يقدم البروتوكول الحالي طريقة فعالة ومرنة لعزل الحمض النووي الريبي من الكسور النووية والسيتوبلازمية باستخدام الخلايا المستزرعة ، ثم التحقق من صحتها باستخدام qPCR. هذا يعمل بشكل فعال كبديل لمجموعات إعداد الحمض النووي الريبي الأخرى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحضير الحمض النووي الريبي الطويل السيتوبلازمي والنووي من الخلايا الأولية والمستزرعة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كان فصل المكونات داخل الخلايا أداة رئيسية في البيولوجيا الخلوية لسنوات عديدة حتى الآن وتمكن من توفير نظرة ثاقبة مفيدة حول كيفية تأثير موقعها على وظيفتها. على وجه الخصوص ، أصبح فصل الحمض النووي الريبي النووي والسيتوبلازمي مهما في سياق الخلايا السرطانية والسعي لإيجاد أهداف جديدة للأدوية. يمكن أن يكون شراء مجموعات لاستخراج الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي النووي مكلفا عندما يمكن العثور على العديد من المواد المطلوبة في بيئة معملية نموذجية. باستخدام الطريقة الحالية ، التي يمكن أن تحل محل مجموعات أكثر تكلفة أو غيرها من العمليات التي تستغرق وقتا طويلا ، لا يلزم سوى مخزن مؤقت محلي الصنع ، وأجهزة طرد مركزي على الطاولة ، وأعمدة تنقية عزل الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي والسيتوبلازمي. يستخدم المخزن المؤقت للتحلل لتحلل الغشاء الخارجي للخلية برفق دون التأثير على سلامة الغلاف النووي ، مما يسمح بإطلاق مكوناته داخل الخلايا. بعد ذلك، يمكن عزل النوى عن طريق خطوة طرد مركزي بسيطة؛ لأنها تحتوي على كثافة أعلى من محلول التحلل. يستخدم الطرد المركزي لفصل هذه المناطق بناء على اختلافات كثافتها لعزل العناصر تحت الخلوية في النواة عن تلك الموجودة في السيتوبلازم. بمجرد أن يقوم الطرد المركزي بعزل المكونات المختلفة ، يتم استخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي لتنقية محتوى الحمض النووي الريبي ، ويتم إجراء qPCR للتحقق من جودة الفصل ، ويتم تحديدها كميا بكمية الحمض النووي الريبي والسيتوبلازمي في الأجزاء المختلفة. تم تحقيق مستويات ذات دلالة إحصائية من الفصل ، مما يوضح فعالية البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف هذا النظام لعزل أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي (الكلي ، الحمض النووي الريبي الصغير ، إلخ) ، مما يسمح بالدراسة المستهدفة لتفاعلات السيتوبلازم والنواة ، ويساعد في فهم الاختلافات في وظيفة الحمض النووي الريبي الموجودة في النواة والسيتوبلازم.
المقدمة
يسمح التجزئة الخلوية إلى مكونات دون خلوية بعزل ودراسة المجالات البيوكيميائية المحددة ويساعد في تحديد توطين عمليات خلوية محددة وكيف يمكن أن يؤثر ذلك على وظيفتها1. يمكن أن يسمح عزل الحمض النووي الريبي من مواقع مختلفة داخل الخلايا بتحسين دقة التحليل الجيني والكيميائي الحيوي لأحداث مستوى النسخ والتفاعلات الأخرى بين النواة والسيتوبلازم ، والتي تعمل كغرض أساسي للبروتوكولالحالي 2. تم تطوير هذا البروتوكول لضمان عزل الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي والنووي لتحديد دور كل منهما في التصدير النووي وفهم كيفية تأثير توطين الحمض النووي الريبي تحت الخلوي في النواة والسيتوبلازم على وظيفتها في العمليات الخلوية. وباستخدام مواد من بيئة مختبرية نموذجية، كان من الممكن تحقيق التجزئة النووية والسيتوبلازمية على نحو أكثر فعالية وأقل تكلفة من البروتوكولات الموضوعة سابقا دون المساس بجودة النتائج3.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة تبادل الجزيئات بين السيتوبلازم والنواة مباشرة عن طريق فصل هذه المناطق. وبشكل أكثر تحديدا ، يعد فهم النسخ أمرا ضروريا لفهم التطور والمرض. ومع ذلك ، قد تكون الحمض النووي الريبي عند مستويات نضج مختلفة في أي وقت ويمكن أن تعقد تحليل المصب. يسمح هذا البروتوكول بالقدرة على عزل الحمض النووي الريبي من الكسور تحت الخلوية النووية والسيتوبلازمية ، والتي يمكن أن تساعد في دراسات الحمض النووي الريبي وتسمح بفهم أفضل لحمض نووي ريبوزي معين ذي أهمية ، مثل توطين الحمض النووي الريبي غير المشفر أو تحليل تقاطعات لصق داخل النواة.
