يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وإعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة للخلايا النجمية للفئران

3.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64175

⸱

يوليو 7, 2022

 ,  , 
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, 2Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, 3Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

في هذه المقالة

ملخص

هنا نصف بروتوكولا مفصلا لتوليد ثقافات عالية الإثراء من الخلايا النجمية المستمدة من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي للفئران بعد الولادة وتحويلها المباشر إلى خلايا عصبية وظيفية عن طريق التعبير القسري عن عوامل النسخ.

الملخص

إعادة البرمجة العصبية المباشرة هي نهج قوي لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية من مجموعات الخلايا المبتدئة المختلفة دون المرور عبر وسيطات متعددة القدرات. هذه التقنية لا تحمل فقط وعودا كبيرة في مجال نمذجة الأمراض ، لأنها تسمح بتحويل ، على سبيل المثال ، الخلايا الليفية للمرضى الذين يعانون من أمراض تنكسية عصبية إلى خلايا عصبية ، ولكنها تمثل أيضا بديلا واعدا للعلاجات البديلة القائمة على الخلايا. في هذا السياق، كان الاختراق العلمي الرئيسي هو إثبات أن الخلايا غير العصبية المتباينة داخل الجهاز العصبي المركزي، مثل الخلايا النجمية، يمكن تحويلها إلى خلايا عصبية وظيفية في المختبر. ومنذ ذلك الحين، قدمت إعادة البرمجة المباشرة في المختبر للخلايا النجمية إلى خلايا عصبية رؤى جوهرية حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء التحويل القسري للهوية والعقبات التي تمنع إعادة البرمجة الفعالة. ومع ذلك ، يصعب مقارنة نتائج التجارب المختبرية التي أجريت في مختبرات مختلفة بسبب الاختلافات في الطرق المستخدمة لعزل الخلايا النجمية وزراعتها وإعادة برمجتها. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لعزل الخلايا النجمية واستزراعها بشكل موثوق به مع نقاء عال من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي للفئران في سن ما بعد الولادة عن طريق فرز الخلايا المغناطيسية. علاوة على ذلك ، نحن نقدم بروتوكولات لإعادة برمجة الخلايا النجمية المستزرعة في الخلايا العصبية عن طريق النقل الفيروسي أو نقل الحمض النووي. يمكن استخدام هذا البروتوكول المبسط والموحد للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الحفاظ على هوية الخلية ، وإنشاء هوية عصبية جديدة ، بالإضافة إلى توليد أنواع فرعية عصبية محددة وخصائصها الوظيفية.

المقدمة

الجهاز العصبي المركزي للثدييات (CNS) معقد للغاية ، ويتكون من مئات أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك عدد كبير من الأنواع الفرعية العصبية المختلفة1،2،3،4،5،6. على عكس الأعضاء أو الأنسجة الأخرى7،8،9 ، فإن الجهاز العصبي المركزي للثدييات لديه قدرة تجديدية محدودة للغاية. فقدان الخلايا العصبية بعد إصابة الدماغ الرضحية أو التنكس العصبي لا رجعة فيه وغالبا ما يؤدي إلى عجز حركي ومعرفي10. بهدف إنقاذ وظائف الدماغ ، تخضع استراتيجيات مختلفة لاستبدال الخلايا العصبية المفقودة لتحقيق مكثف11. من بينها ، تظهر إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الجسدية إلى خلايا عصبية وظيفية كنهج علاجي واعد12. إعادة البرمجة المباشرة ، أو التمايز المتبادل ، هي عملية تحويل نوع خلية متمايزة واحدة إلى هوية جديدة دون المرور عبر حالة تكاثرية وسيطة أو متعددة القدرات13،14،15،16. رائدة من خلال تحديد MyoD1 كعامل كاف لتحويل الخلايا الليفية إلى خلايا عضلية17,18 ، تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لإعادة برمجة عدة أنواع من الخلايا إلى خلايا عصبية وظيفية19,20,21.

