يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مسبار β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة الفلورية الحمراء البعيدة لتحديد وإثراء الخلايا السرطانية الهرمة عن طريق قياس التدفق الخلوي

5.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64176

⸱

سبتمبر 13, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول للقياس الكمي الفلوري والتدفق الخلوي للخلايا السرطانية الهرمة التي تسببها أدوية العلاج الكيميائي في زراعة الخلايا أو في نماذج أورام الفئران. تشمل الإجراءات الاختيارية التلطيخ المناعي المشترك ، وتثبيت العينات لتسهيل تحليل الدفعة الكبيرة أو النقطة الزمنية ، وإثراء الخلايا الهرمة القابلة للحياة عن طريق الفرز الخلوي للتدفق.

الملخص

الشيخوخة الخلوية هي حالة من التوقف التكاثري الناجم عن الضرر البيولوجي الذي يتراكم عادة على مدى سنوات في الخلايا المتقدمة في السن ولكنه قد يظهر أيضا بسرعة في الخلايا السرطانية كرد فعل على الضرر الناجم عن علاجات السرطان المختلفة. تعتبر شيخوخة الخلايا السرطانية بشكل عام غير مرغوب فيها ، حيث تصبح الخلايا الهرمة مقاومة للموت وتمنع مغفرة الورم مع تفاقم الورم الخبيث ومقاومة العلاج. لذلك ، فإن تحديد الخلايا السرطانية الهرمة له أهمية مستمرة لمجتمع أبحاث السرطان. توجد فحوصات شيخوخة مختلفة ، يعتمد الكثير منها على نشاط علامة الشيخوخة المعروفة ، بيتا غالاكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة (SA-β-Gal).

عادة ، يتم إجراء اختبار SA-β-Gal باستخدام ركيزة كروموجينية (X-Gal) على الخلايا الثابتة ، مع التعداد البطيء والذاتي للخلايا الهرمة "الزرقاء" بواسطة الفحص المجهري الضوئي. وقد مكنت المقايسات المحسنة باستخدام ركائز SA-β-Gal الفلورية نفاذة للخلايا، بما في ذلك C12-FDG (الأخضر) و DDAO-Galactoside (DDAOG؛ الأحمر الأقصى)، من تحليل الخلايا الحية وسمحت باستخدام منصات تحليل الفلورسنت عالية الإنتاجية، بما في ذلك مقاييس التدفق الخلوي. C12-FDG هو مسبار موثق جيدا ل SA-β-Gal ، لكن انبعاثاته الفلورية الخضراء تتداخل مع التألق الذاتي الخلوي الجوهري (AF) الذي ينشأ أثناء الشيخوخة بسبب تراكم مجاميع الليبوفوسين. من خلال استخدام مسبار SA-β-Gal الأحمر البعيد DDAOG ، يمكن استخدام التألق الذاتي الخلوي الأخضر كمعلمة ثانوية لتأكيد الشيخوخة ، مما يضيف موثوقية إلى الفحص. يمكن استخدام قنوات التألق المتبقية لتلطيخ صلاحية الخلية أو وضع العلامات المناعية الفلورية الاختيارية.

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، نوضح استخدام التألق الذاتي DDAOG و lipofuscin كاختبار ثنائي المعلمات لتحديد الخلايا السرطانية الهرمة. يتم إجراء تحديد النسبة المئوية للخلايا الهرمة القابلة للحياة. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تضمين خطوة مناعية اختيارية لتقييم مستضدات سطح الخلية ذات الأهمية. يمكن أيضا فرز الخلايا الهرمة المحددة وفرزها خلويا وجمعها لتحليلها في اتجاه مجرى النهر. يمكن تحليل الخلايا الهرمة المجمعة على الفور (على سبيل المثال ، للمقايسات المناعية أو "تحليل أوميكس") أو مزيد من الاستزراع.

المقدمة

تتراكم الخلايا الهرمة عادة في الكائنات الحية على مدى سنوات أثناء الشيخوخة البيولوجية الطبيعية ولكنها قد تتطور أيضا بسرعة في الخلايا السرطانية كرد فعل للضرر الناجم عن علاجات السرطان المختلفة ، بما في ذلك الإشعاع والعلاج الكيميائي. على الرغم من أنها لم تعد تتكاثر ، إلا أن الخلايا السرطانية الهرمة التي يسببها العلاج (TIS) قد تساهم في مقاومة العلاج وتدفع التكرار1،2،3. يمكن أن تؤدي العوامل التي تفرزها خلايا TIS إلى تفاقم الورم الخبيث عن طريق تعزيز التهرب المناعي أو ورم خبيث 4,5. تطور خلايا TIS أنماطا ظاهرية معقدة ومحددة السياق ، وملفات أيضية متغيرة ، واستجابات مناعية فريدة6،7،8. لذلك ، فإن تحديد وتوصيف الخلايا السرطانية TIS التي تسببها مناهج علاج السرطان المختلفة هو موضوع يحظى باهتمام مستمر لمجتمع أبحاث السرطان.

للكشف عن الخلايا السرطانية TIS ، تستخدم فحوصات الشيخوخة التقليدية على نطاق واسع ، وتعتمد بشكل أساسي على اكتشاف النشاط المتزايد لإنزيم علامة الشيخوخة ، بيتا غالاكتوزيداز GLB19 الليزوزومي. يسمح الكشف عند درجة حموضة ليزوزومية شبه محايدة (وليس حمضية) بالكشف المحدد عن بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة (SA-β-Gal)10. يستخدم اختبار SA-β-Gal القياسي الذي تم استخدامه لعدة عقود X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) ، وهو ركيزة بيتا غالاكتوزيداز زرقاء كروموجينية ، للكشف عن SA-β-Gal في الخلايا الثابتة عن طريق الفحص المجهريالضوئي 11. يسمح اختبار X-Gal بالتأكيد البصري النوعي لنظام TIS باستخدام الكواشف ومعدات المختبرات المتاحة بشكل شائع. المجهر الضوئي الأساسي المنقول هو الأجهزة الوحيدة المطلوبة لتقييم وجود الكروموجين الأزرق. ومع ذلك ، يمكن أن يفتقر إجراء تلطيخ X-Gal إلى الحساسية ، ويتطلب أحيانا أكثر من 24 ساعة حتى يتطور اللون. يتبع التلوين تسجيل ذاتي منخفض الإنتاجية للخلايا الهرمة الفردية بناء على حساب الخلايا التي تظهر مستوى معينا من شدة الكروموجين الأزرق تحت المجهر الضوئي. نظرا لأن X-Gal غير منفذ للخلية ، فإن هذا الفحص يتطلب خلايا ثابتة بالمذيبات ، والتي لا يمكن استردادها لتحليل المصب. عند العمل مع عينات محدودة من الحيوانات أو المرضى ، يمكن أن يكون هذا عيبا كبيرا.