تم تحسين هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي الطويل السيتوبلازمي والنووي ، بما في ذلك mRNAs و rRNAs و RNAs الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) ، نظرا لانتقائية حجم عمود تنقية الحمض النووي الريبي المستخدم ، والذي يمكن تعديله لعزل الحمض النووي الريبي الآخر ذي الأهمية. في السابق ، كانت وظيفة الحمض النووي الريبي الطويل ، مثل mRNAs و lncRNAs ، تعتمد بشكل كبير على توطين كل منها داخل الخلية 4,5. لذلك ، أصبحت دراسة التصدير من النواة إلى المجالات دون الخلوية أكثر استهدافا لفهم الدور الذي يمكن أن يلعبه تصدير الحمض النووي الريبي أو المكونات الخلوية الأخرى على الخلية. تعمل lncRNAs كمثال رئيسي على ذلك ، حيث تعتمد ترجمتها وآثارها اللاحقة إلى حد كبير على القرب والتفاعلات مع أشكال أخرى من RNA6. علاوة على ذلك ، يرتبط تبادل العناصر الخلوية بين المناطق النووية والسيتوبلازمية بآليات المقاومة لمختلف علاجات السرطان7. سمح عزل المقصورات داخل الخلايا بتطوير مثبطات التصدير النووي ، مما قلل من آثار آليات المقاومة للعلاجات المختلفة8.
بعد فصل الحمض النووي الريبي النووي والسيتوبلازمي ، يتم تنفيذ خطوات لتنقية الحمض النووي الريبي محل الاهتمام. نظرا لأن مجموعات تنقية الحمض النووي الريبي توجد بشكل شائع داخل المختبرات وتعمل على تنقية وعزل الحمض النووي الريبي الطويل ، فإنها تخدم الغرض من هذا البروتوكول جيدا. لتنقية الحمض النووي الريبي ، يعد توليد نسب 260: 280 أكبر من 1.8 أمرا بالغ الأهمية لضمان جودة العينات لتسلسل الحمض النووي الريبي أو غيرها من الإجراءات المماثلة التي تتطلب مستويات عالية من النقاء والعزل. تشير القيم غير المنتظمة 260: 280 إلى تلوث الفينول ، مما يدل على ضعف العزل ويؤدي إلى نتائج غير دقيقة9.
بمجرد اكتمال تنقية الحمض النووي الريبي وتأكيد أن قيم 260: 280 أعلى من النطاق المقبول ، تم استخدام qPCR للتحقق من صحة نتائج عزل الكسور النووية والسيتوبلازمية. عند القيام بذلك ، تم استخدام الاشعال الخاصة بالمنطقة ذات الاهتمام لإثبات مستويات التجزئة النووية والسيتوبلازمية. في هذا البروتوكول ، تم استخدام MALAT1 و TUG1 كعلامات نووية وسيتوبلازمية ، على التوالي10. معا ، فإنها تسمح بإظهار مستويات عالية من التجزئة النووية مع MALAT1 ، في حين من المتوقع أن تكون التجزئة السيتوبلازمية منخفضة. على العكس من ذلك ، عند استخدام TUG1 ، من المتوقع أن تكون مستويات التجزئة السيتوبلازمية أعلى من مستويات التجزئة النووية.
