مقالة منهجية

دراسة وظائف وأنشطة الناقل المشترك K-Cl العصبي KCC2 باستخدام النشاف الغربي

DOI:

10.3791/64179

⸱

ديسمبر 9, 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسلط البروتوكول الحالي الضوء على تطبيق تقنية النشاف الغربي لدراسة وظائف وأنشطة الناقل المشترك K-Cl العصبي KCC2. يصف البروتوكول التحقيق في فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز Thr906/1007 عبر النشاف الغربي. أيضا ، يتم تمييز طرق إضافية لتأكيد نشاط KCC2 لفترة وجيزة في هذا النص.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الناقلات المشتركة لكلوريد البوتاسيوم 2 (KCC2) هي عضو في عائلة حاملات المذاب 12 (SLC12) من الناقلات المشتركة لكلوريد الكاتيون (CCCs) ، الموجودة حصريا في الخلايا العصبية وهي ضرورية للتشغيل السليم لتوازن Cl وبالتالي تثبيط GABAergic الوظيفي. الفشل في التنظيم السليم ل KCC2 ضار وقد ارتبط بانتشار العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك الصرع. وقد أحرز تقدم كبير فيما يتعلق بفهم الآليات التي ينطوي عليها تنظيم نظام KCC2، المعتمد لتطوير التقنيات التي تمكن الباحثين من دراسة وظائفه وأنشطته؛ إما عن طريق التحقيقات المباشرة (تقييم فسفرة المواقع التنظيمية للكيناز) أو التحقيقات غير المباشرة (مراقبة ومراقبة نشاط GABA). هنا ، يسلط البروتوكول الضوء على كيفية التحقيق في فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز - Thr906 و Thr1007 - باستخدام تقنية النشاف الغربية. هناك طرق كلاسيكية أخرى تستخدم لقياس نشاط KCC2 مباشرة ، مثل أيون الروبيديوم ومقايسة امتصاص أيون الثاليوم. يتم استخدام تقنيات أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية المشبك لقياس نشاط GABA. ومن ثم ، تعكس بشكل غير مباشر KCC2 المنشط و / أو المعطل كما هو موضح في تقييم توازن أيون الكلوريد داخل الخلايا. ستتم مناقشة بعض هذه التقنيات الإضافية بإيجاز في هذه المخطوطة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الناقلات المشتركة لكلوريد البوتاسيوم 2 (KCC2) هي عضو في عائلة حاملات المذاب 12 (SLC12) من الناقلات المشتركة لكلوريد الكاتيون (CCCs) ، الموجودة حصريا في الخلايا العصبية وهي ضرورية للتشغيل السليم لتوازن Cl- وبالتالي تثبيط GABAergic الوظيفي1،2،3،4. إن الحفاظ على تركيز Cl- منخفض داخل الخلايا العصبية ([Cl-]i) عند 4-6 مللي متر بواسطة KCC2 يسهل γ-aminobutyric acid (GABA) / فرط استقطاب الجلايسين وتثبيط متشابك في الدماغ والحبل الشوكي5. ارتبط الفشل في التنظيم السليم ل KCC2 بانتشار العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك الصرع4. علاوة على ذلك ، فإن انخفاض قذف Cl− بوساطة KCC2 وضعف فرط استقطاب GABAA و / أو التيارات بوساطة مستقبلات الجلايسين متورطة في الصرع وآلام الأعصاب والتشنج 6,7. يتم تعديل الخلايا العصبية KCC2 بشكل سلبي عن طريق فسفرة المخلفات التنظيمية الرئيسية داخل المجال داخل الخلايا الطرفية C بواسطة مركب إشارات كيناز كيناز1 المرتبط بالبرولين / الألانين الغني بالألانين (SPAK) / المستجيب للإجهاد التأكسدي (OSR) 1 ، والذي يسهل الحفاظ على نشاط GABA غير المستقطب في الخلايا العصبية غير الناضجة2،8،9 . يقوم WNK-SPAK / OSR1 بفسفرة بقايا ثريونين 906 و 1007 (Thr906 / Thr1007) وبالتالي يقلل من تنظيم التعبير الجيني mRNA ل KCC2 ، مما يؤدي إلى تدهور لاحق في وظيفته الفسيولوجية 8,10. والأهم من ذلك ، أنه من المعروف بالفعل أن مركب كيناز WNK-SPAK / OSR1 معروف بالفسفرة وتثبيطتعبير KCC2 1،2،4،11،12 ، وأن تثبيط مسارات إشارات مجمع الكيناز لفسفرة Thr906 / Thr1007 قد تم ربطه بزيادة التعبير عن جين KCC2 mRNA 13،14،15 . من المهم ملاحظة أن تنظيم التعبير العصبي KCC2 و Na + -K + -2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) عبر فسفرة البروتين يعمل بشكل متزامن وفي أنماط عكسية1،4،16.