مقايسات SA-β-Gal المحسنة باستخدام ركائز إنزيم فلورية منفذة للخلايا ، بما في ذلك C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside ، أخضر) و DDAOG (9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد-7-يل) β-D-Galactopyranoside ، أحمر بعيد) ظهرت سابقا في الأدبيات12،13،14،15. يتم عرض هيكل المسبار الكيميائي والخصائص البصرية ل DDAOG في الشكل التكميلي S1. تسمح هذه المجسات الخلوية بتحليل الخلايا الحية (بدلا من الخلايا الثابتة) ، وتسهل المجسات الفلورية بدلا من المجسات الكروموجينية استخدام منصات تحليل الفلورسنت السريعة عالية الإنتاجية ، بما في ذلك أدوات الفحص عالية المحتوى ومقاييس التدفق الخلوي. تمكن مقاييس التدفق الخلوي للفرز من استعادة المجموعات المخصبة من الخلايا الهرمة الحية من مزارع الخلايا أو الأورام لتحليلها في اتجاه مجرى النهر (على سبيل المثال ، النشاف الغربي ، ELISA ، أو "omics"). يوفر تحليل التألق أيضا إشارة كمية ، مما يسمح بتحديد أكثر دقة للنسبة المئوية للخلايا الهرمة داخل عينة معينة. يمكن بسهولة إضافة مجسات فلورية إضافية ، بما في ذلك مجسات الجدوى والأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور ، للتحليل المتعدد للأهداف خارج SA-β-Gal.

على غرار DDAOG ، C12-FDG هو مسبار فلوري ل SA-β-Gal ، لكن انبعاثه الفلوري الأخضر يتداخل مع AF الخلوي الجوهري ، والذي ينشأ أثناء الشيخوخة بسبب تراكم مجاميع الليبوفوسين في الخلايا16. من خلال استخدام مسبار DDAOG الأحمر البعيد ، يمكن استخدام التركيز البؤري التلقائي الخلوي الأخضر كمعلمة ثانوية لتأكيد الشيخوخة17. يعمل هذا على تحسين موثوقية الفحص باستخدام علامة ثانية بالإضافة إلى SA-β-Gal ، والتي غالبا ما تكون غير موثوقة كعلامة واحدة للشيخوخة18. نظرا لأن اكتشاف الرجفان الأذيني الداخلي في الخلايا الهرمة هو نهج خال من الملصقات ، فهو طريقة سريعة وبسيطة لتوسيع خصوصية الفحص المستند إلى DDAOG.

في هذا البروتوكول ، نوضح استخدام DDAOG و AF كاختبار سريع لقياس التدفق الخلوي ثنائي المعلمات لتحديد الخلايا السرطانية TIS القابلة للحياة من الثقافات المختبرية أو المعزولة عن الأورام المعالجة بالعقاقير الموجودة في الفئران (الشكل 1). يستخدم البروتوكول الفلوروفورات المتوافقة مع مجموعة واسعة من أجهزة تحليل وفرز التدفق الخلوي التجارية القياسية (الجدول 1). يتم تمكين تحديد النسبة المئوية للخلايا الهرمة القابلة للحياة باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي القياسي. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إجراء خطوة مناعية اختيارية لتقييم مستضدات سطح الخلية ذات الأهمية بالتزامن مع الشيخوخة. يمكن أيضا إثراء الخلايا الهرمة المحددة باستخدام منهجية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS).

figure-introduction-1
الشكل 1: سير العمل التجريبي. رسم تخطيطي يلخص النقاط الرئيسية لفحص DDAOG. (أ) يضاف دواء يحفز TIS إلى خلايا الثدييات المستزرعة أو يعطى للفئران الحاملة للورم. ثم يسمح الوقت لبداية TIS: للخلايا ، 4 أيام بعد العلاج. للفئران ، إجمالي 22 يوما ، مع ثلاثة علاجات كل 5 أيام بالإضافة إلى 7 أيام للتعافي. يتم حصاد الخلايا أو فصل الأورام إلى تعليق. (ب) تعامل العينات ب Baf لضبط الأس الهيدروجيني للجسيمات الليزوزومية للكشف عن SA-β-Gal لمدة 30 دقيقة ؛ بعد ذلك ، يتم إضافة مسبار DDAOG لمدة 60 دقيقة للكشف عن SA-β-Gal. يتم غسل العينات 2x في PBS ، ويتم إضافة بقعة صلاحية لفترة وجيزة (15 دقيقة). اختياريا ، يمكن تلطيخ العينات بالأجسام المضادة الفلورية في قنوات مضان مفتوحة و / أو ثابتة لتحليلها لاحقا. (ج) تحلل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي القياسي. يتم تصور الخلايا القابلة للحياة في مخططات نقطية تظهر DDAOG الأحمر (يشير إلى SA-β-Gal) مقابل التألق الذاتي الأخضر (lipofuscin). يتم إنشاء بوابة لتحديد النسبة المئوية لخلايا TIS بناء على عينات التحكم غير المعالجة (غير معروضة). إذا تم استخدام مقياس الفرز الخلوي (FACS) ، فيمكن جمع خلايا TIS ووضعها مرة أخرى في المزرعة لمزيد من المقايسات في المختبر أو تحليلها ومعالجتها لمقايسات البيولوجيا الجزيئية. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ TIS = الشيخوخة الناجمة عن العلاج ؛ FL-Ab = الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور ؛ باف = بافيلوميسين A1 ؛ SA-β-Gal = بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

فلوروفورالكشف عنالسابق/م (نانومتر)ليزر مقياس الخلايا (نانومتر)كاشف مقياس الخلايا / مرشح تمرير النطاق (نانومتر)
داوجSA-β-Gal645/6601640670 / 30
أ فليبوفوسين< 600488525 / 50
CV450صلاحيه408/450405450 / 50
بيهالجسم المضاد / علامة السطح565/578561582 / 15

الجدول 1: المواصفات البصرية للفلوروفورات ومقياس الخلايا. يتم سرد مواصفات مقياس الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول لجهاز يحتوي على ما مجموعه 4 ليزر و 15 كاشفا للانبعاثات. DDAOG المكتشف عند 645/660 نانومتر هو شكل المسبار المشقوق بواسطة SA-β-Gal1. يمكن أن يظهر DDAOG غير المشقوق مضانا منخفض المستوى عند 460/610 نانومتر ولكن يتم إزالته عن طريق خطوات الغسيل في البروتوكول. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ AF = التألق الذاتي ؛ PE = فيكوريثرين ؛ SA-β-Gal = بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في جامعة شيكاغو.

