مقالة منهجية

إنشاء نموذج بسيط وفعال للفئران لتصوير الغدة الجار درقية أثناء العملية

DOI:

10.3791/64222

⸱

أغسطس 17, 2022

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Head & Neck Cancer Translational Research of Zhejiang Province, Zhejiang Cancer Hospital, 2The Cancer Hospital of the University of Chinese Academy of Sciences (Zhejiang Cancer Hospital), 3Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حتى الآن ، فإن تطوير طرق تحديد الغدة الدرقية (PG) محدود بسبب عدم وجود نماذج حيوانية في البحوث قبل السريرية. هنا ، نؤسس نموذجا بسيطا وفعالا للفئران لتصوير PG أثناء العملية وتقييم فعاليته باستخدام جسيمات أكسيد الحديد النانوية كعامل تباين PG جديد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد الغدة الدرقية (PG) هو حاجة حرجة غير ملباة في استئصال الغدة الدرقية. يمثل تحديد PG تحديا في جراحة الغدة الدرقية لأنه مشابه في اللون للغدة الدرقية. يعد عدم وجود نماذج حيوانية فعالة في الأبحاث قبل السريرية قيدا شديدا على تطوير تقنيات تحديد PG. يسمح هذا البروتوكول بإنشاء نموذج فئران بسيط وفعال لتحديد PG. في هذا النموذج ، يتم حقن جسيمات أكسيد الحديد الأسود النانوية (IONPs) محليا في الغدة الدرقية وتنتشر بسرعة داخل الغدة الدرقية ولكن ليس PG. يمكن التعرف بسهولة على PG الملطخ سلبا والغدة الدرقية الملطخة إيجابيا بالعين المجردة دون الحاجة إلى مجاهر خارجية. يمكن تحديد موضع PG عن طريق زيادة تباين الألوان بين الغدة الدرقية و PG ، بناء على لون IONPs الأسود. نموذج الفئران هذا منخفض التكلفة ومناسب لتحديد PG ، و IONPs هي عامل تباين PG جديد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدة الجار درقية (PG) هي غدد صماء صغيرة بيضاوية الشكل تقع في عنق البشر والفقاريات الأخرى ، والتي تنتج وتفرز هرمونات الغدة الجار درقية لتنظيم وتوازن مستويات الكالسيوم والفوسفور في الدم والعظام1. عادة ما يكون لدى البشر زوجان من PG يقعان خلف فصوص الغدة الدرقية في مواقع متغيرة. يبلغ حجم PG البشري عادة 6 مم × 4 مم × 2 مم ، ويبلغ وزنه حوالي 35-40 مجم2. تؤدي إزالة أو تلف PG إلى قصور جارات الدرق (HP) ، وهو اضطراب في الغدد الصماء يتميز بنقص كلس الدم ومستويات منخفضة أو غير قابلة للكشف من هرمونات الغدة الدرقية ، والتي تسبب مجموعة واسعة من الأعراض من التشنجات الشبيهة بالتشنجات إلى الأسنان المشوهة إلى أمراض الكلى المزمنة. بعض هذه المضاعفات قاتلة (على سبيل المثال ، قصور القلب والنوبات) 3،4،5 ؛ وبالتالي ، فإن PG ضروري في تنظيم عملية التمثيل الغذائي في الجسم والحفاظ على الحياة.

HP هي واحدة من أكثر المضاعفات شيوعا بعد جراحة الرقبة الأمامية ، خاصة في استئصال الغدة الدرقية ، وهو علاج علاجي راسخ لسرطان الغدة الدرقية ، وهو أكثر أنواع سرطان الغدد الصماء شيوعا في جميع أنحاء العالم 6,7. يحدث HP بعد استئصال الغدة الدرقية في الغالب بسبب الصدمة المباشرة أو نقص التروية أو إزالة PG في الجراحة بسبب النقص الشديد في القدرة على التمييز بشكل موثوق بين PG وفصوص الغدة الدرقية والأنسجة المحيطة الأخرى (مثل الغدد الليمفاوية وجزيئات الدهون الطرفية) في الوقت الفعلي في غرفة العمليات. في عام 2021 ، أبلغ باريوس وآخرون عن متوسط معدل قسم PG بنسبة 22.4٪ في 1,114 حالة استئصال الغدة الدرقية ، وحتى الجراحين ذوي الخبرة الذين لديهم معدل خطأ لا يقل عن 7.7٪ 8. تتوافق معدلات سوء القسم المرتفعة هذه مع تقارير أخرى مماثلة9،10،11. وبالتالي ، فإن استئصال الغدة الدرقية غير الصحيح هو عامل خطر مستقل ل HP العابر والدائم بعد العملية الجراحية.