وقد أحرز تقدم ثابت وكبير فيما يتعلق بفهم الآليات التي ينطوي عليها تنظيم نظام KCC2، المعتمد لتطوير التقنيات التي تمكن الباحثين من دراسة وظائفه وأنشطته؛ إما عن طريق التحقيقات المباشرة (تقييم فسفرة المواقع التنظيمية للكيناز) أو التحقيقات غير المباشرة (مراقبة ومراقبة نشاط GABA). يسلط البروتوكول المقدم هنا الضوء على تطبيق تقنيات النشاف الغربية لدراسة وظائف وأنشطة الناقل العصبي K + -Cl- co-transporter KCC2 من خلال التحقيق في فسفرة الناقل المشترك في المواقع التنظيمية للكيناز Thr906/1007.

اللطخة الغربية هي طريقة تستخدم للكشف عن بروتينات معينة ذات أهمية من عينة من الأنسجة أو الخلية. تفصل هذه الطريقة أولا البروتينات حسب الحجم من خلال الرحلان الكهربائي. ثم يتم نقل البروتينات كهربائيا إلى دعامة صلبة (عادة غشاء) قبل تمييز البروتين المستهدف باستخدام جسم مضاد معين. يتم اقتران الأجسام المضادة بعلامات مختلفة أو أجسام مضادة مترافقة بالفلوروفور يتم اكتشافها باستخدام طرق القياس اللوني أو التلألؤ الكيميائي أو التألق. هذا يسمح باكتشاف بروتين مستهدف محدد من خليط من البروتينات. وقد استخدمت هذه التقنية لتوصيف المواقع الفوسفاتية النوعية ل KCCs1 واستخدمت لتحديد مثبطات الكيناز التي تثبط فسفرة KCC3 Thr991/Thr104817. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للمرء أن يكتشف على وجه التحديد KCC2 الكلي والمفسفر من تحلل الخلايا / الأنسجة. من حيث المبدأ ، يعد اكتشاف الأجسام المضادة المترافقة بالبروتين بواسطة هذه التقنية مفيدا للغاية لأنه يساعد على تحسين فهم الأنشطة التعاونية في مواقع الفوسفو في KCC2 ، والتي تلقي الضوء على الآليات الجزيئية المشاركة في لوائحها الفسيولوجية. يمثل التحليل الكمي للتعبير الكلي للبروتين وظيفة ونشاط KCC2. هناك طرق كلاسيكية أخرى تستخدم لقياس نشاط KCC2 مباشرة ، مثل أيون الروبيديوم ومقايسة امتصاص أيون الثاليوم. يتم استخدام تقنيات أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية المشبك لقياس نشاط GABA. ومن ثم ، تعكس بشكل غير مباشر KCC2 المنشط و / أو المعطل كما هو موضح في تقييم توازن أيون الكلوريد داخل الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يصف البروتوكول طريقة النشاف الغربي للكشف عن بروتينات معينة ذات أهمية.