الخلايا النجمية ، وهي أكثر الخلايا الدبقية الكبيرة وفرة في الجهاز العصبي المركزي22,23 ، هي نوع من الخلايا الواعدة بشكل خاص لإعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة لعدة أسباب. أولا ، يتم توزيعها على نطاق واسع وبالتساوي عبر الجهاز العصبي المركزي ، مما يوفر مصدرا وفيرا في loco للخلايا العصبية الجديدة. ثانيا ، ترتبط الخلايا النجمية والخلايا العصبية ارتباطا وثيقا من الناحية التنموية ، لأنها تشترك في سلف مشترك أثناء التطور الجنيني ، الخلايا الدبقية الشعاعية24. يبدو أن الأصل الجنيني الشائع لنوعي الخلايا يسهل تحويل الخلايا العصبية مقارنة بإعادة برمجة الخلايا من طبقات جرثومية مختلفة19,21. علاوة على ذلك ، يتم الاحتفاظ أيضا بمعلومات الأنماط الموروثة من قبل الخلايا النجمية من خلال أصلها الدبقي الشعاعي في الخلايا النجمية البالغة25،26،27 ، ويبدو أنها تساهم في توليد الأنواع الفرعية العصبية المناسبة إقليميا28،29،30. وبالتالي ، فإن التحقيق في تحويل الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية وفهمه هو جزء مهم من تحقيق الإمكانات الكاملة لهذه التقنية لاستراتيجيات الاستبدال القائمة على الخلايا.

أدى تحويل الخلايا النجمية المستزرعة في المختبر إلى خلايا عصبية إلى العديد من الاختراقات في مجال إعادة البرمجة العصبية المباشرة ، بما في ذلك: i) تحديد عوامل النسخ الكافية لتوليد الخلايا العصبية من الخلايا النجمية 15,19,31 ، ii) تفكك الآليات الجزيئية الناجمة عن عوامل إعادة برمجة مختلفة في نفس السياق الخلوي 32 ، و iii) تسليط الضوء على تأثير الأصل التنموي للخلايا النجمية على تحفيز أنواع فرعية عصبية مختلفة28،29،33. علاوة على ذلك ، كشف التحويل المباشر للخلايا النجمية في المختبر عن العديد من العقبات الرئيسية التي تحد من إعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة 34,35 ، مثل زيادة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)34 والاختلافات بين بروتيوم الميتوكوندريا للخلايا النجمية والخلايا العصبية 35. وبالتالي ، تدعم هذه الملاحظات بقوة استخدام الثقافات الأولية للخلايا النجمية كنموذج لإعادة البرمجة العصبية المباشرة للتحقيق في العديد من الأسئلة الأساسية في علم الأحياء12 ، المتعلقة بالحفاظ على هوية الخلية ، وحواجز الطرق التي تمنع تغيرات مصير الخلية ، وكذلك دور التمثيل الغذائي في إعادة البرمجة.

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل الخلايا النجمية عن الفئران في سن ما بعد الولادة (P) بنقاء عال جدا ، كما يتضح من عزل الخلايا النجمية عن الحبل الشوكي الفئران29. كما نقدم بروتوكولات لإعادة برمجة الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية عن طريق النقل الفيروسي أو نقل بلازميد الحمض النووي. يمكن تحليل الخلايا المعاد برمجتها في 7 أيام بعد النقل (7 DPT) لتقييم جوانب مختلفة ، مثل كفاءة إعادة البرمجة ومورفولوجيا الخلايا العصبية ، أو يمكن الحفاظ عليها في الثقافة لعدة أسابيع ، لتقييم نضجها بمرور الوقت. الأهم من ذلك ، أن هذا البروتوكول ليس خاصا بالخلايا النجمية في الحبل الشوكي ويمكن تطبيقه بسهولة لعزل الخلايا النجمية عن مختلف مناطق الدماغ الأخرى ، بما في ذلك المادة الرمادية القشرية والدماغ المتوسط والمخيخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتبع الإجراء التالي المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات في Helmholtz Zentrum Munich وفقا للتوجيه 2010/63/EU بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية. يرجى التأكد من الامتثال للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات في المؤسسة التي يتم فيها إجراء التشريح.

1. إعداد مواد التشريح والتفكك والثقافة

ملاحظة: قم بإعداد جميع كواشف الاستزراع داخل خزانة السلامة البيولوجية واعمل باستخدام معدات معقمة أو معقمة فقط. يمكن تحضير كواشف التشريح والتفكك خارج خزانة السلامة البيولوجية.