1. إعداد وتخزين حلول المخزون

ملاحظة: إذا كانت الخلايا سيتم فرزها بالتدفق ، فيجب تحضير جميع المحاليل باستخدام تقنيات معقمة وتصفيتها من خلال جهاز مرشح 0.22 ميكرومتر.

  1. تحضير محلول مخزون من DDAO-Galactoside عند 5 مجم / مل في DMSO. القسمة عند 50 ميكرولتر لكل أنبوب (أو الحجم المطلوب). يخزن في -20 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 1 سنة.
  2. تحضير محلول مخزون من Bafilomycin A1 عند 1 mM في DMSO. القسمة عند 50 ميكرولتر لكل أنبوب (أو الحجم المطلوب). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  3. تحضير محلول مخزون من Calcein Violet 450 AM عند 1 mM في DMSO. القسمة عند 50 ميكرولتر لكل أنبوب (أو الحجم المطلوب). يخزن في -20 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 1 سنة.
  4. لمعالجة الخلايا المستزرعة في المختبر ، قم بإعداد محاليل مخزون مركزة 10 مللي مول من عامل (عوامل) محفزة للشيخوخة في المذيب المناسب ، وقم بتعقيمها باستخدام مرشحات حقنة 0.2 ميكرومتر. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو حسب توجيهات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: لتوصيل عوامل العلاج الكيميائي المسببة للشيخوخة في الجسم الحي (للفئران المصابة بأورام راسخة) ، يجب أن تكون العوامل من درجة USP ومخففة إلى محلول ملحي من المخزون المركز قبل الحقن مباشرة.
  5. قم بإعداد وسيط استزراع كامل لخط (خطوط) الخلية المستخدمة.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، قم بإعداد وسيط لخلايا B16-F10 أو A549 مع DMEM 1x + 10٪ FBS + 1x بديل الجلوتامين + 1x البنسلين / الستربتومايسين. يجب أن تبقى وسائل الإعلام عقيمة. يمكن استخدام تركيبات وسائط أخرى خاصة بخط الخلية. قد تتداخل مكونات معينة مثل الجلوتاثيون ، في بعض الحالات ، مع بداية الشيخوخة. يجب إجراء اختبار تجريبي لتركيبات الوسائط المختلفة إذا كانت بداية الشيخوخة أقل من المتوقع أو لم يتم ملاحظتها مع عوامل العلاج الكيميائي الضابطة.
  6. إعداد تلطيخ وغسل المخازن المؤقتة.
    1. تحضير 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) في 1x PBS للاستخدام في إجراءات التلطيخ. قم بإذابة 2 جم من BSA في 200 مل من PBS وحركه لمدة 10 دقائق ، أو حتى يذوب تماما ، في درجة حرارة الغرفة.
    2. تحضير 0.5٪ BSA في 1x PBS كمخزن مؤقت للغسيل. قم بتخفيف 100 مل من 1٪ BSA المحضر في الخطوة 1.6.1 إلى 100 مل من 1x PBS ل 0.5٪ BSA.
    3. تخزين المخازن المؤقتة في 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر.
  7. تحضير 4 ٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS. استخدم أمبولات بارافورمالدهيد المختومة المتاحة تجاريا (على سبيل المثال ، 16٪ v / v) للراحة والاستقرار: 2.5 مل من 16٪ PFA + 7.5 مل من 1x PBS (= 10 مل من 4٪ PFA). اضبط الحجم المعد اعتمادا على الحجم الإجمالي المطلوب لكل تجربة.
    ملاحظة: التحضير حسب الحاجة لتثبيت الخلية فقط ؛ تحضير طازج في كل مرة.
  8. تحضير المخزن المؤقت لفرز FACS: 1x PBS ، 1 mM EDTA ، 25 mM HEPES ، 1٪ BSA (الرقم الهيدروجيني 7.2). مرشح معقم من خلال جهاز ترشيح 0.22 ميكرومتر وتخزينه في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
    ملاحظة: التحضير حسب الحاجة لفرز FACS فقط. وقد تختلف التركيبات العازلة لفرز التدفق باختلاف أجهزة نظام مراقبة الأصول الميدانية. تتوافق الصيغة أعلاه مع الأداة المستخدمة في هذه الدراسة (انظر جدول المواد). راجع إرشادات الشركة المصنعة.
  9. تحضير محلول تفكك الورم: 20 ميكروغرام / مل ليبراز TL + 100 ميكروغرام / مل DNAse I في وسائط RPMI-1640 (بدون FBS أو مكملات أخرى). تعد محاليل المخزون مفيدة للاحتفاظ ب Liberase TL (الذي يتم إعداده وتخزينه وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة) و DNAse I (100 مجم / مل في ماء مقطر مزدوج [ddH2O] ، مخزن في -20 درجة مئوية).
    ملاحظة: الاستعداد حسب الحاجة في حالة استخدام الأورام فقط ؛ تحضير طازج في كل مرة.

2. تحريض الشيخوخة بواسطة أدوية العلاج الكيميائي في الخلايا السرطانية المستزرعة

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات معالجة الخلايا في هذا القسم في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام ممارسات معقمة. تمت كتابة هذا القسم لأنواع الخلايا الملتصقة. يمكن استخدام خلايا التعليق مع التعديلات المناسبة كما هو مذكور.