1. ثقافة الخلية والنقل

  1. قم بتسخين جميع الكواشف في حمام الخرز (37 درجة مئوية) قبل إجراء زراعة الخلية. تحضير وسط الاستزراع ، وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ لكل من 2mM L-glutamine ، 100x حمض أميني غير أساسي ، 100 mM بيروفات الصوديوم ، و 100 وحدة / مل بنسلين ستربتومايسين.
  2. ذوبان الفئران المنقولة بثبات KCC2b الكلى الجنينية البشرية 293 خلية (HEK293rnKCC2b)18 تماما في حمام حبة (37 درجة مئوية). نقل الخلايا من أنبوب التبريد إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 5 مل من الوسائط الطازجة. أدر الخلية على 1200 × جم لمدة 3-5 دقائق.
  3. استخدم ماصة شفاط (مثبتة بمضخة تفريغ) لشفط المادة الطافية وإضافة 10 مل من الوسائط الطازجة لإعادة تعليق الخلايا. انقل معلق الخلية إلى طبق 10 سم.
  4. ضع الطبق في الحاضنة واتركه ينمو لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 . مراقبة فترة الحضانة لضمان نمو الخلايا الصحية. مزيد من تقسيم الخلايا عندما تصل إلى أكثر من 90 ٪ التقاء بعد فترة الحضانة.
  5. قم بشفط الوسائط القديمة من طبق الخلايا وشطف الخلايا برفق باستخدام 2 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS). أضف 2 مل من التربسين واحتضانه لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. استخدم 2 مل من الوسائط الكاملة لغسل خلايا التربسين برفق في الطبق. أضف 9 مل من الوسائط الطازجة إلى الأطباق الجديدة وأضف محلول 1 مل من الطبق القديم إلى كل طبق جديد. انقل أطباق الخلية المنقسمة مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة للوصول إلى التقاء ≥ 90٪.
  7. عالج الخلايا إما باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كعنصر تحكم ، أو 8 ميكرومتر ستوروسبورين ، أو 0.5 مللي متر N-ethylmaleimide (NEM) لمدة 15 دقيقة قبل حصاد الخلايا في محلول التحلل.

2. تحضير محللات الخلايا وتحميل العينات

  1. استنشاق وسائل الإعلام على طبق الثقافة (من إجراءات النقل). ضع ثقافة الخلية على الثلج واغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج.
  2. قم بشفط برنامج تلفزيوني ، ثم أضف 1.0 مل من محلول التحلل البارد بالثلج الذي يحتوي على 50 مللي مول من tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 1 مللي مول من جلايكول إيثيلين مكرر (β-أمينو إيثيل إيثر) -N ، N ، N ′ ، N′-حمض رباعي الخليك (EGTA) ، 1 مللي متر حمض إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، 50 مللي مول فلوريد الصوديوم ، 5 مللي مول بيروفوسفات الصوديوم ، 10 مللي مول صوديوم β جليسيروفوسفات ، 1 مللي متر أورثوفانادات الصوديوم ، 1٪ (وزن / حجم) تريتون X-100 ، 0.27 م سكروز ، 1 ملي متر بنزامين ، 0.1٪ (v / v) 2-ميركابتو إيثانول ، و 2 ملي مول فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) إلى الطبق.
    ملاحظة: يختلف حجم محلول التحلل أثناء حصاد الخلايا باختلاف أحجام الأطباق ، على سبيل المثال ، 1 مل من محلول التحلل مناسب لكل 1 × 107 خلايا / طبق 100 مم / 150 سم 2 دورق ، بينما 0.5 مل مناسب لكل 5 × 106 خلايا / طبق 60 مم / 75 سم2 قارورة.
  3. استخدم مكشطة الخلايا البلاستيكية الباردة لكشط الخلايا من قاع الطبق ، ثم استخدم ماصة برفق لنقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق موجود بالفعل على الجليد. حرك الأنبوب باستمرار لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بتدوير الخلية في جهاز طرد مركزي بارد (4 درجات مئوية) عند 16000 × جم لمدة 20 دقيقة ، وقم بإزالة الأنبوب برفق من جهاز الطرد المركزي ، وضعه على الثلج. اجمع المادة الطافية في أنبوب طازج مبرد مسبقا وتخلص من الحبيبات.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري تغيير قوة الطرد المركزي والوقت حسب نوع الخلية. على الرغم من ذلك ، تشجع الإرشادات العامة على الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 20 دقيقة. ومع ذلك ، يجب تحديد هذا لكل تجربة. على سبيل المثال ، تحتاج الخلايا الحساسة مثل الكريات البيض إلى سرعة طرد مركزي خفيفة للغاية.