باستخدام هذا البروتوكول ، كان من الممكن عزل الحمض النووي الريبي بناء على موقع عملها داخل الخلية. نظرا للوصول الواسع النطاق إلى العديد من المواد واستخدام المخزن المؤقت للتحلل فقط وتقنيات الطرد المركزي القائمة على الكثافة خلال هذه التجربة ، فإن قابلية التطبيق على أنواع الحمض النووي الريبي الأخرى والمكونات الخلوية الأخرى منتشرة على نطاق واسع. يمكن أن يوفر هذا معلومات مهمة من خلال تسليط الضوء على أحداث التعبير الخاصة بالموقع والتي لا يمكن تمييزها بدون فصل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تستخدم خلايا K562 في الدراسة الحالية. تم تحسين هذا البروتوكول للعمل مع 1 × 10 6-5 × 106 مليون خلية. ومع ذلك ، يمكن توسيع نطاق الإجراء لكميات أكبر من الخلايا عن طريق زيادة الأحجام بشكل مناسب.
1. إعداد المخزن المؤقت 0.25x تحلل
- قم بإعداد محلول تحلل 0.25x عن طريق خلط المكونات التالية الواردة في الجدول 1 أ.
ملاحظة: تتطلب العينات حوالي 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 0.25x. الحجم الموصى به = عدد العينات × 300 ميكرولتر.
2. فصل الكسور النووية والسيتوبلازمية
- قم بتكوير الخلايا باستخدام أنابيب سعة 1.5 مل عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2000 × جم (درجة حرارة الغرفة). تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة شفط.
ملاحظة: تم استخدام خلايا K562 خلال هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول مع خطوط الخلايا المختلفة. - أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من محلول تحلل الثلج البارد 0.25x.
ملاحظة: الحفاظ على الجليد لمدة 2 دقيقة وتدوير الأنبوب كل 45 ثانية لضمان تحلل الخلايا بشكل صحيح. - قم بتدوير الأنابيب بأعلى سرعة (12000 × جم) عند 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة.
- بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ووضعها في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. سيكون هذا هو الجزء السيتوبلازمي. سيتم تحقيق ما يقرب من 300 ميكرولتر من الجزء السيتوبلازمي.
- الحبيبات المتبقية ستكون الجزء النووي. أضف 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد إلى الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: خلال هذه الخطوة ، تتم إزالة الحمض النووي الزائد.
3. تنظيف الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي
ملاحظة: تم تحقيق هذا البروتوكول باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
- فصل عينات الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي وعينات السيتوبلازم النووي (حيث تختلف خطوات التجزئة بينهما).
- لفصل الكسر السيتوبلازمي ، أضف 1050 ميكرولتر من محلول تحلل RLT 3.5x (انظر جدول المواد) والدوامة لفترة وجيزة. ثم أضف 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 90٪ وقم بتحميله على العمود من مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي.
ملاحظة: يجب خلط المحلول جيدا قبل التحميل على العمود. - لفصل الجزء النووي ، أضف 600 ميكرولتر من 3.5x محلول التحلل والدوامة. ثم أضف 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪.
- لفصل الكسر السيتوبلازمي ، أضف 1050 ميكرولتر من محلول تحلل RLT 3.5x (انظر جدول المواد) والدوامة لفترة وجيزة. ثم أضف 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 90٪ وقم بتحميله على العمود من مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي.
- قم بتحميل كل من الكسور السيتوبلازمية والنووية على أعمدة الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
ملاحظة: بالنسبة لبقية الخطوة 3 ، تتبع كل من العينات السيتوبلازمية والنووية نفس الإجراء. ومع ذلك ، تأكد من أن هذه العينات تظل مستقلة عن بعضها البعض.- قم بتحميل كل من الكسور السيتوبلازمية والنووية على أعمدة الحمض النووي الريبي وقم بتدويرها لمدة 30 ثانية عند 8000 × جم في درجة حرارة الغرفة. تخلص من التدفق الزائد من خلاله.
- أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل من مجموعة تنقية متاحة تجاريا (مخزن مؤقت RW1 ، انظر جدول المواد) ، وقم بتدويره مرة أخرى ، وتجاهل التدفق من خلاله.
- أضف محلول DNAse (1U / uL) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل ، وقم بتدويره مرة أخرى ، وتجاهل التدفق من خلاله.
- أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المعتدل (RPE ، انظر جدول المواد) ، وقم بتدويره مرة أخرى ، وتجاهل التدفق من خلاله. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل المعتدل ، وقم بتدويره مرة أخرى ، ولكن لمدة 2 دقيقة فقط.
- انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 مل وأضف 30 ميكرولتر من الماء إلى عمود الدوران. دع العمود يجلس لمدة 1 دقيقة قبل الدوران.
4. التحقق من صحة الفصل النووي السيتوبلازمي
- أداء تخليق cDNA
- بمجرد استخراج وتنقية الأجزاء تحت الخلوية من الحمض النووي الريبي ، تأكد من فصل المقصورات باستخدام qPCR. للقيام بذلك ، أولا ، قم بتحويل الحمض النووي الريبي إلى cDNA باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- تحضير ماستر النسخ العكسي. إضافة قالب الحمض النووي الريبي. احتضان ردود الفعل في دورة حرارية.
ملاحظة: بالنسبة للسداسيات العشوائية ، يتم توفير معلمات الدورة المستخدمة في الجدول 2A. استخدم تفاعل النسخ العكسي على الفور أو خزنه عند -20 درجة مئوية (الجدول 1 ب).
- إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) والتحليل.
- قم بتخفيف تخليق cDNA بماء DEPC (انظر جدول المواد) للحصول على تركيز نهائي قدره 20 نانوغرام / مل.
- باستخدام مزيج رئيسي من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد التفاعل لكل عينة باستخدام التعليمات اليدوية كما هو موضح أدناه.
- الحصول على المجسات التجارية اللازمة للكشف عن التجزئة السيتوبلازمية والنووية. استخدم MALAT1 كعلامة نووية و TUG1 كعلامة السيتوبلازمية (انظر جدول المواد).
ملاحظة: ترد في الجدول 3 تسلسلات MALAT1 و TUG1. - احسب حجم كل مكون بضرب كل مكون في 3 لكل من النسخ المتماثلة التقنية للعينة الفردية.
- لكل عينة نووية وسيتوبلازمية ، احصل على الخلطات التالية لكل منها: (أ) جزء نووي مع MALAT1 ، (ب) جزء سيتوبلازمي مع MALAT1 ، (ج) جزء نووي مع TUG1 ، و (د) جزء سيتوبلازمي مع TUG1 (الجدول 1C).
- دوامة لفترة وجيزة لخلط المحاليل ونقل 20 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر من لوحة التفاعل البصري (انظر جدول المواد).
- قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق شفاف يستخدم في qPCR (انظر جدول المواد) وطرد مركزي للوحة لفترة وجيزة للتخلص من فقاعات الهواء ، ثم قم بتدوير العينة لأسفل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام برنامج التصميم والتحليل (انظر جدول المواد) ، حدد المنحنى القياسي لمعلمات ركوب الدراجات (الجدول 2B).
- باستخدام برنامج qPCR ، حدد إعداد التشغيل (الشكل التكميلي 1).
- في صفحة خصائص ملف البيانات ، حدد معلمات الطريقة ودورة الإدخال من الجدول 2B (الشكل التكميلي 2).
- بعد إدخال معلمات الدورة ، حدد علامة التبويب Plate ، وأدخل العينات المراد تشغيلها (الشكل التكميلي 3). حدد بدء التشغيل.
ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات الموضحة في جهاز qPCR باستخدام مزيج رئيسي متاح تجاريا (انظر جدول المواد).
