos من سبعة أطباق من الخلايا في 50 ميكرولتر من PBS.
    ملاحظة: يتم استخدام UCMSCs ذات المرور السادس لعزل EV. للحصول على ما يكفي من MVs و Exos للاستخدام التجريبي ، عادة ما تكون هناك حاجة إلى 7-8 أطباق من الخلايا المستزرعة. يتم استخدام عينات EV على الفور لخطوات التوصيف التالية أو للتطبيق العلاجي ، والذي من الأفضل عدم تخزينه.
    تنبيه: تجنب التجميد والذوبان المتكرر للمركبات الكهربائية ، ومن الأفضل تخزين المركبات الكهربائية عند 4 درجات مئوية على المدى القصير وليس عند -80 درجة مئوية.

3. الكشف عن أعداد الجسيمات وتوزيع حجم المركبات الكهربائية من MSCs

ملاحظة: لتقييم توزيع الحجم ، يتم إجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) بواسطة محلل تتبع الجسيمات النانوية المتاح تجاريا (انظر جدول المواد).

  1. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من EVs (من الخطوة 2.5 والخطوة 2.7) في 1,499 ميكرولتر من PBS واخلطها بشكل كاف في أنبوب سعة 15 مل.
  2. قم بتشغيل محلل التتبع باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أولا ، ابدأ تشغيل البرنامج المتوافق (انظر جدول المواد).
  3. املأ خلية العينة بالماء المقطر ، ثم اسمح للأداة ببدء فحص الخلية.
  4. قم بمعايرة الجهاز بمحلول قياسي معد. تأكد من أن رقم الجسيمات المعروض على واجهة اكتشاف البرنامج يتراوح بين 50-400 (يفضل أن يكون حوالي 200). انقر فوق موافق.
    ملاحظة: قم بإعداد المحلول القياسي عن طريق إعادة تكوين 1 ميكرولتر من محلول المعايرة (انظر جدول المواد) في 1 مل من الماء المقطر لتوليد محلول أولي ، ثم خذ 100 ميكرولتر من المحلول الأولي وأضف 25 مل من الماء المقطر لتحضير محلول قياسي (1: 250,000). قم بتخزين هذا الكاشف العامل في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوع.
  5. اشطف خلية العينة ب 5 مل من الماء المقطر.
  6. قبل تحليل العينة ، اغسل القناة ب 1 مل من الماء المقطر. تأكد من أن رقم الجسيمات المعروض على واجهة اكتشاف البرنامج أقل من 10.
  7. حقن 1 مل من عينة EV المحضرة في الخطوة 3.1. قم بإجراء اختبار الحويصلة وفقا لتعليمات تشغيل الجهاز.
    تنبيه: يتم حقن العينة والماء المقطر بحقنة سعة 1 مل بسرعة ثابتة تبلغ 0.5 مل / ثانية تحت تحكم يدوي دقيق.

4. توصيف مورفولوجيا EV بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)

  1. تمييع 1 ميكرولتر من EVs من الخطوة 2.7 في 199 ميكرولتر من PBS وتخلط بما فيه الكفاية. أضف 20 ميكرولتر من قطرات تعليق EV إلى الشبكة المربعة المطلية بالكربون / formvar (انظر جدول المواد) ، واتركها لمدة 3 دقائق.
  2. قم بإزالة السائل الزائد بواسطة ورق ترشيح صغير ، واتركه لمدة 15 ثانية لتجفيف السطح قليلا.
  3. تلطيخ عينات EV سلبا مع قطرات حمض الفوسفوتونجستيك 1.5٪ لمدة 40 ثانية.
  4. قم بإزالة حمض الفوسفوتونجستيك الزائد واتركه يقف لمدة 15 ثانية لتجفيف السطح قليلا.
  5. ضع العينة التي تحتوي على شبكة مربعة مطلية بالكربون / الكربون في طبق نظيف مغطى بأوراق الترشيح. مراقبة والتقاط الصور باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ.
    ملاحظة: في هذه العملية، يتم أخذ Exos كمثال.