3. تحضير المرسبات المناعية من محللات الخلايا

  1. ماصة 300 ميكرولتر من البروتين-G-sepharose في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أدر المحلول في 500 × جم لمدة 2 دقيقة وتخلص من المادة الطافية.
  2. أضف 500 ميكرولتر من PBS ودوامة الحل جيدا. أدر المحلول في 500 × جم لمدة 2 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة.
  3. امزج 1 ملغ من الأجسام المضادة المضادة ل KCC2 Thr906 والأجسام المضادة ل KCC2 Thr1007 مع 200 ميكرولتر من حبات البروتين G-sepharose وقم بتكوين الحجم إلى 500 ميكرولتر مع PBS. رج العبوة على منصة اهتزازية أو عجلة دوارة لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. اغسل 2x مع برنامج تلفزيوني.
  4. إجراء قياس كمية البروتين على محللات الخلية بأكملها وإضافة 1 ملغ من محللة الخلية إلى الخرز المغسول. احتضن بلطف في دوار من طرف إلى طرف لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. قم بتدوير الخرز واغسله 3x باستخدام PBS الذي يحتوي على 150 مللي مول كلوريد الصوديوم (NaCl).
  5. غسل المرسبات المناعية (الخرز) 3x مع 200 ميكرولتر من PBS. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 100 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت لعينة كبريتات دوديسيل الليثيوم (LDS).
  6. رج الأنابيب في شاكر دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق واحتضانها في كتلة تسخين عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي لعينة التحميل عند 11000 × جم لمدة 2 دقيقة واستخدم المادة الطافية لتحميل الهلام.

4. أداء اللطخة الغربية

  1. قم بتجميع جهاز الصب واسكب جل فصل 8٪ طازج (انظر الجدول 1 للحصول على الوصفة / التحضير) لصب الجل مما يسمح بحوالي 2 سم من المساحة من أعلى زجاج الصب. أضف 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المطلق إلى الإعداد واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: تعتمد وصفة هلام بولي أكريلاميد للرحلان الكهربائي لكبريتات دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد جل (SDS-PAGE) على حجم البروتين محل الاهتمام (الجدول 2). ومن ثم ، قم بتدوين حجم البروتين قبل تحديد نسبة الجل المطلوبة.
  2. استخدم ماصة لإزالة الأيزوبروبانول وشطف الجل بعناية بحوالي 200 ميكرولتر من الماء المقطر. أضف جل التراص الطازج بنسبة 6٪ (انظر الجدول 1 للوصفة / التحضير) لملء مساحة 2 سم تقريبا في إعداد الصب. ضع مشط البئر برفق واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. ثبت الجل المصبوب في خزان الرحلان الكهربائي.
  4. قم بإذابة 30.3 جم من قاعدة Tris ، و 144.1 جم من الجلايسين ، و 10 جم من SDS في 1000 مل من الماء المقطر لتحضير محلول نقل 10x. قم بإعداد مخزن مؤقت تشغيل واحد عن طريق إضافة 10 مل من 10٪ SDS و 100 مل من مخزن نقل 10x إلى 890 مل من الماء المقطر.
  5. صب 1x تشغيل العازلة في الخزان. قم بتحميل 5 ميكرولتر من علامة الوزن الجزيئي في البئر الأول وكمية متساوية من البروتين في كل بئر من هلام SDS-PAGE (بين 18-30 ميكرولتر ، اعتمادا على حجم المشط المستخدم). املأ الآبار الفارغة ب 1x LDS وقم بتشغيل الجل لمدة 90-120 دقيقة عند 120 فولت.
  6. قم بإذابة 58.2 جم من قاعدة Tris و 29.3 جم من الجلايسين في 1000 مل من الماء المقطر لتحضير محلول نقل 10x. تنشيط غشاء النيتروسليلوز مع 1x نقل عازلة تحتوي على 20 ٪ الميثانول. شطف الجل والغشاء مع المخزن المؤقت للنقل ونشرها برفق على كومة التحضير.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة لضبط الأس الهيدروجيني للمخازن المؤقتة للتشغيل والنقل حيث يجب أن تكون عند الرقم الهيدروجيني الأمثل المطلوب. أيضا ، ينصح بإعداد هذه المخازن المؤقتة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة قبل التجربة لتوفير الوقت.
  7. رتب الساندويتش المراد نقله بهذا الترتيب: قطب سالب (إطار / نهاية أسود) - رغوة ساندويتش - ورق ترشيح - جل SDS-PAGE مغسول - غشاء نيتروسليلوز مغسول - ورق ترشيح - رغوة شطيرة - قطب موجب (إطار أحمر). قم بتكديس الساندويتش المجمع في خزان النقل وقم بتشغيله بسرعة 90 فولت لمدة 90 دقيقة أو 30 فولت لمدة 360 دقيقة.