إن تطوير طرق فعالة لتحديد PG أثناء العملية يحمل المفتاح لمعالجة هذه الحاجة الطبية الحرجة غير الملباة. ومع ذلك ، فقد تم تقييده بشدة بسبب عدم وجود نماذج حيوانية في البحوث قبل السريرية. حتى الآن ، تم إجراء معظم فحوصات تحديد PG أثناء العملية على المرضى من البشر والحيوانات الكبيرة (مثل الكلاب)12 ، وهي مكلفة ويصعب الحصول على الموافقة الأخلاقية ، وتوسيع أعداد الموضوعات ، وتكرار الاختبارات. وفي الوقت نفسه ، فإن الفأر ، وهو النموذج الفقاري الأكثر استخداما في البحوث البيولوجية ، لديه PG صغير للغاية ، بحجم أقل من 1 مم13. بسبب هذا القيد ، نادرا ما تم استخدام نماذج PG للماوس في أبحاث تحديد PG أثناء العملية.

تشير هذه الورقة إلى إنشاء نموذج فئران بسيط ومباشر وفعال لدراسات تحديد PG أثناء العملية. لقد حققنا في استخدام فئران Sprague-Dawley (SD) الأصلية دون أي تعديلات جراحية أو هندسة وراثية كنموذج حيواني موثوق به لاختبار عامل تباين تصوير PG ، IONPs ، في جراحة استئصال الغدة الدرقية. يوضح نموذج الفئران هذا بنية فسيولوجية متشابهة للغاية ل PG والبيئة المكروية المحيطة بها مع البشر ، وحجم الفئران PG كبير بما يكفي ليتم اكتشافه بصريا مقارنة بتلك الموجودة في الفئران. معظم الفئران لديها PG واحد على كل جانب من الغدة الدرقية. تم إثبات بساطة وفعالية نموذج الفئران هذا من خلال إجراء تصوير PG المعزز IONP أثناء العملية في جراحة استئصال الغدة الدرقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الدراسات على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لمعهد الطب الأساسي والسرطان ، الأكاديمية الصينية للعلوم. هذه جراحة عدم البقاء على قيد الحياة.

1. الحيوان

  1. استخدم أنثى فأر SD تبلغ من العمر 6-8 أسابيع ، تزن 250 جراما ، لتصوير PG أثناء العملية.

2. التخدير

  1. قم بتشغيل جهاز التخدير.
  2. قبل البدء ، تأكد من أن مستوى الأيزوفلوران ممتلئ في مبخر التخدير. بعد ذلك ، قم بتشغيل الأكسجين واضبط معدل التدفق على 0.4-0.8 لتر / دقيقة. تحفيز التخدير مع 3-5٪ إيزوفلوران والحفاظ على 2٪ إيزوفلوران (معدل التدفق: 0.4-0.8 لتر / دقيقة).
  3. ضع فأر SD في صندوق آلة التخدير وحدد طراز القناة لبدء تخدير الحيوانات.
  4. مراقبة نشاط الفئران في المربع. عندما يقع الجرذ في غيبوبة ، انقله إلى مخروط الأنف للحفاظ على التخدير (وضع ضعيف فاقد للوعي دون منعكس الألم ومنعكس القرنية).
  5. استخدم قناع التخدير لتغطية أنف الجرذ وقم بتبديل آلة التخدير إلى وضع القناع لإبقاء الحيوان تحت التخدير أثناء الجراحة.

3. الموقف والتثبيت

  1. انقل الجرذ المخدر إلى ستارة جراحية على طاولة العمليات الجراحية. ضع وسادة تدفئة مسبقة التسخين تحت الحيوان للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء الجراحة.
  2. استخدم الأربطة المطاطية لتثبيت أطراف الفئران على طاولة العمليات. ضع وسادة أسطوانية مصنوعة من الستارة تحت كتف الجرذ لتميل رأسه للخلف ، مما يعرض منطقة الرقبة تماما.
  3. ضع مرهم الدموع الاصطناعية على كلتا عيني الفئران لمنع الجفاف أثناء التخدير.