5. وضع العلامات على المركبات الكهربائية المشتقة من MSCs

  1. بعد استخراج EVs (الخطوة 2.5) ، أعد التعليق باستخدام 250 ميكرولتر من PBS في أنبوب مخروطي سعة 1.5 مل.
  2. استخدم أنبوبا مخروطيا آخر سعة 1.5 مل لإعداد محلول العمل لصبغة PKH26 ؛ استخدم 1 ميكرولتر من كاشف وضع العلامات PKH26 المخفف ب 250 ميكرولتر من Dituent C (أحد مكونات مجموعة وضع العلامات EV المتاحة تجاريا المستخدمة في الدراسة الحالية ، انظر جدول المواد).
    ملاحظة: قم بإعداد حل العمل مباشرة قبل الاستخدام.
    تنبيه: صبغة PKH26 المفرطة أو الملصقات دون تخفيف مسبق معرضة لخطر إتلاف المركبات الكهربائية.
  3. امزج المركبات الكهربائية المعاد تعليقها مع حل العمل. اتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم أضف 500 ميكرولتر من FBS المستنفد EV لإيقاف التفاعل.
  4. بالنسبة للمركبات MV ، قم بطرد مركزي عند 4 درجات مئوية ، 16000 × جم لمدة 30 دقيقة ، وتخلص من المادة الطافية بواسطة ماصة. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني لشطف البقايا.
  5. أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 16000 × جم لمدة 30 دقيقة ، وتخلص من المادة الطافية لإزالة الصبغة غير المنضمة.
  6. أعد تعليق البقايا ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إسقاط 20 ميكرولتر من التعليق على الشريحة ومراقبتها تحت المجهر مضان.
    ملاحظة: في هذه العملية ، يتم أخذ MVs كمثال.

6. الزرع المحلي والحقن الجهازي ل MSC-EVs

ملاحظة: بالنسبة للإجراءات التالية ، ضع المركبات الكهربائية على الثلج قبل الحقن.