  1. قم بإعداد قوارير الثقافة عن طريق طلاء قارورة ثقافة T25 ب poly-D-lysine (المخزون 1 ملغ / مل ؛ محلول العمل 20 ميكروغرام / مل) في H 2 O لمدة لا تقل عن2ساعة. بعد ذلك ، اشطف 3x باستخدام H2O وجففه في الهواء.
  2. قم بإعداد مخزن التشريح المؤقت عن طريق إضافة 5 مل من محلول التخزين المؤقت HEPES 1 M إلى 500 مل من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS).
  3. قم بإعداد أنبوب C واحد (انظر جدول المواد) لكل ستة حبال شوكية بإضافة 1950 ميكرولتر من العازل X من مجموعة تفكك الأنسجة العصبية (انظر جدول المواد). يحفظ على الثلج أثناء التشريح. تحضير المزيج الرئيسي للهضم الأنزيمي عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت Y و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت A لكل أنبوب C (جزء من مجموعة تفكك الأنسجة العصبية ؛ انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الحاجة.
  4. تحضير 1x الفوسفات المخزن الملحي (1x PBS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم ووضعها على الجليد. تحضير وسط الثقافة الأساسية عن طريق إضافة 5 مل من البنسلين الستربتومايسين (التركيز النهائي ، 100 U / mL) ، و 5 مل من 45٪ D-glucose ، و 5 مل من ملحق الجلوتامين (التركيز النهائي 2 mM ؛ انظر جدول المواد) إلى 485 مل من DMEM / F12. الوسط الأساسي مستقر عند 4 درجات مئوية لمدة 4 أسابيع.
  5. تحضير وسط زراعة الخلايا النجمية عن طريق إضافة 1 مل من مكمل B27 و 5 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) إلى 44 مل من وسط الاستزراع الأساسي. تكملة الوسط مع عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) (10 نانوغرام / مل لكل منهما). أضف EGF و bFGF قبل الاستخدام مباشرة إلى الكمية المناسبة من الوسط.
  6. لتشريح أنسجة الحبل الشوكي ، استخدم زوجا من الملقط الكبير مع طرف منحني ، وزوجا من الملقط الصغير مع طرف منحني ، وزوجا واحدا من الملقط الصغير ، وزوجا من المقصات الصغيرة ، وملعقة صغيرة.

2. عزل الخلايا النجمية

  1. عزل الخلايا النجمية عن الحبل الشوكي للفئران بعد الولادة لإجراء إعادة برمجتها المباشرة إلى خلايا عصبية وظيفية (الشكل 1A). لهذا البروتوكول ، اجمع أنسجة الحبل الشوكي من الفئران في اليوم 2-3 بعد الولادة. جمع ستة إلى ثمانية من الحبل الشوكي لعزل الخلايا النجمية. استخدم هذا البروتوكول نفسه لعزل الخلايا النجمية عن مناطق أخرى من الجهاز العصبي ، مثل القشرة الدماغية والدماغ المتوسط والمخيخ. بالنسبة لهذه المناطق، احصلي على الخلايا بعد خمسة إلى سبعة أيام من الولادة.
    ملاحظة: عند استهداف عزل الخلايا النجمية عن المناطق غير المذكورة في هذا البروتوكول ، يجب تحديد العمر والمواد المدخلة تجريبيا.

3. تشريح أنسجة الحبل الشوكي

ملاحظة: يمكن إجراء تشريح الأنسجة خارج خزانة السلامة البيولوجية.

  1. التضحية بالفئران في P2-P3 عن طريق قطع الرأس دون تخدير الحيوان. ضع الجذع في طبق بتري 35 مم واحفظه على الثلج.
  2. افتح الجلد بالمقص ، وأزل الفقرة بمقص صغير ، واستخرج الحبل الشوكي ، وضعه في مخزن تشريح مؤقت على الجليد. تحت مجهر التشريح التجسيمي مع تكبير 2x ، قم بإزالة السحايا من الحبل الشوكي المعزول باستخدام ملقط ونقل أنسجة الحبل الشوكي التي تم تشريحها وتنظيفها إلى أنبوب C.

4. فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS)

  1. أضف 50 ميكرولتر من إنزيم P من مجموعة تفكك الأنسجة العصبية (انظر جدول المواد) و 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيمات المحضر مسبقا إلى كل أنبوب C. قم بعكس الأنابيب C ووضعها على جهاز فصل ساخن (انظر جدول المواد) ، مع التأكد من جمع جميع الأنسجة في غطاء الأنبوب.
  2. قم بتشغيل برنامج التفكك 37_NTDK_1 مع وقت تشغيل يبلغ حوالي 22 دقيقة. قبل وقت قصير من نهاية البرنامج ، ضع مصفاة 70 ميكرومتر (انظر جدول المواد) على عدد من أنابيب 15 مل تساوي عدد الأنابيب C المستخدمة وقم بترطيب المصفاة مسبقا ب 2 مل من PBS البارد المثلج. قم بتخزين 1x PBS على الجليد أثناء إجراء MACS بأكمله.
  3. بعد الانتهاء من البرنامج ، قم بإزالة أنابيب C وقم بطردها مركزيا لفترة وجيزة لجمع الأنسجة في الجزء السفلي من الأنابيب. انقل الأنسجة المنفصلة من الأنابيب C إلى أنابيب 15 مل المحضرة عن طريق تمريرها عبر المصفاة. اترك المصفاة على أنابيب 15 مل.
  4. شطف C-tube مع 10 مل من 1x PBS لجمع الأنسجة المتبقية وجمعها في نفس الأنبوب 15 مل عن طريق المرور عبر المصفاة مرة أخرى. جهاز طرد مركزي لأنابيب 15 مل التي تحتوي على أنسجة منفصلة عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قم بتبريد جهاز الطرد المركزي حتى 4 درجات مئوية بعد هذه الخطوة.
  5. إزالة supernatant دون إزعاج بيليه الخلية قبل تعليق الخلايا في 80 ميكرولتر من 1x PBS ؛ أضف 10 ميكرولتر من كاشف الحجب من مجموعة MicroBead المضادة للماوس ACSA-2 (انظر جدول المواد). اخلطي بلطف عن طريق السحب.
  6. تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام (الثلاجة). أضف 10 ميكرولتر من الميكروبيدات المقترنة بمستضد سطح الخلايا النجمية المضادة للخلايا النجمية 2 (انظر جدول المواد) واخلطها بلطف عن طريق السحب. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
  7. اغسل الخلايا عن طريق إضافة 3 مل من 1x PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أثناء الطرد المركزي، قم بتجميع فاصل مغناطيسي (انظر جدول المواد) عن طريق وضع العدد المناسب من أعمدة الفرز المغناطيسي (انظر جدول المواد) على الفاصل مع أنبوب تجميع 15 مل تحته. شطف الأعمدة مع 500 ميكرولتر من 1x PBS.
  8. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من 1x PBS قبل نقل معلقات الخلايا إلى الأعمدة المغناطيسية. دع التصريف بواسطة الجاذبية. اغسل الأنابيب سعة 15 مل ب 500 ميكرولتر من 1x PBS وطبقها على العمود. اغسل الأعمدة ب 500 ميكرولتر من 1x PBS لغسلتين إضافيتين.
  9. خلايا العذاب عن طريق إزالة العمود من الفاصل ، وإضافة 800 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا النجمية ودفع الخلايا خارج العمود باستخدام المكبس المضمن.
  10. خلايا الصفائح في قوارير الاستزراع المعدة مسبقا عن طريق إضافة 4.2 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية مع مكملات EGF و bFGF والاستزراع عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    ملاحظة: قوارير زراعة الطلاء ليست ضرورية للخلايا النجمية المعزولة عن مناطق الدماغ الأخرى ولكنها توفر ركيزة أفضل للخلايا النجمية المعزولة من الحبل الشوكي.
  11. خلايا الزراعة لمدة 7 أيام تقريبا حتى الالتقاء (80٪ -90٪). إذا لم تلتق الخلايا بعد 7 أيام ، فانتظر حتى 10 أيام قبل طلائها. بعد 10 أيام ، لا تتكاثر الخلايا بعد الآن ، وتنخفض كفاءة إعادة البرمجة.

5. بذر الخلايا النجمية لإعادة البرمجة

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية تحت خزانة السلامة البيولوجية مع مستوى السلامة 1 (SL1).