  1. قم بزراعة خط (خطوط) الخلايا السرطانية وفقا للبروتوكول القياسي من المورد أو المختبر الذي قدم خط (خطوط) الخلايا المحددة المستخدمة.
    ملاحظة: يفضل عموما استخدام خلايا المرور المنخفض (p < 10) حيث ستكون هناك مستويات أقل من الشيخوخة المتماثلة ، أي الخلفية السفلية ، في عينات الخلايا غير المعالجة.
  2. قبل يوم واحد من تحريض الشيخوخة عن طريق الأدوية ، حصاد الخلايا مع التربسين-EDTA 0.25 ٪ (أو على النحو الموصى به). تحييد التربسين عن طريق إضافة حجم متساو من وسط الاستزراع الكامل ، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي معقم.
    ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية لخلايا التعليق.
  3. عد الخلايا باستخدام طريقة مقياس الدم القياسية وسجل الخلايا / مل. خلايا الصفيحة في 1 × 10 3-10 × 103 خلايا / سم2 في أطباق الاستزراع البلاستيكية القياسية المكونة من 6 آبار.
    ملاحظة: تعتمد كثافة الطلاء المثلى على معدل تكاثر الخلايا ويجب أن يحددها المستخدم. يجب أن تكون الخلايا في مرحلة نمو لوغاريتمية عند التقاء 10٪ -20٪ تقريبا في وقت العلاج (أي بعد حضانة 18-24 ساعة بعد الطلاء). يجب أن تكون كثافة البدء (الخلايا / مل) لخلايا التعليق محددة من قبل المستخدم. عادة ما تنتج الألواح المكونة من ستة آبار ما يكفي من الخلايا الهرمة لكل بئر لعينة تحليل التدفق الخلوي القياسية الواحدة. في حالة فرز التدفق ، يجب استخدام مساحة سطح أكبر بكثير (على سبيل المثال ، ألواح P150 متعددة) لتمكين استعادة أعداد كافية من الخلايا الهرمة للمقايسات النهائية (≥1 × 106).
  4. احتضان الخلايا المطلية طوال الليل (18-24 ساعة) في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ووعاء الرطوبة.
  5. عالج الخلايا المطلية بدواء (أدوية) العلاج الكيميائي المحفز للشيخوخة. قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي واحد على الأقل ، على سبيل المثال ، إيتوبوسيد (ETO) أو بليوميسين (BLM). إعداد آبار مكررة لكل دواء. قم بتضمين مجموعة واحدة تعامل مع السيارة فقط كعنصر تحكم.
    ملاحظة: يجب اختبار منحنى الجرعة لكل عامل تجريبي من قبل المستخدم لتحديد التركيز الأمثل لتحريض الشيخوخة في خط (خطوط) الخلية المستخدمة.
  6. احتضان الخلايا لمدة 4 أيام في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ووعاء رطوبة للسماح بظهور الشيخوخة. افحص يوميا التغيرات المورفولوجية المتوقعة باستخدام المجهر الضوئي.
    ملاحظة: قد تكون أوقات الحضانة من 3-5 أيام مقبولة اعتمادا على معدل بداية الشيخوخة. يمكن تغيير الوسائط وإعادة تطبيق العامل (أو لا) ، حسب الرغبة ، لتعزيز ظروف النمو الصحي مع تحقيق نسبة مقبولة من الخلايا الهرمة.
  7. بعد بداية الشيخوخة ، احصد الخلايا بإضافة التربسين-EDTA 0.25٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. عندما يتم فصل الخلايا إلى تعليق ، قم بتحييد التربسين بحجم متساو من الوسط الكامل.
    ملاحظة: هذه الخطوة ليست ضرورية للخلايا التي تنمو في التعليق. إذا تم إجراء تلطيخ علامة السطح ، فتجنب استخدام التربسين-EDTA لأنه يمكن أن يدمر المستضدات السطحية مؤقتا على الخلايا. بدلا من ذلك ، افصل الطبقة الأحادية برفق باستخدام مكشطة خلايا بلاستيكية معقمة (أو كاشف تفكك بديل مصمم للحفاظ على المستضدات السطحية).
  8. عد الخلايا في كل عينة باستخدام مقياس الدم. احسب الخلايا / مل لكل عينة.
    ملاحظة: يمكن إضافة Trypan blue لتقييم النسبة المئوية للخلايا الميتة في هذه المرحلة (أي بسبب العلاج الدوائي) ، ولكن سيتم أيضا تحديد موت الخلايا باستخدام صبغة الصلاحية الفلورية أثناء سير عمل تلطيخ DDAOG.
  9. القسمة ≥0.5 × 106 خلايا لكل عينة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل.
    ملاحظة: يجب توحيد عدد الخلايا لكل عينة عبر جميع العينات.
  10. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم في جهاز طرد مركزي دقيق عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف .
    ملاحظة: في حالة عدم توفر جهاز طرد مركزي دقيق مبرد ، فقد يكون من المقبول إجراء عمليات طرد مركزي في درجة حرارة محيطة لأنواع معينة من الخلايا المرنة.
  11. انتقل إلى تلطيخ DDAOG في القسم 4.

3. تحريض الشيخوخة عن طريق أدوية العلاج الكيميائي في الأورام التي أنشئت في الفئران

ملاحظة: إذا كانت الخلايا السرطانية سيتم فرزها بواسطة FACS ، فتأكد من العقم في كل خطوة من خلال العمل في خزانة السلامة الحيوية والعمل مع الأدوات والإجراءات والكواشف المعقمة.