  1. قم بإجراء عملية زرع موضعية باتباع الخطوات أدناه.
    1. تخدير الفئران مع 4 ٪ (المجلد / المجلد) إيزوفلوران. الحفاظ على التخدير في 1 ٪ -3 ٪ إيزوفلوران أثناء العملية.
    2. قبل الجراحة، يتم تطبيق 5 ملغ/كغ من كاربروفين (IP) لتسكين الألم لتقليل الألم بعد العملية.
    3. قبل استئصال الجرح ، حلق الشعر الظهري وعقم السطح الظهري عن طريق تطبيق 3 جولات متناوبة من 10٪ بوفيدون اليود و 75٪ إيثانول.
    4. باستخدام لكمة خزعة (انظر جدول المواد) ، قم بإنشاء جرح كامل السماكة يبلغ قطره 1 سم على الجلد الظهري.
    5. أعد تعليق EVs المشتقة من MSC من طبقين في 100 ميكرولتر من PBS وقم بإدارة الحقن في الطبقة تحت الجلد من سرير الجرح ، حول كل جرح بأربعة مواقع.
      ملاحظة: يتم حقن ما معدله 100 ميكروغرام من EVs لكل فأر (EVs من طبقين من الخلايا 10 سم). هناك حاجة إلى عشرة أطباق 10 سم من MSCs لإنتاج ما يكفي من المركبات الكهربائية لإعداد تجربة n = 5 في نموذج الفئران.
    6. بعد العلاج ، لف الفئران بشاش معقم وضعها على وسادات عازلة للحرارة (انظر جدول المواد) حتى تستيقظ.
    7. تأكد من عدم ترك الفئران دون مراقبة حتى تستعيد وعيها الكافي. لا تعيد الفئران إلى شركة الحيوانات الأخرى حتى تتعافى تماما.
    8. تطبيق جرعات إضافية من التسكين في اليوم 2 واليوم 3 بعد الجراحة حسب الحاجة.
  2. إجراء الحقن الجهازي.
    1. أعد تعليق المركبات الكهربائية المشتقة من MSC في 200 ميكرولتر من PBS ، ثم اخلطها بمحلول الهيبارين بنسبة حجم 10: 1.
    2. ضع الفئران في نظام تصوير الوريد الذيلي (انظر جدول المواد). اضغط على المفتاح لرفع الرافعة.
    3. تطهير الوريد الذيل باستخدام ضمادة الكحول قبل الحقن الوريدي. ثم ، حقن الفئران بشكل منهجي مع تعليق أعدت في الخطوة 6.2.1 من خلال الوريد الذيل. ويساعد هذا الإجراء من قبل رسام الوريد الذيل.
      ملاحظة: حقن تعليق EV مباشرة بعد الخلط مع الهيبارين. يتم حقن ما معدله 100 ميكروغرام EVs لكل فأر (EVs من طبقين من الخلايا 10 سم). هناك حاجة إلى عشرة أطباق 10 سم من MSCs لإنتاج ما يكفي من المركبات الكهربائية لإعداد تجربة n = 5 في نموذج الفئران.
      تنبيه: عادة ما يقتصر حقن وريد ذيل الفأر على 200 ميكرولتر من الحجم. يجب أن تسير الحقن ببطء وتتوقف إذا رأيت نتوءا أو مقاومة ، مما يشير إلى أن الإبرة خارج الوريد. إذا أظهرت الفئران علامات سريرية سلبية مثل الشباك والارتعاش ، فقد يكون هذا استجابة صدمة للحقن بكميات كبيرة أو الحقن السريع أو السمية / الحساسية المفرطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم عزل MVs و Exos من UCMSCs البشرية المستزرعة باتباع سير العمل التجريبي (الشكل 1). توضح نتائج NTA أن حجم Exos من MSCs البشرية يتراوح من 40 نانومتر إلى 335 نانومتر مع حجم ذروة يبلغ حوالي 100 نانومتر ، ويتراوح حجم MVs من 50 نانومتر إلى 445 نانومتر مع حجم ذروة يبلغ 150 نانومتر (الشكل 2). يظهر التوصيف المورفولوجي ل Exos المشتق من MSC شكل كوب نموذجي (الشكل 3). يتم تمييز المركبات الكهربائية بكفاءة بواسطة PKH26 ، والذي يتم ملاحظته من خلال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر المركبات الكهربائية لتلعب دورا مهما في الأنشطة البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك عرض المستضد ، ونقل المواد الوراثية ، وتعديل البيئة الدقيقة للخلايا ، وغيرها. علاوة على ذلك ، فإن تطبيقها على نطاق واسع يجلب مناهج وفرصا جديدة لتشخيص الأمراض وعلاجها21. يعتمد تنفيذ التطبيقات العلاجية للمركبات الكهربائية على العزل والتوصيف الناجحين. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود طرق عزل وتنقية موحدة وانخفاض كفاءة الاستخراج ، فقد أعيقت أبحاث المركبات الكهربائية. تقدم هذه المقالة بشكل أساسي بروتوكول استخراج وتوصيف سهل الجد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000974 و 81930025 و 82170988) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2019M663986 و BX20190380). نحن ممتنون للمساعدة المقدمة من المركز الوطني التجريبي للتدريس التجريبي للطب الأساسي (AMFU) والمختبر المركزي التحليلي والاختبار لمركز الابتكار الطبي العسكري التابع لجامعة الطب للقوات الجوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 ٪ بوفيدون اليود (بيتادين)Weizhenyuan10053956954292تطهير الجروح
محلول معايرةالجسيمات Metrix110-0020معايرة أداة NTA
CarprofenSigma53716-49-7مسكن الطب
تصوير الوريد الذيلي KEW Life ScienceKW-XXYالوريد الذيلي
الطرد المركزيEppendorf5418Rالطرد المركزي
مصل الأبقار القاتلCorning35-081-CVثقافة UCMSCs
Formvar / شبكة مربعة مطلية بالكربونPBL Assay Science   ؛24916-25مجهر إلكتروني ناقل الحركة
وسادة تسخينZhongke Life ScienceZ8G5JBMzرعاية ما بعد العلاج للحيوانات
محلول الهيبارينStemCell7980الحقن الجهازي
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22التخدير الحيواني
الحد الأدنى الأساسي المتوسط ألفا الأساسي (1x)GibcoC12571500BTثقافة UCMSCs
محلل تتبع الجسيمات النانويةالجسيمات MetrixZetaView PMX120تحليل تتبع الجسيمات النانوية
PBS (1x)MeilunbioMA0015إعادة تعليق المركبات الكهربائية
البنسلين / الستربتومايسينبروسيل علوم الحياةPB180120ثقافة UCMSCs
حمض الفوسفوتونغستيكSolarbio12501-23-4مجهر
PipetteEppendorf3120000224
PKH26 مجموعة ربط الخلايا الفلورية الحمراءSigma-AldrichMINI26وضع العلامات على المركبات الكهربائية
لكمة خزعة الجلدAcuderm69038-10-50عيوب الجلد
ZetaViewParticle Metrixالإصدار 8.05.14 SP7 
المعدات الحراريةمنحةv-0001-0005حمام مائي
نقل المجهر الإلكترونيهيتاشيHT7800مجهر إلكتروني
ناقل الحركة UCMSCsBai'ao & nbsp ؛UKK220201تجاريا UCMSCs
أجهزة الطرد المركزي الفائقBeckmanXPN-100
تنقية المياه المفلترة فائق النقاءMilli-QIQ 7000المياه فائقة النقاء
تصوير جهاز إلكتروني ناقل الحركة برامج نظام تحضير

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619(2020).
  2. Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
  3. Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025(2019).
  4. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  5. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
  6. Lei, L. M., et al. Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996(2021).
  7. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  8. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  9. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22(2006).
  10. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
  11. Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
  12. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  13. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  16. Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
  17. Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
  18. Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074(2021).
  19. Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830(2020).
  20. He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708(2019).
  21. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835(2019).
  24. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).
  25. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).
  26. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).
  27. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  28. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162(2016).
  29. Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
  30. Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
  31. Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
  32. Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274(2019).
  33. Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesenchymal Stem CellsExtracellular VesiclesDifferential CentrifugationMicrovesicle IsolationExosome CharacterizationNanoparticle TrackingFluorescence MicroscopyPKH26 LabelingSystemic InjectionTissue Regeneration

Related Articles