4. إزالة الشعر

  1. ضع كريم مزيل الشعر على منطقة الرقبة: حتى الفضاء تحت الفك السفلي ، وصولا إلى عملية الخنجري ، وعلى كلا الجانبين إلى الخارج من العضلة القصية الترقوية الخشائية.
  2. بعد 3 دقائق ، امسح الشعر بلطف وكريم مزيل الشعر بمنديل.

5. التعقيم

  1. استخدم كرة قطنية Iodophor لتطهير منطقة العملية 3 مرات من منتصف الرقبة إلى المنطقة المحيطة. تطهير المنطقة التي تمت إزالة الشعر منها فقط.

6. وضع الستارة الجراحية

  1. استخدم ثنى جراحي لتغطية منطقة العملية في رقبة الفئران. الحفاظ على ثقب الستارة الجراحية محاذاة مع منطقة تطهير الحيوان.

7. شق

  1. تأكد من المستوى الجراحي للتخدير عن طريق عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم قبل إجراء الشق. بعد ذلك ، ضع الشفرة في المشرط واستخدم المشرط لعمل شق طولي في خط الوسط الأمامي لعنق الفئران. تأكد من أن طول الشق حوالي 5 سم وفقط في الأدمة.

8. تشريح الأنسجة تحت الجلد من عضلة عنق الرحم الأمامية

  1. ارفع الجلد على جانبي الشق.
  2. استخدم مقصا للقطع طوليا على طول خط عنق الرحم.
  3. استخدم ملقط لفصل العضلة القصية اللامية والعضلة القصية الدرقية.

9. إصلاح عضلات الرقبة الأمامية لكلا الجانبين

  1. استخدم ملقط الأوعية الدموية لتثبيت العضلة القصية اللامية المنفصلة وعضلة الغدة الدرقية القصية أمام الرقبة وسحب الأنسجة المثبتة للخارج.
  2. استخدم المبعدة أو الإبرة لتمرير الخيط (3-0 #) عبر الأنسجة المثبتة ، وصنع عقدة ، وثبت الخيط على الستارة الجراحية لطاولة العمليات.

10. توطين الغدة الدرقية

  1. حدد موقع الغضروف الدرقي والغضروف الحلقي كحد أعلى في منطقة العملية. تحديد الغضروف الدرقي بناء على شكل الدرع والغضروف الحلبي بناء على شكل حلقته.
  2. حدد موقع القصبة الهوائية باعتبارها الحد السفلي في منطقة العملية. ابحث عن القصبة الهوائية في الجزء الأمامي والأوسط من الرقبة ، بناء على شكل حلقة الغضروف الأنبوبية.
  3. حدد موقع الغدة الدرقية بين الحدود العليا والسفلى - غدة حمراء على شكل فراشة على الجانب الآخر من القصبة الهوائية.

11. التعريف البصري ل PG

  1. حدد موقع PG على الجانبين العلوي والخارجي للغدة الدرقية. ابحث عن اثنين من PG في شكل مغزلي يبلغ طوله حوالي 1.2-2 مم وعرضه 1.0-1.5 مم وهما ضارب إلى الحمرة ولكنهما أخف من الغدة الدرقية المحيطة بحدود معينة.
  2. التقط صورة أمامية ل PG مع القصبة الهوائية والغدة الدرقية والحنجرة لمقارنة تأثيرات IONP كميا قبل الحقن وبعده.
  3. قم بتشريح الجزء الخلفي من المريء ، ثم استخدم المبعدة لكشف الجانب الأيمن من PG. التقط صورة على الجانب الأيمن من PG مع الغدة الدرقية والقصبة الهوائية.
  4. قم بتبديل المبعدة لكشف الجانب الآخر من PG والتقط صورة على الجانب الأيسر لهم مع الغدة الدرقية والقصبة الهوائية.

12. حقن الغدة الدرقية من IONPs

  1. استخدم حقنة الأنسولين لحقن 10 ميكرولتر من معلق IONPs محليا (20 مجم / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات) في وسط الغدة الدرقية. اضغط برفق على موقع الحقن بشاش لمدة 5 ثوان.