  1. قم بإعداد لوحات 24 بئرا مع أغطية زجاجية مغلفة بالبولي دي ليسين بنفس الطريقة التي تم بها إعداد قوارير الثقافة سابقا. لتحديد عدد الصفائح اللازمة ، ضع في اعتبارك أن الخلايا النجمية مطلية بكثافة 5-5.5 × 104 خلايا لكل بئر في صفيحة 24 بئرا. عادة ، يؤدي عزل ستة حبال شوكية من الفئران P2 إلى إنتاج حوالي 1 × 106 خلايا.
  2. استنشق الوسائط من قوارير ثقافة T25 التي تحتوي على الخلايا النجمية المستزرعة واغسلها مرة واحدة باستخدام 1x PBS. افصل الخلايا النجمية عن قارورة الاستزراع بإضافة 0.5 مل من 0.05٪ Trypsin / EDTA واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. اضغط برفق على جانب القارورة لإطلاق الخلايا من سطح قارورة المزرعة وتحقق من الانفصال تحت المجهر الساطع باستخدام تكبير 10X.
  3. توقف عن التربسين باستخدام 2.5 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية وجمع تعليق الخلية في أنابيب 15 مل. جهاز طرد مركزي في 300 × g لمدة 5 دقائق ، وشفط supernatant ، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية. احسب تركيز الخلية باستخدام مقياس خلايا الدم أو نظام عد الخلايا الآلي.
  4. بناء على عدد الخلايا ، قم بتخفيف تعليق الخلية بوسط الخلايا النجمية الطازج للحصول على محلول 1-1.1 × 105 خلايا لكل مل. استكمل الوسط ب EGF و bFGF بمعدل 10 نانوغرام / مل لكل عامل. أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلايا ، أي ما يعادل 5-5.5 × 104 خلايا ، إلى كل بئر من لوحات 24 بئرا المعدة مسبقا وخلايا الزراعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

6. التعبير القسري عن عوامل النسخ

ملاحظة: قبل الشروع في البروتوكول ، من الضروري تصميم التجربة بشكل صحيح. على وجه الخصوص ، من المهم دائما تضمين عنصر تحكم سلبي لإعادة البرمجة ، وهو شرط لا يتم فيه التعبير عن أي عامل إعادة برمجة. على سبيل المثال ، عند استخدام ناقلات تحمل cDNA لعامل إعادة البرمجة ومراسل (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، DsRed) ، يتم تمثيل التحكم السلبي بنفس الناقل الذي يحمل المورد فقط. عند التعبير عن عوامل متعددة تحمل مراسلين مختلفين ، يجب تعديل التحكم السلبي وفقا لذلك.