5. تلطيخ الأجسام المضادة وتطوير الصورة

  1. قم بإزالة الغشاء واتركه يجف. سد الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام عازل مانع مصنوع من حليب منزوع الدسم بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن يحتوي على 0.1٪ 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. احتضان الأغشية مع التخفيفات المناسبة من الجسم المضاد الأولي8،15،19 وبيتا أكتين (التحكم في التحميل) في حجب المخزن المؤقت لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الغشاء في ثلاث غسلات من 1x TBS-T لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: إن حضانة الغشاء المنفصل مع أدوات التحكم في التحميل مثل بيتا أكتين أو ألفا توبولين أو الأجسام المضادة لنازعة هيدروجين الجلسرين 3-فوسفات هو تطبيع نتائج النشاف الغربية الأخرى أثناء القياس الكمي اللاحق. يتوفر التخفيف الموصى به لكل جسم مضاد أساسي في دليل الشركة المصنعة.
  3. احتضان الغشاء المغسول بجسم مضاد ثانوي مخفف 5000 ضعف في المخزن المؤقت المانع لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل الغشاء 3x في 1x TBS-T لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: يوصى بشدة برفع الجسم المضاد الثانوي ضد الأنواع التي ينشأ فيها الجسم المضاد الأساسي. على سبيل المثال ، إذا كان الجسم المضاد الأساسي لإجمالي KCC2 هو مضاد الماوس KCC2 ، فيجب استخدام الجسم المضاد الثانوي لمكافحة الماوس.
  4. ضع الغشاء المغسول على لوحة التصوير. امزج كميات متساوية من كل كاشف تلألؤ كيميائي محسن (ECL) وانشر المحلول المختلط برفق على الغشاء لتطوير الإشارات.

6. الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير وقياس البيانات

  1. انقل لوحة التصوير إلى المقصورة المناسبة في نظام التصوير للتصوير. افتح برنامج التصوير على الكمبيوتر لمعالجة الصور.
  2. على شريط الأدوات، انقر فوق بروتوكول جديد واختر قناة واحدة. انقر فوق تحديد ضمن مربع حوار التصوير / التطبيق الهلامي ، وقم بالتمرير إلى Blot وحدد إما حساسية Chemi Hi أو Chemi Hi Resolution. ثم انقر فوق إعداد تراكم الإشارة لتعيين مدة وعدد الصور المراد الحصول عليها.
  3. انقر فوق Position Gel ضمن إعداد البروتوكول واضبط الجل في نظام التصوير إذا لزم الأمر. انقر فوق تشغيل البروتوكول للحصول على الصور.
  4. انقر بزر الماوس الأيمن فوق إحدى الصور التي تم الحصول عليها ضمن مربع كتالوج الصور لحفظ الصور على الكمبيوتر. انتقل إلى الصورة المطلوبة وانقر على تحديد صورة ومتابعة ضمن مربع الحوار تشغيل.
  5. انقر على أيقونة تحويل الصورة لضبط التباين وتشبع البكسل للصورة. انقر على أيقونة لقطة الشاشة على شريط الأدوات العام لحفظ الصورة على الكمبيوتر اعتمادا على تنسيق الصورة المطلوب.
  6. قم بقياس كثافة النطاق باستخدام برنامج ImageJ والتحليل باستخدام الأدوات الإحصائية المناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، بحثت النتيجة التمثيلية المقدمة في الشكل 1 في تأثير staurosporine و NEM على الفسفرة بوساطة WNK-SPAK / OSR1 ل KCC2 و NKCC1 في خطوط خلايا HEK293 التي تعبر بثبات عن KCC2b (HEKrnKCC2b) 18 باستخدام تقنية النشاف الغربي. وترد مناقشة تفاصيل شاملة عن النتائج التمثيلية في Zhang et al.15. على غرار NEM ، فإن staurosporine هو مثبط كيناز واسع يمكن أن يعزز نشاط نقل KCC2 ويمنع نشاط NKCC115,20