13. تحديد PG بعد حقن IONPs

  1. بعد الحقن ، لاحظ الانتشار السريع للأيونات داخل الغدد الدرقية ولكن ليس PG ، لأنه يلطخ PG سلبا ويميزها عن الغدة الدرقية المحيطة.
  2. التقط صورة أمامية ل PG الملطخ سلبا مع القصبة الهوائية والغدة الدرقية والحنجرة.
  3. التقط صورا على الجانبين الأيسر والأيمن ل PG الملطخة سلبا باستخدام نفس الإجراءات المذكورة أعلاه.

14. استئصال الحلق والقصبة الهوائية مع الغدة الدرقية و PG

  1. بمجرد استنشاق الفئران للإيزوفلوران الزائد (5٪ إيزوفلوران لأكثر من 5 دقائق) وتخضع لتخدير عميق ، يتم القتل الرحيم لهم عن طريق الحقن داخل القلب بمقدار 0.5 مل من محلول كلوريد البوتاسيوم المشبع.
  2. بعد الوفاة ، قم بإزالة الحلق والقصبة الهوائية والغدة الدرقية و PG.
  3. تحت غطاء الدخان ، ضع عينات الحلق والقصبة الهوائية والغدة الدرقية و PG التي تمت إزالتها في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة.

15. دراسات التشريح المرضي

  1. تجفيف الأنسجة وتضمينها في البارافين. شريحة إلى أقسام سميكة 5 ميكرومتر. تخبز المقاطع على حرارة 37 درجة مئوية في فرن طوال الليل وعلى حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. قم بتلطيخ الأقسام بالهيماتوكسيلين واليوزين (H&E) بعد الغسيل لمدة 3 × 5 دقائق بنسبة 75٪ و 95٪ وكحول متدرج بنسبة 100٪ وغسل بالماء في درجة حرارة الغرفة.
  3. اطلب من أخصائيي علم الأمراض فحص الأقسام الملطخة ب H& E تحت المجهر الضوئي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا النموذج الحيواني ، قمنا بشق عنق فأر SD جراحيا لكشف القصبة الهوائية والحنجرة والأنسجة المحيطة. ثم ، كانت الغدة الدرقية موجودة بصريا على جانبي القصبة الهوائية. إنه على شكل فراشة وحجمه حوالي 3 مم × 5 مم. عادة ما يوجد زوج من PG في الجزء العلوي من الغدة الدرقية ، ولونها مشابه جدا لفصوص الغدة الدرقية ، مما يجعل من الصعب للغاية تمييزها بالعين المجردة (الشكل 1).