  1. قم بإنشاء نماذج ورم الفئران عن طريق حقن الخلايا السرطانية تحت الجلد ، وفقا للطرق القياسية (على سبيل المثال ، Appelbe et al.19).
    ملاحظة: يجب تحسين عدد الخلايا السرطانية المراد حقنها وموقع الحقن وسلالة الماوس المناسبة لكل بروتوكول. هنا ، تم حقن خلايا B16-F10 تحت الجلد في 1 × 106 خلايا في 0.1 مل من المحلول الملحي (1 × 107 خلايا / مل).
    1. تحقق من أن صلاحية الخلايا التي تستخدم التريبان الأزرق هي >90٪ قبل إجراء الحقن. تخدير الفئران مع إيزوفلوران.
    2. تخدير إناث الفئران C57 / BL6 البالغة من العمر 6-7 أسابيع بمزيج من 3٪ إيزوفلوران والهواء والاحتفاظ بها في ظل هذه الظروف في غرفة تحريض موضوعة داخل خزانة سلامة حيوية معقمة. تأكد من التخدير عن طريق الضغط برفق على قدم الماوس. ضع مرهما بيطريا معقما على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء العملية. أثناء الإجراء ، حافظ على درجة حرارة جسم الماوس باستخدام مصباح التدفئة.
    3. من خلال العمل داخل خزانة معقمة للسلامة الحيوية ، قم بإزالة الماوس من غرفة الحث وضعه على اتصال بمخروط الأنف الذي يوفر إمدادا بنسبة 3٪ من الأيزوفلوران. احلق منطقة الخاصرة في موقع الحقن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية نظيفة. امزج معلق الخلية المحضر لفترة وجيزة عن طريق قلب الأنبوب يدويا قبل الحقن مباشرة ، وحقن معلق الخلية تحت الجلد في الجناح (الأجنحة) المحلوق باستخدام حقنة معقمة سعة 0.5 مل مزودة بإبرة معقمة 27 جم. أخرج الماوس من الغطاء وانقله إلى قفص الاسترداد.
    4. في قفص الاسترداد ، راقب العلامات الحيوية للفئران بشكل مستمر حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي ، وإظهار رد الفعل الصحيح ، وتكون قادرة على التحرك بأمان في القفص. لا تترك الفئران دون مراقبة أو تعيد الحيوانات التي خضعت لتلقيح الخلايا السرطانية إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى تتعافى تماما. مراقبة جميع الفئران الملقحة يوميا لفقدان الوزن ، وانخفاض النشاط / الحركة ، والأعراض العصبية ؛ القتل الرحيم الفئران التي تظهر عليها أعراض حادة في أي فئة. بالنسبة للفئران التي تظهر عليها أعراض الألم بعد التلقيح، يتم تطبيق البوبرينورفين (0.1-0.2 ملغ/كغ) مرة واحدة تحت الجلد.
      ملاحظة: يجب القتل الرحيم للفئران التي تظهر ألما مستمرا بعد البوبرينورفين.
  2. بدءا من 5-7 أيام بعد تلقيح الخلايا السرطانية ، قم بقياس نمو الورم باستخدام الفرجار كل 2-3 أيام. بدء العلاج prosenescent عندما يصل الورم إلى 50 مم 3 ± 10 مم3 في الحجم.
    ملاحظة: في هذا العمل، تم إعطاء جرعات من دوكسوروبيسين هيدروكلوريد (DOX) من الدرجة USP أو دوكسوروبيسين ليبوسومال (PLD) بمعدل 10 ملغم/كغم في حقن كلوريد الصوديوم 0.9٪ (USP). تم حقن الأدوية داخل الصفاق 3x ، مرة واحدة كل 5 أيام ، بدءا من الأورام التي وصلت إلى 50 مم 3 ± 10 مم3. تعافت الفئران لمدة 7 أيام بعد العلاج النهائي للسماح بظهور TIS في الأورام. يجب تحسين جرعات تحريض الشيخوخة وشروط العلاجات الأخرى و / أو نماذج الورم.
  3. في 7 أيام بعد العلاج الدوائي النهائي ، التضحية الفئران عن طريق جرعة زائدة من CO2 وخلع عنق الرحم أو غيرها من الطرق المعتمدة وفقا لإرشادات عمل المختبر. استئصال الأورام وجمعها في أنابيب معقمة أو ألواح ذات 6 آبار مملوءة بوسط نمو RPMI معقم (للحفاظ على الصلاحية أثناء المعالجة).
    ملاحظة: في حالة إجراء فحص نسيجي (على سبيل المثال ، X-Gal أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية) ، يمكن تقسيم الأورام هنا ، مع تجميد نصفها في O.C.T. تضمين الوسط والقطع بالتبريد باستخدام الإجراءات القياسية لأنسجة الأنسجة المجمدة. يجب أن ينتج نصف الورم المتبقي مادة وفيرة للتفكك وتلطيخ DDAUG.
  4. انقل ورما واحدا إلى طبق بلاستيكي P100 يحتوي على 5 مل من وسط RPMI. فرم الورم إلى قطع باستخدام مشرط.
  5. نقل 5 مل من تعليق قطع الورم التي تحتوي على خلايا معلقة وحطام إلى أنبوب مخروطي 15 مل. استخدم الطرف الأوسع لماصة مصلية سعة 25 مل لنقل هذا التعليق في حالة وجود حطام كبير. شطف الطبق مع حجم إضافي من RPMI معقمة لجمع المواد. قم بتغطية الأنبوب المخروطي ووضعه على الثلج.
  6. كرر الخطوات 3.45-3.5 للأورام المتبقية. استخدم صفيحة ومشرطا منفصلين لكل ورم لتجنب التلوث المتبادل ، أو اشطفه جيدا باستخدام PBS بين الأورام. استخدم 5 مل من الوسط الطازج لفرم كل ورم.
  7. تحضير محلول تفكك الورم: 20 ميكروغرام / مل ليبراز TL + 100 ميكروغرام / مل DNAse I في وسائط RPMI-1640 (بدون FBS).
    ملاحظة: توجد العديد من التركيبات الفعالة لحلول تفكك الورم ويمكن أن تشمل مجموعة متنوعة من الإنزيمات والمكونات الأخرى من مختلف الصانعين. يمكن أن تختلف التركيزات المثلى للمكونات اختلافا كبيرا عبر أنواع الأورام. إذا كانت خلايا الدم الحمراء موجودة بشكل كبير في الورم ، فقد يتم إجراء تحلل خلايا الدم الحمراء بشكل إضافي. إذا كانت الخلايا الميتة تمثل مشكلة ، فيمكن استخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة. يوصى بشدة للمستخدم بتحديد ظروف تفكك الورم المثلى بشكل مستقل والتي توفر قابلية عالية للحياة ووجودا منخفضا للخلايا الملوثة والمواد الضامة والحطام.
  8. أجهزة الطرد المركزي لجميع عينات الورم في أنابيب مخروطية لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم (4 درجات مئوية). إزالة طاف .
  9. أضف 1-5 مل من محلول تفكك الورم إلى كل عينة ورم ، اعتمادا على حجم مادة الورم. تأكد من وجود 1-2 مل زائدة عن حبيبات مادة الورم في الأنبوب. دوامة بسرعة معتدلة للخلط.
  10. ضع العينات في حاضنة 37 درجة مئوية مع دوران سريع لمدة 45 دقيقة. دوامة لفترة وجيزة كل 15 دقيقة.
  11. قم بتصفية كل عينة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. إذا كانت العينات لزجة جدا بحيث لا يمكن تمريرها عبر المرشح ، أضف 10 مل من وسيط RPMI-1640 لتخفيفه. شطف المرشحات مع وسيط RPMI لجمع الخلايا المتبقية.
  12. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا / مل لكل عينة.
  13. حاصل على نسختين أو أكثر من 5 × 106 خلايا لكل عينة ورم.
  14. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم (4 درجات مئوية). إزالة طاف .
  15. (اختياري) قم بحفظ عينات الورم بالتبريد لتلطيخ DDAOG لاحقا إذا رغبت في ذلك.
    1. أعد تعليق حبيبات الخلايا السرطانية المنفصلة في وسط الحفظ بالتبريد: 50٪ FBS ، 40٪ RPMI-1640 ، 10٪ DMSO ، محضرة في ظروف معقمة عند 5 × 106 خلايا / مل.
    2. حاصل 1 مل من معلق الخلية في كل كريوفيال.
    3. تجميد المبردات لمدة 24 ساعة في حاوية تجميد خلايا الأيزوبروبانول عند -80 درجة مئوية ؛ بعد ذلك ، انقله إلى التخزين بالتبريد للنيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل (>1 أسبوع).
    4. عندما يكون التلوين مطلوبا ، قم بإذابة الكريوفيال على الجليد وانتقل إلى تلطيخ DDAOG في القسم 4.
      ملاحظة: قد لا تظل بعض الأورام قابلة للحياة من خلال الحفظ بالتبريد ، ويجب تقييم المرونة لهذه العملية من قبل المستخدم لنموذج الورم محل الاهتمام.
  16. انتقل إلى القسم 4 لتلطيخ DDAOG.