- إجراء تحليل البيانات
- بعد اكتمال التشغيل، قم بإنشاء جدول بيانات باسم العينة واسم الهدف ودورة القياس الكمي (Cq) (الجدول التكميلي 1).
- ابدأ بعينات MALAT1 لحساب الكسر النووي. اطرح الجزء السيتوبلازمي MALAT1 من الجزء النووي MALAT1 (الجدول 4).
- ثم احسب ΔCq (2 ^ (-value)) (الجدول 5).
- استمر في عينات MALAT1 لحساب الكسر السيتوبلازمي ، واطرح الجزء النووي MALAT1 من الكسر السيتوبلازمي MALAT1 ، ثم احسب ΔCq (2 ^ (-value)) (الجدول 6).
ملاحظة: بالنظر إلى ΔCq ، لوحظ أن جزء MALAT1 النووي (تسليط الضوء الأخضر) له علامة MALAT1 أكبر من السيتوبلازم (تسليط الضوء الأحمر) ، ولكن الآن مطلوب تأكيد للتأكد من أن الجزء السيتوبلازمي هو في الغالب السيتوبلازم وأن الجزء النووي لا يحتوي على تلوث السيتوبلازم. - باستخدام عينات TUG1، قم بإجراء نفس العملية الحسابية المذكورة أعلاه (الخطوات 4.3.2-4.3.4) (الجدول 7).
ملاحظة: بالنظر إلى ΔCq ، لوحظ أن جزء TUG1 السيتوبلازمي (تسليط الضوء الأخضر) له علامة TUG1 أكبر من الجزء النووي (تسليط الضوء الأحمر) ، مما يؤكد الفصل الجيد للكسور السيتوبلازمية والنووية (الجدول 8 ، الشكل 1).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لضمان تحقيق العزل النووي والسيتوبلازمي ، تم إجراء qPCR للتحقق من صحة النتائج. عند القيام بذلك ، تم استخدام الاشعال الخاصة بالمنطقة ذات الاهتمام لإثبات مستويات التجزئة النووية والسيتوبلازمية. في هذه الدراسة ، تم استخدام MALAT1 و TUG1 كبادئات نووية وسيتوبلازمية ، على التوالي. معا ، فإنها تسمح بإظهار مستويات عالية من التجزئة النووية مع MALAT1 كتحكم إيجابي للعناصر النووية ، في حين من المتوقع أن تكون التجزئة السيتوبلازمية منخفضة. على العكس من ذلك ، عندما يكون TUG1 موجودا كعنصر تحكم إيجابي للعناصر السيتوبلازمية ، فمن المتوقع أ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في جميع أنحاء البروتوكول ، تم اتخاذ بعض الخطوات لتحسين العناصر لتكون أكثر فعالية لخط اهتمام الخلية. في حين أن الخطوات داخل البروتوكول واضحة نسبيا ، فقد يكون من الضروري إجراء تحليل وتعديلات طفيفة خلال الجوانب الحرجة للبروتوكول. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي تعديل تركيز المخزن المؤقت للتحلل إلى تركيز مناسب بناء على خط اهتمام الخلية والهدف الخلوي. نظرا لأن استخدام المخزن المؤقت للتحلل يعتمد إلى حد كبير على تعطيل أغشية الخلايا ، فهناك تباين طبيعي في فعالية محلول التحلل على خطوط الخلايا المختلفة حيث توجد اختلافات طفيفة...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
بدعم من منح من الجمعية الأمريكية لأمراض الدم ، ومؤسسة روبرت وود جونسون ، ومؤسسة دوريس ديوك الخيرية ، ومؤسسة إدوارد بي إيفانز ، والمعهد الوطني للسرطان (1K08CA230319).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | نظام Agilent TapeStation هو حل آلي للرحلان الكهربائي لمراقبة جودة العينة لعينات الحمض النووي والحمض النووي الريبي. |
| 0.5٪ Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | يستخدم في صنع عازلة التحلل |
| 50 ملي مولار Tris-Cl درجة الحموضة 8.0 | 15568025 | Thermo-Fischer | تستخدم في صنع المخزن المؤقت للتحلل |
| MALAT1 GE | Assay Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 المستخدمة لتأكيد الكسر النووي. | |
| لوحة تفاعل MicroAmp البصرية 96 بئر مع الباركود | Thermo-Fischer | 4326659 | تم تحسين لوحة التفاعل البصرية MicroAmp البصرية 96 جيدا مع الباركود لتوفير دقة توحيد لا مثيل لها في درجة الحرارة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل بسرعة وكفاءة. هذه اللوحة ، المصنوعة من قطعة صلبة واحدة من البولي بروبيلين بتنسيق 96 بئرا ، متوافقة مع أنظمة Applied Biosystems 96-Well-Real-Time PCR والدراجات الحرارية. |