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام العديد من الطرق لقياس أنشطة SLC12 من CCCs التي يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية ، بما في ذلك KCC2. وقد ثبت أن العديد من هذه التقنيات تعزز المعرفة العلمية بشأن تحليل الأهمية الوظيفية لهذه الناقلات وأنماط هيكلها الوظيفي في مختلف الطفرات المرتبطة بالمرض. بشكل حاسم ، هناك مزايا ومحاذير للطرق المختلفة21. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الموضح أعلاه ، حدد كيفية تقييم فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز ، Thr906 و Thr1007 ، باستخدام اللطخة الغربية ، والتي يمكن أن تكون مفيدة في دراسة وظائف وأنش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الملكية في المملكة المتحدة (رقم المنحة. IEC \ NSFC \ 201094) ، ومنحة دكتوراه الكومنولث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
40٪ أكريلاميدSigma-AldrichA2917تستخدم لصنع جل الفصل والتكديس ل SDS-PAGE & nbsp ؛
الأمونيوم لكل كبريتاتسيجما ألدريتش248614يستخدم لصنع هلام الفصل والتكديس ل SDS-PAGE 
مضاد ل pSPAKجامعة دنديS670Bيستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف الغربي
المضاد ل KCC2جامعة دنديS700Cيستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف الغربي
المضاد ل KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف الغربي
المضاد ل KCC2 pThr1007جامعة دنديS961Cتستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف الغربي
المضاد ل KCC2 pThr906جامعة دنديS959Cتستخدم كجسم مضاد أساسي لتقنية
إشارات الخلاياالمضادة للفأر66002تستخدم كجسم مضاد ثانوي للنشاف الغربي
المضاد ل NKCC1جامعة دنديS841Bيستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف الغربي
المضاد ل NKCC1 pThr203 / 207/212تستخدم جامعة دنديS763Bكجسم مضاد أساسي لتقنية
إشارات الخلاياالمضادة للأرانبC29F4تستخدم كجسم مضاد ثانوي للنشاف الغربي
المضاد للأغنامabcamab6900يستخدم كجسم مضاد ثانوي للنشاف الغربي
المضاد ل SPAKجامعةدندي S669Dيستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف الغربي
مضاد للبيتا يوبولين IIIسيجما ألدريتشT8578يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف الغربي
بنزامينميرك المملكةالمتحدة 135828يستخدم كمكون من مكونات المخزن المؤقت للتحلل
بيتا ميركابتو إيثانولسيجما-ألدريتشM3148يستخدم كمكون من مكونات عازلة التحميل ومحلول التحلل
برادفورد كوماسي1856209 Thermo Scientificيستخدم لقياس كمية البروتين المحلل
جهاز الصبAtto WSE-1165Wتستخدم لتشغيل جهاز الطرد الكهربائي للرحالية SDS
Eppendorf5804تستخدم في تحضير أجهزة
الطرد المركزيVWRMicroStar 17Rالمستخدمة لتدوير العينات
ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLتستخدم لتجربة زراعة الخلايا
الحليب المجفف منزوعالدسم MarvelN / Aيستخدم لصنع الحجب العازلة
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - ارتفاع الجلوكوزSigma-AldrichD6429تستخدم لزراعة الخلايا
كاشف ECLPerkin ElmerORTT755 / 2655تستخدم لتطوير صورة للنشاف الغربي
EDTAFisher ScientificD / 0700/53تستخدم كمكون من مكونات المخزن المؤقت للتحلل
EGTASigma-Aldriche4378تستخدم كمكون من مكونات التحلل العازلة
Electrophoreses PowerSupply BioRadPowerPAC HCلتوفير الطاقة لتشغيل الرحلان الكهربائي SDS-page
الإيثانولThermoFisher E/ 0650DF / 17يستخدم لإعداد المعدات المعقمة والبيئة
مصل الأبقار الجنيني -  الحرارة المعطلةMerck Life Sciences UKF9665المستخدمة لزراعة الخلايا
الدخانWalkerA7277تستخدم لزراعة الخلايا
هلام النشاف - WhatmanGE Healthcare 10426981تستخدم في النشاف الغربي لصنع شطيرة نقل
GlycineSigma-Aldrich15527تستخدم لصنع المخازن المؤقتة
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software، Inc.، الولايات المتحدة الأمريكيةالإصدار 6.0تستخدم لرسم الرسوم البيانية وتحليل البيانات الخاصة ب   النشاف الغربي
HClAcros Organics10647282تستخدم لصنع جل الفصل والتكديس ل SDS-PAGE  ؛
كتلة التسخينGrantQBT1تستخدم لتسخين عينات تحميل WB
HEK293Merck UK12022001-1VLخط الخلية لتجربة الثقافة
ImageJ SoftwareWayne Rasband والمساهمين ؛ المعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية ImageJ 1.53eتستخدم لقياس شدة النطاق من صور النشاف الغربية