4. تلطيخ DDAOG من SA-β-Gal في عينات الخلايا أو الأورام

  1. قم بتخفيف 1 مليمول من مرق بافيلوميسين A1 بمعدل 1:1,000x إلى وسط DMEM (بدون FBS) للحصول على تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر.
  2. أضف محلول Baf-DMEM المحضر إلى عينات حبيبات الخلايا (من الخطوة 2.11 أو الخطوة 3.16) لتركيز 1 × 106 خلايا / مل.
    ملاحظة: على سبيل المثال، في حالة استخدام 0.5 × 106 خلايا لكل عينة، أضف 0.5 مل من Baf-DMEM. بالنسبة للأورام ، يمكن تلطيخ 5 × 106 خلايا في 5 مل من Baf-DMEM.
  3. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (بدون ثاني أكسيد الكربون2) على دوار / شاكر مضبوط بسرعة بطيئة.
    ملاحظة: تجنب حاضنات CO2 لعملية التلوين ، والتي يمكن أن تحمض المحاليل وبالتالي تتداخل مع تلطيخ Baf و DDAOG.
  4. بدون غسيل ، أضف محلول مخزون DDAOG (5 مجم / مل) عند 1: 500x (10 ميكروغرام / مل نهائي) لكل عينة. ماصة للخلط. استبدل على دوار / شاكر عند 37 درجة مئوية (بدون ثاني أكسيد الكربون2) لمدة 60 دقيقة. يحفظ بعيدا عن الضوء المباشر.
  5. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف .
  6. يغسل مع 1 مل من الثلج البارد 0.5٪ BSA لكل أنبوب وماصة للخلط. قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية. كرر هذه الخطوة 2x لغسل الخلايا جيدا. إزالة الطافي والمتابعة.
    ملاحظة: من المهم تنفيذ خطوات الغسيل في الخطوة 4.6 لإزالة DDAOG غير المشقوق ، والذي يمكن أن يظهر انبعاثا مضانا غير مرغوب فيه (460/610 نانومتر).
    ملاحظة: في حالة التلوين المناعي لعلامات سطح الخلية، انتقل إلى القسم 5 أدناه.
  7. (اختياري) تثبيت وتخزين الخلايا الملطخة DDAOG لتحليلها لاحقا
    1. أضف 0.5 مل من الثلج البارد 4٪ بارافورمالدهيد قطرة قطرة إلى كل عينة مغسولة. ماصة للخلط.
    2. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. اغسل الخلايا 2x مع 1 مل من PBS.
    4. تخزين العينات لمدة تصل إلى 1 أسبوع في 4 °C قبل تحليل التدفق الخلوي.
      ملاحظة: بالنسبة للعينات الثابتة، تخطي الخطوة 4.8.
  8. تمييع مخزون Calcein Violet 450 AM (1 mM) عند 1: 1,000x إلى 1٪ BSA-PBS (1 ميكرومتر نهائي). أضف 300 ميكرولتر (لعينات الخلايا المستزرعة) أو 1000 ميكرولتر (لعينات الورم) إلى كريات الخلايا المغسولة من الخطوة 4.6. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام.
  9. انتقل إلى إعداد قياس التدفق الخلوي (القسم 6).

5. (اختياري) تلطيخ مناعي لعلامات سطح الخلية بالاشتراك مع DDAOG

ملاحظة: كما هو الحال مع أي تجربة لقياس التدفق الخلوي ، يجب إعداد عينات التحكم أحادية اللون مع DDAOG فقط والجسم المضاد الفلوري فقط لتحديد الحديث المتبادل (إن وجد) عبر قنوات التألق. إذا لوحظ الحديث المتبادل ، فيجب إجراء تعويض قياس التدفق الخلوي القياسي20.

  1. أعد تعليق كريات الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.6 في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ (1٪ BSA في 1x PBS).
  2. أضف كاشف حجب مستقبلات Fc المناسب لأنواع الخلايا (الفأر أو الإنسان) عند المعايرة بالتحليل الحجمي الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. احتضان لمدة 10 دقائق عند 24 درجة مئوية.
  3. أضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور عند المعايرة بالتحليل الحجمي الموصى بها من قبل الشركة المصنعة (أو التي يحددها المستخدم). احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد ، محمية من الضوء.
  4. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف .
  5. اغسل ب 1 مل من محلول الغسيل المثلج البارد (0.5٪ BSA-PBS) لكل أنبوب وماصة للخلط. قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية. كرر هذه الخطوة 2x لغسل الخلايا جيدا.
  6. قم بتخفيف 1 مللي متر من بنفسجي الكالسيين 450 صباحا الساعة 1:1000 مرة إلى 1٪ BSA-PBS. أضف 300 ميكرولتر إلى كريات الخلايا المغسولة من الخطوة 5.5. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام.
  7. انتقل إلى تحليل قياس التدفق الخلوي (الأقسام 6-7).