| لاصق بصري MicroAmp | Thermo-Fischer | 4311971 | يقلل فيلم اللصق البصري MicroAmp Biosystems Applied من فرصة التلوث من البئر إلى البئر وتبخر العينة عند تطبيقه على صفيحة دقيقة أثناء qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | ملحي متوازن يستخدم في مجموعة متنوعة من تطبيقات زراعة الخلايا ، مثل غسل الخلايا قبل التفكك ، نقل عينات الخلايا أو الأنسجة ، وتخفيف الخلايا للعد ، وإعداد الكواشف. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | تنظيف الحمض النووي الريبي بكفاءة للتفاعلات الأنزيمية وتنظيف الحمض النووي الريبي المنقى بطرق مختلفة. يتضمن المخازن المؤقتة RW1 و RLT و RW1 المذكورة في جميع أنحاء البروتوكول. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR أثناء البروتوكول. يتضمن برنامج تصميم وتحليل لتحليل عينات التجزئة |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer من طقم تنظيف الحمض النووي الريبي |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer من طقم تنظيف الحمض النووي الريبي |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer من طقم تنظيف الحمض النووي الريبي |
| Taqman Gene Expression | Assays Thermo-Fischer | 4331182 | تمثل فحوصات التعبير الجيني TaqMan للأنظمة الحيوية التطبيقية أكبر مجموعة من المقايسات المصممة مسبقا في الصناعة مع أكثر من 2.8 مليون اختبار عبر 32 نوعا حقيقيات النواة والعديد من الميكروبات. تمكنك فحوصات TaqMan Gene Expression من الحصول على نتائج سريعة دون إضاعة الوقت في تحسين بادئات SYBR Green وعدم قضاء وقت إضافي في الجري وتحليل منحنيات الذوبان. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix هو الحل المثالي للكاشف عندما تحتاج إلى مزيج رئيسي لتطبيقات الحمض النووي النيوكلياز المتعددة مقاس 5 بوصات. تم التحقق من صحة كواشف الأنظمة الحيوية التطبيقية باستخدام فحوصات TaqMan وأنظمة Applied Biosystems في الوقت الفعلي لضمان أداء حساس ودقيق وموثوق في كل مرة. |
| Hs00215501_m1 | TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | لتأكيد الكسر السيتوبلازمي. |
| بالحرارة | UltraPure DEPC 750024 | المياه المعالجة ب DEPC UltraPure مناسبة للاستخدام مع الحمض النووي الريبي. يتم تحضيره عن طريق الحضانة بنسبة 0.1٪ ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) ، ثم يتم تعقيمه لإزالة DEPC. تصفية معقمة. |
المراجع
- Conrad, T., Orom, U. A. Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA. Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).
- Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. RNA localization in development. Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).
- Liu, X., Fagotto, F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Science Signaling. 4 (203), (2011).
- Jansen, R. P. mRNA localization: message on the move. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).
- Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization. Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).
- Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. 150 years of the mass action law. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012(2015).
- El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy. Cancers (Basel). 8 (3), 35(2016).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer). Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).
- Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting. Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
- Taylor, J., et al. Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis. Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).
- Ayupe, A. C., et al. Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome. RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).
- Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. Bacterial Cell Wall. , Elsevier. (1994).
- Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).
- Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).
- Taylor, J., et al. Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents. Blood. 132, Supplement 1 233(2018).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