  1. في اليوم التالي للطلاء ، افحص الألواح المكونة من 24 بئرا للتأكد من التصاق الخلايا بأغطية العلاء.
  2. واستنادا إلى الهدف التجريبي والموارد المتاحة، يمكن تحقيق التعبير القسري عن عوامل إعادة البرمجة عن طريق النقل الفيروسي (انظر الخطوة 6-3) أو نقل الحمض النووي (انظر الخطوة 6-4).
    ملاحظة: يتطلب استخدام الفيروس الرجعي أو الفيروس اللينتيري موافقة السلطات الحكومية ويجب أن يتم ذلك تحت خزانة السلامة البيولوجية داخل المختبر بمستوى الأمان 2 (SL2).
  3. إعادة برمجة الخلايا النجمية عن طريق نقل الخلايا مع الفيروس القهقري أو lentivirus الذي يحمل المعلومات الجينية للتعبير عن عامل (عوامل) إعادة البرمجة ذات الأهمية كما هو موضح أدناه.
    1. قم بتحويل الخلايا ذات عيار الفيروسات العالي من 1 × 10 10-1 ×10 12 جسيمات / مل عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من تعليق الخلية مباشرة إلى وسط الخلايا النجمية. وهذا يضمن ارتفاع معدل الإصابة. استزرع الخلايا ذات وسط الخلايا النجمية التي تحتوي على جزيئات فيروسية عند 37 درجة مئوية لمدة 24-36 ساعة قبل المتابعة إلى القسم 7 أو القسم 8 ، اعتمادا على الغرض من التجربة.
      ملاحظة: يمكن استخدام مروجين مختلفين لدفع التعبير عن الجينات المحورة (انظر أيضا النتائج التمثيلية). المروجون التأسيسيون (على سبيل المثال ، CMV ، CAG) يحرضون على التعبير عن الجين المتحول في وقت أبكر من المروجين المستحثين ؛ ومع ذلك ، فقد تم استخدام كلا النوعين من أنواع المروجين بنجاح لإعادة برمجة الخلايا إلى خلايا عصبية.
  4. يمكن أيضا إدخال بلازميدات الحمض النووي في الخلايا النجمية عن طريق نقل الحمض النووي كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يمكن القيام بذلك بموجب خزانة السلامة البيولوجية المعتمدة ل SL1.
    1. قبل النقل، احصل على كاشف النقل، وهو الحمض النووي البلازميدي للتركيبات المطلوبة، ووسط الخلايا النجمية الطازج، والوسط المختزل بالمصل (انظر جدول المواد). احسب الكمية المطلوبة من الوسط المختزل بالمصل (انظر جدول المواد) من خلال مراعاة أن كل بئر من صفيحة 24 بئرا تتطلب 300 ميكرولتر من الوسط المختزل بالمصل. أضف الكمية المناسبة من الوسط المختزل بالمصل إلى أنبوب 50 مل وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
    2. عندما يكون الوسط المختزل بالمصل دافئا ، قم بشفط وسط الخلايا النجمية من جميع الآبار وجمعها في أنبوب 50 مل. قم بتصفية وسط الخلايا النجمية الذي تم جمعه باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر لإزالة الخلايا المنفصلة.
    3. أضف حجما متساويا من وسط الخلايا النجمية الطازج إلى الوسط المصفى للحصول على محلول يكفي لإضافة 1 مل من وسط الخلايا النجمية لكل بئر. حافظ على الوسط المشروط للخلايا النجمية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام (الخطوة 6.4.9).
      ملاحظة: يتم إعادة استخدام وسيط الثقافة لأنه يحتوي على العديد من العوامل المفرزة التي تدعم بقاء الثقافة.
    4. أضف 300 ميكرولتر من الوسط المختزل بالمصل المسخن مسبقا إلى كل بئر وضع الصفيحة المكونة من 24 بئرا مرة أخرى إلى الحاضنة.
    5. تحضير الحل A ، الذي يتكون من الحمض النووي ووسط المصل المختزل. لكل بئر ، استخدم ما مجموعه 0.6 ميكروغرام من الحمض النووي وأضفه إلى 50 ميكرولتر من الوسط المختزل بالمصل. قم بتخزين الحل A في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
      ملاحظة: عادة ما يتم النظر في ثلاثة أضعاف فنية لكل شرط. لذلك ، يتم تحضير مزيج يكفي لتفاعل 3.5 (على سبيل المثال ، 2.1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي المخفف في 175 ميكرولتر من الوسط المختزل بالمصل) لضمان وجود مادة كافية لنقل ثلاثة آبار من صفيحة 24 بئرا.
    6. تحضير المحلول B ، الذي يتكون من كاشف النقل والوسط المختزل بالمصل. لكل بئر ، أضف 0.75 ميكرولتر من كاشف النقل إلى 50 ميكرولتر من الوسط المختزل بالمصل. نظرا لأن هذا الحل شائع في جميع ظروف النقل ، فقم بإعداده بكميات كبيرة لتقليل التباين عبر عمليات النقل.
    7. احتضان الحل B في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أضف الحل B إلى المحلول A قطرة بقطرة بنسبة 1: 1 واخلطه برفق. لا دوامة. احتضان الحل A + B لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء المحرك.
    8. كرر الخطوة 6.4.5-6.4.7 لكافة شروط النقل. بعد 20-30 دقيقة ، أضف المحلول A + B إلى كل قطرة بئر قطرة للحصول على حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر.
    9. بعد 4 ساعات ، قم بإزالة وسط النقل وإضافة 1 مل من الوسط المشروط للخلايا النجمية المسخن مسبقا والمحضر في الخطوة 6.4.3. حافظ على الخلايا لمدة 36-48 ساعة قبل المتابعة في القسم 7 أو القسم 8 ، اعتمادا على الغرض من التجربة.

7. إعادة برمجة الخلايا النجمية (تحليل 7 أيام)