6. إعداد مقياس التدفق الخلوي والحصول على البيانات

  1. نقل عينات الخلية إلى أنابيب متوافقة مع أداة قياس التدفق الخلوي. ضع الأنابيب على الثلج واحتفظ بها محمية من الضوء.
    ملاحظة: إذا لوحظت الركام في معلقات الخلية، مرر المعلق عبر مصافي الخلايا 70-100 ميكرومتر قبل التحليل. لا تستخدم مصافي 40 ميكرومتر لأنها يمكن أن تستبعد بعض الخلايا الهرمة الأكبر.
  2. في البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد) ، افتح المؤامرات التالية: 1) مخطط نقطة FSC-A مقابل SSC-A ، 2) الرسم البياني للقناة البنفسجية ، 3) القناة الحمراء البعيدة (على سبيل المثال ، APC-A) مقابل القناة الخضراء (على سبيل المثال ، FITC-A) مخطط نقطة.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام مخططات الاستبعاد المزدوج والمدرج التكراري أحادي القناة ولكنها ليست مطلوبة بشكل صارم.
  3. بدء الحصول على بيانات مقياس الخلايا.
    1. ضع عينة التحكم في السيارة فقط الملطخة ب DDAOG على منفذ السحب. بسرعة دخول منخفضة ، ابدأ في الحصول على بيانات العينة.
    2. اضبط الفولتية FSC و SSC بحيث يتم احتواء >90٪ من الأحداث داخل المؤامرة. إذا كانت الخلايا لا تتناسب بشكل جيد مع قطعة الأرض ، فقم بخفض إعداد قياس المنطقة إلى 0.33-0.5 وحدة.
    3. قم بإزالة عينة السيارة فقط دون تسجيل البيانات.
    4. (اختياري) أضف قطرة واحدة من الكريات المجهرية لمعايرة قوس قزح إلى أنبوب مقياس الخلايا مع 1 مل من PBS. ضع الأنبوب على منفذ سحب مقياس الخلايا. البدء في الحصول على عينة من البيانات.
    5. اضبط فولتية القناة البنفسجية والخضراء والحمراء البعيدة بحيث تكون القمة العليا للكرة المجهرية قوس قزح في حدود 10 4-10 5 وحدات من التألق النسبي في كل قناة ويتم فصل جميع القمم جيدا في كل قناة. سجل 10000 حدث. قم بإزالة الأنبوب.
  4. ضع عينة التحكم الإيجابية (على سبيل المثال ، BLM ، ETO) ملطخة ب DDAOG على منفذ السحب. بسرعة منخفضة ، احصل على عينة من البيانات. راقب الأحداث في قنوات FSC و SSC والبنفسجي والأخضر والأحمر البعيد لضمان احتواء أكثر من 90٪ من الأحداث داخل جميع المؤامرات. ابحث عن زيادة في إشارة التركيز البؤري التلقائي و DDAOG مقابل التحكم في السيارة فقط.
  5. في حالة استخدام مقياس فرز خلوي ، ابدأ الفرز في هذه الخطوة.
    1. لأغراض حفظ السجلات ، سجل 10000 خلية لعينة التحكم وكل عينة تم فرزها.
    2. قم بفرز الكمية المطلوبة من الخلايا (عادة ما يكون ≥1 × 106 مناسبا) في أنبوب تجميع مناسب للأداة مع 3-5 مل من وسط الاستزراع.
    3. بعد الفرز ، انتقل إلى ثقافة أو تحليل المصب.
    4. انتقل إلى القسم 7 للتحليل الروتيني للعينات التي تم فرزها.
  6. في حالة استخدام الأجسام المضادة الفلورية ، قم بتحسين جهد القناة هنا باستخدام العينات غير الملوثة والمفردة والمزدوجة الملطخة المحضرة في القسم 5.
    ملاحظة: بالنسبة لمقياس التدفق الخلوي المعاير المستخدم هنا ، تنخفض الفولتية المثلى للقناة عادة بين 250 و 600 (متوسط المدى) ، لكن الفولتية المثلى ونطاقات جهد القناة ستختلف عبر الأجهزة. تجنب استخدام الفولتية في نطاقات منخفضة جدا أو عالية ، والتي قد تمنع الإشارة أو تضخم الضوضاء.
  7. بعد إكمال الخطوات 6.1-6.5 وإجراء تعديلات على إعدادات مقياس الخلايا حسب الضرورة، قم بتسجيل البيانات لجميع العينات. تأكد من أن الإعدادات تظل موحدة لجميع تسجيلات العينات. سجل ≥10000 حدث لكل عينة خلية مستزرعة أو ≥100000 حدث لكل عينة خلية ورمية.
    ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن إجراء البوابات والتحليل باستخدام برنامج الحصول على البيانات (على سبيل المثال ، FACSDiva) ، إلا أن سير عمل البوابات والتحليل الكامل الذي سيتم إجراؤه بعد الاستحواذ باستخدام برنامج تحليل منفصل (FlowJo) موصوف في القسم 7 أدناه. يفضل تحليل ما بعد الاستحواذ لتقليل الوقت في محطة عمل مقياس الخلايا والاستفادة من الأدوات الإضافية المضمنة في برنامج التحليل المخصص.
  8. احفظ عينة البيانات بتنسيق ملف .fcs. قم بتصدير الملفات إلى كمبيوتر محطة عمل مزود ببرنامج تحليل قياس التدفق الخلوي (على سبيل المثال ، FlowJo). انتقل إلى القسم 7.

7. تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يستخدم سير العمل المقدم برنامج FlowJo. يمكن استخدام برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي البديل إذا تم اتباع الخطوات الرئيسية الموضحة في هذا القسم بالمثل.