بعد الحقن ، ينتشر عامل التباين (الشكل 1 والشكل 2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظهر تقنية التصوير السلبي الموجهة ب IONPs للفئران PG باستخدام IONPs السوداء ، والتي تم حقنها محليا في وسط الغدة الدرقية وانتشرت داخل الغدة الدرقية ولكن ليس PG. إنه يتيح التعرف الواضح على PG بالعين المجردة دون مساعدة من أي مجهر. على الرغم من أن الفئران المعدلة وراثيا مع بروتين الفلورسنت الأخضر المعبر عنه بشكل انتقائي في PG قد تم الإبلاغ عنها13 ، فإن النموذج الموصوف في هذه الورقة أكثر وضوحا في الأداء. يستغرق الأمر ~ 1 دقيقة فقط لكل فأر بعد الحقن ، ويمكن ملاحظة فرق واضح بين الغدة الدرقية و PG بالعين ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.G. و W.Z. هما مخترعان مشاركان لطلب براءة اختراع مقدم من مستشفى السرطان التابع لجامعة الأكاديمية الصينية للعلوم (مستشفى تشجيانغ للسرطان) بناء على المشروع. يعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC) (82172598) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ ، الصين (LZ22H310001) ، ومشروع تدريب المواهب الصحية 551 التابع للجنة الصحة بمقاطعة تشجيانغ ، الصين ، ومشروع العلوم والتكنولوجيا الطبية والصحية لمقاطعة تشجيانغ ، الصين (2021KY110).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكحوللي فنغ9400820067
آلة التخديرRWD شركةR520IEرقم الآلة
شفرةDaopianTB-JZ-10 #
وسادةمن صنع أنفسنا
كريم إزالة الشعرNairTMG-001
مقياس إلكترونيهونغ شينغداCN-HXD2
إيوزينثيرمو فيشر (والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية).C0105S-2
إريثروميسينشوانغ جي (بكين ، الصين)200409
شاشفولانYY0331-2006
وسادة تسخينجوهون (شنتشن ، الصين)JH-36-2006
هيماتوكسيلينثيرمو فيشر (والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية).C0105S-1
إبرة حقن الأنسولينJiangyin Nanquanجزيء كبير20170702
كرة قطنية يودوفورHOYON19-6007
محلول الجسيمات النانوية لأكسيد الحديدZhongke Leiming Technology (بكين ، الصين)Mag9110-05
isofluraneSigma Aldrich (سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية).حامل إبرة 21112801
طاولة التشغيل MeijunMH0587
BioJaneBJ-P-M
محلول بارافورمالدهيدBiosharp21269333
المطاطG-CLONEbr / > XT41050
آلة المسحالضوئي OlympusSlideview VS200
مقبض سكين جراحيSPHC-0676
علاء الدينS3052-06-1EA
ضام جراحيTOCYTO18-4010
مقص جراحيمنشفةSPHC-0795
على طول التكنولوجياYCKJ-RJ-036205
خياطةEthiconSA84G
خياطة مع إبرةJinhuan (شنغهاي ، الصين)ملقط الأوعية الدموية F301
جنبا إلى جنب مع التكنولوجياYCKJ-RJ-016218
حمام مائي الشريحة مجففهوا سو (جينهوا ، الصين)HS-1145
أسطوانية < جراحية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cope, O., Donaldson, G. A. Relation of thyroid and parathyroid glands to calcium and phosphorus metabolism. Study of a case with coexistent hypoparathyroidism and hyperthyroidism. The Journal of Clinical Investigation. 16 (3), 329-341 (1937).
  2. Mansberger, A. R., Wei, J. P. Surgical embryology and anatomy of the thyroid and parathyroid glands. Surgical Clinics of North America. 73 (4), 727-746 (1993).
  3. Koch, A., Hofbeck, M., Dorr, H. G., Singer, H. Hypocalcemia-induced heart failure as the initial symptom of hypoparathyroidism. Zeitschrift für Kardiologie. 88 (1), 10-13 (1999).
  4. Shoback, D. M., et al. Presentation of hypoparathyroidism: etiologies and clinical features. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (6), 2300-2312 (2016).
  5. Arneiro, A. J., et al. Self-report of psychological symptoms in hypoparathyroidism patients on conventional therapy. Archives of Endocrinology Metabolism. 62 (3), 319-324 (2018).
  6. Olson, E., Wintheiser, G., Wolfe, K. M., Droessler, J., Silberstein, P. T. Epidemiology of thyroid cancer: a review of the national cancer database, 2000-2013. Cureus. 11 (2), 4127(2019).
  7. Du, L., et al. Epidemiology of thyroid cancer: incidence and mortality in China, 2015. Frontiers in Oncology. 10, 1702(2020).
  8. Barrios, L., et al. Incidental parathyroidectomy in thyroidectomy and central neck dissection. Surgery. 169 (5), 1145-1151 (2021).
  9. Sitges-Serra, A., et al. Inadvertent parathyroidectomy during total thyroidectomy and central neck dissection for papillary thyroid carcinoma. Surgery. 161 (3), 712-719 (2017).
  10. Sakorafas, G. H., et al. Incidental parathyroidectomy during thyroid surgery: an underappreciated complication of thyroidectomy. World Journal of Surgery. 29 (12), 1539-1543 (2005).
  11. Sahyouni, G., et al. Rate of incidental parathyroidectomy in a pediatric population. OTO Open. 5 (4), (2021).
  12. Erickson, A. K., et al. Incidence, survival time, and surgical treatment of parathyroid carcinomas in dogs: 100 cases (2010-2019). Journal of the American Veterinary Medical Association. 259 (11), 1309-1317 (2021).
  13. Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010(2017).
  14. Soulsby, S. N., Holland, M., Hudson, J. A., Behrend, E. N. Ultrasonographic evaluation of adrenal gland size compared to body weight in normal dogs. Veterinary Radiology & Ultrasound. 56 (3), 317-326 (2015).
  15. Zheng, W. H., et al. Biodegradable iron oxide nanoparticles for intraoperative parathyroid gland imaging in thyroidectomy. PNAS Nexus. 1 (3), 087(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Thyroid SurgeryPG IdentificationIron Oxide NanoparticlesContrast AgentThyroid GlandNegative StainingAutofluorescence ImagingPreclinical Research

مقالات ذات صلة