نظام التصويرBioRadChemiDoc MPتستخدم لالتقاط صور النشاف الغربية
حاضنةLEECLEEC دقة 190Dتستخدم لزراعة الخلايا
IsopropanolHoneywell24137تستخدم في صب الجل لمحلول الرحلان الكهربائي
L-glutamineSigma-AldrichG7513يستخدم لزراعة الخلايا
كبريتات الليثيوم دوديسيل (LDS) NovexNP0008يستخدم كمخزن مؤقت للتحميل للنشاف الغربي
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية   ؛Merck Life Sciences UKM7145تستخدم لزراعة الخلايا
أجهزة الطرد المركزي الدقيقةEppendorf5418تستخدم لتحضير المحللات لقارئ WB
MicroplateBioRadiMarkتستخدم لقراءة تركيز البروتين المحللة
Microsoft Powerpoint، USAPowerPoint2016تستخدم لتحرير صور النشاف
الغربي علامة الوزنالجزيئيBioRad1610373يستخدم في النشاف الغربي
N-ethylmaleimideThermo Fisher Scientific23030يستخدم لتجربة زراعة الخلايا
غشاء النيتروسليلوزفيشرScientific 45004091يستخدم في النشاف الغربي
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140122يستخدم لزراعة الخلايا
مقياس الأس الهيدروجينيMettler ToledoSeven compact s210تستخدم لمراقبة درجة الحموضة في المحاليل العازلة
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF)Sigma-AldrichP7626تستخدم كمكون من مكونات عازلة
التحلل عازلة الفوسفات محلول ملحيSigma-AldrichD8537تستخدم لزراعة الخلايا
PKC & delta ؛ pThr505تقنية إشارات الخلية9374تستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف الغربي
بروتين Sepharose GGeneronPG50-00-0002يستخدم في الترسيب المناعي
كلوريد الصوديومSigma-AldrichS7653يستخدم كمكون من مكونات عازلة الغسيل
كلوريد الصوديومSigma-AldrichS7653يستخدم لتحضير TBS-T عازلة
كبريتات الصوديوم DodecylSigma-AldrichL5750تستخدم لصنع جل الفصل والتكديس ل SDS-PAGE 
أورثوفاناديت الصوديومسيجما-ألدريتشS6508يستخدم كمكون من مكونات عازلة التحلل
بيروفات الصوديومسيجما-ألدريتشS8636يستخدم لزراعة الخلايا
الصوديوم - بيتا ؛ - جليسيروفوسفاتميرك المملكة المتحدةG9422يستخدم كمكون من عازلة التحلل
ستاوروسبورين (من Streptomyces sp.< / em>)لوازم المختبرات العلمية ، المملكة المتحدةS4400-1MGتستخدم لتجربة زراعة الخلايا
السكروزScientifc Laboratory SuppliesS0389تستخدم كمكون من مكونات المخزن المؤقت للتحلل
TEMEDSigma-AldrichT7024تستخدم لصنع جل الفصل والتكديس ل SDS-PAGE & nbsp ؛
غرفة النقلBioRad1658005EDUتستخدم في النشاف الغربي لنقل البروتين على الغشاء
TrisSigma-AldrichT6066تستخدم لصنع جل الفصل والتكديس ل SDS-PAGE   ؛
Triton-X100Sigma-AldrichT8787يستخدم كمكون من مكونات محلول التحلل
Trypsin-EDTA MerckLife Sciences UKT4049يستخدم لزراعة الخلايا
Tween-20Sigma-AldrichP3179يستخدم كصنع مضخة فراغ عازلة TBS-T
Charles AustenDymax 5تستخدم لزراعة الخلايا
VortexScientific IndustriesK-550-GEتستخدم في تحضير العينات
خلاط دوامةالصناعات العلمية المحدودةVortex-Genie   ؛ K-550-GEتستخدم لخلط عينة تم حلها
Waterbath Grant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5تستخدم لاحتضان الحلول
الغربية الغربية ثنائي خلايا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776(2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142(2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65(2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78(2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967(2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3(2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986(2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820(2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429(2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992(2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255(2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032(2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10(2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

KCC2 FunctionNeuronal KCC2KCC2 PhosphorylationChloride HomeostasisGABAergic InhibitionProtein QuantificationHEK293 CellsKinase Regulatory SitesProtein Kinase C

مقالات ذات صلة