  1. تحضير وسط التمايز العصبي عن طريق إضافة 1 مل من ملحق B27 إلى 49 مل من وسط الثقافة الأساسية (انظر الخطوة 1.4). بعد 24-48 ساعة ، اعتمادا على ما إذا كانت الخلايا قد تم نقلها أو نقلها (انظر الخطوتين 6.3 و 6.4 ، على التوالي) ، استبدل وسط الخلايا النجمية ب 1 مل من وسط التمايز العصبي لكل بئر وخلايا الزراعة عند 37 درجة مئوية و 9٪ CO2.
    ملاحظة: يمكن أيضا الاحتفاظ بالخلايا عند 5٪ CO 2 إذا لم تتوفر حاضنة CO2 بنسبة 9٪. ومع ذلك ، فإن إعادة برمجة الخلايا العصبية أكثر كفاءة في ظل هذه الظروف.
  2. اختياري: لزيادة كفاءة إعادة البرمجة ، استكمل وسط التمايز العصبي مع Forskolin (التركيز النهائي ل 30 ميكرومتر) و Dorsomorphin (التركيز النهائي ل 1 ميكرومتر) عند استبدال وسط الخلايا النجمية إلى وسط التمايز. عند اختيار علاج الخلايا مع Forskolin و Dorsomorphin ، قم بتوفير جرعة ثانية من Dorsomorphin بعد 2 أيام من العلاج الأولي. أضف هذا العلاج الثاني مباشرة إلى وسط الثقافة.
  3. عادة ما تحدث إعادة البرمجة المباشرة للخلايا النجمية الفئرانية إلى خلايا عصبية في غضون 7 أيام بعد تغيير الوسط. وبالتالي ، بعد 7 أيام من بدء إعادة برمجة الخلايا العصبية ، قم بإصلاح أو جمع الخلايا لتحليلها في المراحل النهائية.

8. إعادة برمجة الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية ناضجة (ثقافات طويلة الأجل)