  1. باستخدام برنامج FlowJo، افتح ملفات بيانات .fcs من الخطوة 6.7.
  2. افتح نافذة التخطيط.
  3. اسحب جميع العينات وأفلتها في نافذة التخطيط.
  4. بوابة الخلايا القابلة للحياة.
    1. انقر نقرا مزدوجا أولا على عينة البيانات لعنصر التحكم في السيارة فقط لفتح نافذة البيانات الخاصة به.
    2. تصور البيانات كمدرج تكراري للقناة البنفسجية. حدد الخلايا القابلة للحياة الملطخة ب CV450 بناء على تألقها الأكثر إشراقا من الخلايا الميتة.
    3. ارسم بوابة باستخدام أداة الرسم البياني أحادي البوابة لتضمين الخلايا القابلة للحياة فقط. اسم البوابة قابلة للحياة.
    4. بعد ذلك ، من نافذة تخطيط العينة ، اسحب البوابة القابلة للحياة إلى عينات الخلايا الأخرى لتطبيق البوابة بشكل موحد.
    5. في نافذة التخطيط ، تصور جميع العينات كرسوم بيانية للقناة البنفسجية (الجدوى). تحقق من أن بوابة الخلايا القابلة للحياة مناسبة عبر العينات قبل المتابعة ؛ إذا لم يكن كذلك ، فقم بإجراء التعديلات حسب الحاجة.
      ملاحظة: يمكن أن يظهر تلطيخ الجدوى اختلافات عبر العلاجات أو الأورام.
  5. بوابة الخلايا الهرمة.
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق بيانات الخلية القابلة للتطبيق المسورة للتحكم في السيارة فقط لفتح نافذة البيانات الخاصة بها.
    2. تصور البيانات كمخطط نقطي للقناة الحمراء البعيدة (DDAOG) مقابل القناة الخضراء (AF).
    3. ارسم بوابة باستخدام أداة بوابة المستطيل لتضمين <5٪ من الخلايا التي هي DDAOG+ و AF + (الربع الأيمن العلوي). اسم البوابة الشيخوخة.
    4. بعد ذلك ، من نافذة تخطيط العينة ، اسحب بوابة الشيخوخة إلى المجموعات الفرعية القابلة للتطبيق لعينات الخلايا الأخرى لتطبيق البوابة بشكل موحد.
    5. في نافذة التخطيط ، اسحب وأفلت جميع المجموعات الفرعية للخلايا القابلة للتطبيق في القسم 7.4. تصور جميع العينات القابلة للحياة على أنها مخططات نقطية حمراء بعيدة (على سبيل المثال ، APC-A) مقابل قناة خضراء (على سبيل المثال ، FITC-A).
    6. تأكد من أن بوابة الشيخوخة المرسومة في الخطوة 7.5.3 مرئية على جميع قطع الأراضي وأن بوابة التحكم في السيارة فقط تظهر خلايا شيخوخة ≤5٪ -10٪.
  6. بمجرد تحديد النسبة المئوية للخلايا الهرمة باستخدام الخطوات المذكورة أعلاه ، قدم البيانات الناتجة باستخدام مخططات FlowJo ، ملخصة في جدول بيانات و / أو تم تحليلها إحصائيا باستخدام برنامج قياسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم إجراء العديد من التجارب لإثبات قابلية مقارنة DDAOG ب X-Gal و C12-FDG للكشف عن الشيخوخة بواسطة SA-β-Gal. أولا ، تم استخدام X-Gal لتلطيخ خلايا سرطان الجلد B16-F10 الهرمة التي يسببها ETO (الشكل 2 أ). تطور لون أزرق مكثف في مجموعة فرعية من الخلايا المعالجة ب ETO ، بينما أظهرت الخلايا الأخرى تلطيخا أزرق أقل كثافة. تم توسيع التشكل في معظم الخلايا المعالجة ب ETO. أظهر تلطيخ الخلايا المعالجة ب ETO باستخدام الركيزة الفلورية SA-β-Gal C12-FDG (أخضر) أو DDAOG (أحمر بعيد) أنماط تل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على مدى العقد الماضي أو نحو ذلك ، أصبح قياس التدفق الخلوي منصة فحص أكثر شيوعا في أبحاث السرطان بسبب الشعبية الناشئة لعلم المناعة السرطاني ، وتطوير مقاييس التدفق الخلوي منخفضة التكلفة ، وتحسين مرافق الأجهزة المشتركة في المؤسسات الأكاديمية. أصبحت المقايسات متعددة الألوان قياسية الآن ، حيث تم تجهيز معظم الأدوات الحديثة بمصفوفات بصرية بنفسجية وزرقاء وخضراء وحمراء إلى حمراء بعيدة. وبالتالي ، من المحتمل أن يكون بروتوكول DDAOG هذا متوافقا مع مجموعة واسعة من مقاييس التدفق الخلوي. بالطبع ، يجب تقييم أي مقياس تدفق خلوي من قبل المس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عن هذه الدراسة.

شكر وتقدير

نشكر المرفق الأساسي لقياس الخلايا والأجسام المضادة في جامعة شيكاغو على الدعم في أجهزة قياس التدفق الخلوي. قدم مركز أبحاث الحيوان في جامعة شيكاغو مساكن للحيوانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Bafilomycin A1Research Products InternationalB40500
Bleomycin sulfate كايمان13877
ألبومين مصل البقر (BSA)الولايات المتحدةالبيولوجية A1380
الكالسين البنفسجي 450 صباحا صبغة الجدوىThermoFisher Scientific65-0854-39eBioscience
DPP4 المضاد ، PE المترافقBiolegend137803استنساخ H194-112
خط الخلية: A549 سرطان الرئة البشري مجموعةالثقافة من النوع الأمريكيCCL-185
خط الخلية: B16-F10 سرطان الجلد بالفأرمجموعة الثقافة من النوع الأمريكيCRL-6475
مكشطة الخليةمصافي خليةCorning 3008
، 100 وميكرو ؛ مفالكون352360
DDAO-GalactosideLife TechnologiesD6488
DMEM medium 1xLife Technologies11960-069
DMSOSigmaD2438
DNAse ISigmaDN25
Doxorubicin ، حقن الهيدروكلوريد (USP)PfizerNDC 0069-3032-20
دوكسوروبيسين ، PEGylated الشحمية (USP)Sun PharmaceuticalNDC 47335-049-40
EDTA 0.5 MLife Technologies15575-038
Etoposide  كايمان12092
FBSأوميغا  كاشف حجب مستقبلات FB-11
Fc Biolegend101320الخلوي CD16 / 32 المضاد للفأر
(محلل الخلية)Becton Dickinson (BD) مقياسالخلويLSR FORTESSA
المختلف (فارز الخلايا)Becton Dickinson (BD)تقنياتFACSAria
GlutaMax 100xLifeالمختلفة 35050061
HEPES 1 MLonzaBW17737
Liberase TLSigma5401020001روش
بارافورمالدهيد 16٪علوم المجهر الإلكتروني15710
البنسلين / الستربتومايسين 100xLife Technologies15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1xCorningMT21031CVDulbecco's PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم)
جزيئات معايرة قوس قزح ، مجموعة فائقةSpheroTechUCRP-38-2K3.5-3.9 & micro ؛ م ، 2E6 / مل
RPMI-1640 متوسط 1xLife Technologies11875-119
كلوريد الصوديوم 0.9٪ (USP)Baxter HealthcareCorporation 2B1324
للحصول على بيانات مقياس الخلايا ، "FACSDiva" BectonDickinson (BD)n / aاتصل ب BD للحصول على
ترخيص برنامج لتحليل بيانات مقياس الخلايا ، "FlowJo" TreeStarn / aاتصل ب TreeStar للحصول على ترخيص
Trypsin-EDTA 0.25٪Life Technologies25200-114
مقياس التدفق التدفق برنامج

المراجع

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501(2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630(2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366(2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441(2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677(2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075(2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DDAOG
مسبار β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة الفلورية الحمراء البعيدة لتحديد وإثراء الخلايا السرطانية الهرمة عن طريق قياس التدفق الخلوي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.