  1. تحضير وسط التمايز العصبي عن طريق إضافة 1 مل من ملحق B27 إلى 49 مل من وسط الثقافة الأساسية (انظر الخطوة 1.4). بعد 24-48 ساعة ، اعتمادا على ما إذا كانت الخلايا قد تم نقلها أو نقلها (انظر الخطوتين 6.3 و 6.4 ، على التوالي) ، استبدل وسط الخلايا النجمية ب 1 مل من وسط التمايز العصبي المكمل ب Forskolin (التركيز النهائي ل 30 ميكرومتر) و Dorsomorphin (التركيز النهائي ل 1 ميكرومتر) لكل بئر وخلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية و 9٪ CO2.
    ملاحظة: يمكن أيضا الاحتفاظ بالخلايا عند 5٪ CO 2 إذا لم تتوفر حاضنة CO2 بنسبة 9٪. ومع ذلك ، فإن إعادة برمجة الخلايا العصبية أكثر كفاءة في ظل هذه الظروف.
  2. كرر علاج دورسومورمفين بعد 2 أيام من العلاج الأولي عن طريق إضافته مباشرة إلى وسط التمايز العصبي.
  3. بعد 7 أيام من بداية إعادة برمجة الخلايا العصبية ، قم بإعداد وسط النضج بإضافة 6 ميكرولتر من N2 ، و 1.2 ميكرولتر من NT3 (المخزون 20 ميكروغرام / مل) ، و 1.2 ميكرولتر من BDNF (المخزون 20 ميكروغرام / مل) ، و 1.2 ميكرولتر من GDNF (المخزون 20 ميكروغرام / مل) ، و 1.2 ميكرولتر من cAMP (المخزون 100 ملليمتر) إلى 189.2 ميكرولتر من وسط التمايز العصبي. تكملة وسط التمايز العصبي الموجود في كل بئر مع 200 ميكرولتر من وسط النضج.
    ملاحظة: يتم استكمال وسط النضج فقط للعلاج الأول. تتم جميع العلاجات اللاحقة عن طريق استبدال جزئي لوسط التمايز العصبي كما هو موضح أدناه.
  4. كرر العلاج بجزيئات صغيرة عن طريق إزالة 200 ميكرولتر من وسط التمايز العصبي وإضافة 200 ميكرولتر من وسط النضج الطازج مرتين في الأسبوع لمدة تصل إلى 6 أسابيع. أثناء النضج ، استخدم الخلايا للتجارب الكهروفسيولوجية (عادة ، في اليوم 21 أو في وقت لاحق) أو إصلاح للتحليل النهائي (على سبيل المثال ، التألق المناعي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عادة ما تصل الثقافات الأولية للخلايا النجمية إلى 80٪ -90٪ من الالتقاء بين 7 إلى 10 أيام بعد فرز وطلاء MAC (الشكل 1B). بشكل عام ، تنتج قارورة واحدة من ثقافة T25 حوالي 1-1.5 × 106 خلايا ، وهو ما يكفي ل 20-30 غطاء عند بذر الخلايا بكثافة 5-5.5 × 104 خلايا لكل بئر. في اليوم التالي للطلاء ، تغطي الخلايا عادة 50٪ -60٪ من سطح الغطاء (الشكل 1C). في هذه المرحلة ، تتكون الثقافات بشكل حصري تقريبا من الخلايا النجمية ، في حين أن أنواع الخلايا الأخرى ، مث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الثقافات الأولية للخلايا النجمية الفئران هي نظام نموذج رائع في المختبر لدراسة إعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة. في الواقع ، على الرغم من عزلها في مرحلة ما بعد الولادة ، تعبر الخلايا عن علامات الخلايا النجمية النموذجية 29 ، وتحتفظ بالتعبير عن الجينات النمطية 28,29 ، وتحافظ على القدرة على التكاثر ، على غرار الخلايا النجمية في الجسم الحي في سن مماثلة 38. بعد العزل بوساطة MACS، تلتصق الخلايا أولا ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نود أن نشكر إينيس مولهان على استنساخ التركيبات لإعادة برمجتها، وبولينا شليبيك على الإنتاج الفيروسي، وماجدالينا غوتز وجوديث فيشر-ستيرنجاك على تعليقاتهما على المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ Trypsin / EDTALife Technologies25300054
4 '، 6-Diamidino-2-phenyindole، dilactate (DAPI)Sigma-AldrichD9564
المضادة للفأر IgG1 Alexa 647Thermo FisherA21240
المضادة للفأر IgG1 BiotinSouthernbiotechCat # 1070-08 ؛ RRID: AB_2794413
مضاد للفأر IgG2b Alexa 488Thermo FisherA21121
مضاد للأرانب Alexa 546Thermo FisherA11010
Aqua Poly / MountPolysciencesCat # 18606-20
B27Supplement LifeTechnologies 17504044
BDNFPeprotech450-02
bFGFلايف تكنولوجيز13256029
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما ألدريتشكات # A9418
cAMPسيجما ألدريتشD0260
C-TubesMiltenyi Biotec130-093-237
DMEM / F12Life Technologies21331020
DorsomorphinSigma AldrichP5499
EGFLife TechnologiesPHG0311
مصل الأبقار الجنينPAN BiotechP30-3302
ForskolinSigma AldrichF6886
GDNFPeprotech450-10
gentleMACS Octo DissociatorMiltenyi Biotec130-096-427
GFAPDakoCat # Z0334 ؛ RRID: AB_100013482
GlucoseSigma AldrichG8769
GlutaMaxLife Technologies35050038
HBSSLife Technologies14025050
HepesLife Technologies15630056
Lipofectamine 2000 (كاشف التعداد)Thermo FisherCat # 11668019
MACS SmartStrainer 70 & micro; mMiltenyi Biotec130-098-462
MiniMACS SeperatorMiltenyi Biotec130-042-102
Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit  Miltenyi Biotec130-097-678
Mouse IgG1 anti-synaptophysin 1Synaptic SystemsCat # 101 011 RRID: AB_887824)
Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (& beta ؛ III-الحوض)أعمدة Sigma AldrichT8660
MSMiltenyi Biotec130-042-201
N2Supplement Life Technologies17502048
مجموعة تفكك الأنسجة العصبية   ؛Miltenyi Biotec130-092-628
NT3Peprotech450-03
octoMACS فاصلMiltenyi Biotec130-042-109
OptiMEM & ndash ؛ GlutaMAX (وسط مختزل بالمصل)Thermo FisherCat # 51985-026
Penicillin / StreptomycinLife Technologies15140122
Poly-D-LysineSigma AldrichP1149
Rabbit anti-RFPRocklandCat # 600-401-379 ؛ RRID: AB_2209751
أرنب مضاد ل Sox9Sigma-AldrichCat # AB5535 ؛ RRID: AB_2239761
ستربتافيدين أليكسا 405ثيرمو فيشركات # S32351
تريتون X-100سيجما ألدريتشكات # T9284

المراجع

  1. Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014(2020).
  2. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  3. Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
  4. Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
  5. Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
  6. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  7. Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6(2018).
  8. Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
  9. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
  10. Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29(2017).
  11. Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
  12. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  13. Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
  14. Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
  15. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373(2010).
  16. Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
  17. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
  18. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  19. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  20. Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  21. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  22. Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
  23. Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697(2017).
  24. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  25. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220(2020).
  26. Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
  27. Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532(2021).
  28. Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
  29. Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409(2021).
  30. Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
  31. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
  32. Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
  33. Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
  34. Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
  35. Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
  36. Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
  37. Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
  38. Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
  39. Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
  40. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
  41. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل وإعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة للخلايا النجمية للفئران
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.