مقالة منهجية

تحسين ATAC-Seq لأبحاث علم التخلق السرطاني

DOI:

10.3791/64242

⸱

يونيو 30, 2022

 ,  ,  ,  , 
1University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, 2Dana-Farber Cancer Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq هي طريقة تسلسل الحمض النووي التي تستخدم ترانسبوزاز الطافر مفرط النشاط ، Tn5 ، لتعيين التغييرات في إمكانية الوصول إلى الكروماتين بوساطة عوامل النسخ. يتيح ATAC-seq اكتشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء التغيرات المظهرية في الخلايا السرطانية. يحدد هذا البروتوكول إجراءات التحسين ل ATAC-seq في أنواع الخلايا الظهارية ، بما في ذلك الخلايا السرطانية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع التسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) يسبر إمكانية الوصول إلى الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) باستخدام ترانسبوزاز Tn5 مفرط النشاط. يقوم Tn5 بقطع وربط المحولات للتسلسل عالي الإنتاجية داخل مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها. في الخلايا حقيقية النواة، يحزم الحمض النووي الجينومي في الكروماتين، وهو مركب من الحمض النووي (DNA) والهستونات والبروتينات الأخرى، التي تعمل كحاجز مادي أمام آلية النسخ. استجابة للإشارات الخارجية ، تقوم عوامل النسخ بتجنيد مجمعات إعادة تشكيل الكروماتين لتمكين الوصول إلى آلية النسخ لتنشيط الجينات. لذلك ، فإن تحديد مناطق الكروماتين المفتوحة مفيد عند مراقبة أنشطة المحسن والمروج الجيني أثناء الأحداث البيولوجية مثل تطور السرطان. نظرا لأن هذا البروتوكول سهل الاستخدام وله متطلبات إدخال خلية منخفضة ، فقد تم اعتماد ATAC-seq على نطاق واسع لتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة في أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك الخلايا السرطانية. للحصول على البيانات بنجاح ، يجب مراعاة العديد من المعلمات عند إعداد مكتبات ATAC-seq. من بينها ، يعد اختيار المخزن المؤقت لتحلل الخلية ، ومعايرة إنزيم Tn5 ، وحجم بدء الخلايا أمرا بالغ الأهمية لإعداد مكتبة ATAC-seq في الخلايا السرطانية. التحسين ضروري لإنشاء بيانات عالية الجودة. هنا ، نقدم وصفا تفصيليا لطرق تحسين ATAC-seq لأنواع الخلايا الظهارية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد إمكانية الوصول إلى الكروماتين مطلبا رئيسيا لتنظيم التعبير الجيني على نطاق الجينوم1. غالبا ما ترتبط التغييرات في إمكانية الوصول إلى الكروماتين بالعديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان2،3،4. على مر السنين ، تم تطوير العديد من التقنيات لتمكين الباحثين من استكشاف مشهد الكروماتين عن طريق رسم خرائط لمناطق إمكانية الوصول إلى الكروماتين. بعضها يشمل DNase-seq (تسلسل المواقع شديدة الحساسية DNase I)5 ، FAIRE-seq (عزل العناصر التنظيمية بمساعدة الفورمالديهايد)6 ، MAPit (بروتوكول إمكانية الوصول إلى ميثيل ترانسفيراز للقوالب الفردية)7 ، ومحور هذه الورقة ، ATAC-seq (مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase)8. يرسم DNase-seq خرائط للمناطق التي يمكن الوصول إليها من خلال استخدام ميزة رئيسية ل DNase ، وهي الهضم التفضيلي للحمض النووي العاري الخالي من الهستونات والبروتينات الأخرى مثل عوامل النسخ5. يستخدم FAIRE-seq ، على غرار ChIP-seq ، تشابك الفورمالديهايد وصوتنة ، باستثناء عدم وجود ترسيب مناعي ، ويتم عزل المناطق الخالية من النيوكليوسوم عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم6. تستخدم طريقة MAPit GC methyltransferase لفحص بنية الكروماتين بدقة جزيء واحد7. يعتمد ATAC-seq على ناقل الحركة مفرط النشاط ، Tn58. يرتبط ترانسبوزاز Tn5 بشكل تفضيلي بمناطق الكروماتين المفتوحة ويدخل محولات التسلسل في المناطق التي يمكن الوصول إليها. يعمل Tn5 من خلال آلية "قص ولصق" بوساطة الحمض النووي ، حيث يرتبط الترانسبوزاز المحمل مسبقا بالمحولات بمواقع الكروماتين المفتوحة ، ويقطع الحمض النووي ، ويربط المحولات8. يتم استرداد المناطق المرتبطة ب Tn5 عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات التي تلتصق بهذه المحولات. يتطلب FAIRE-seq و DNase-seq كمية كبيرة من المواد الأولية (~ 100000 خلية إلى 225000 خلية) وخطوة إعداد مكتبة منفصلة قبل التسلسل9. من ناحية أخرى ، فإن بروتوكول ATAC-seq بسيط نسبيا ويتطلب عددا صغيرا من الخلايا (<50000 خلية)10. على عكس تقنيات FAIRE-seq و DNase-seq ، فإن إعداد مكتبة التسلسل ل ATAC-seq سهل نسبيا ، حيث يتم بالفعل تمييز عينة الحمض النووي المعزولة بمحولات التسلسل بواسطة Tn5. لذلك ، لا يلزم سوى خطوة تضخيم PCR مع البادئات المناسبة لإكمال إعداد المكتبة ، ولا يلزم تنفيذ خطوات المعالجة السابقة مثل الإصلاح النهائي وربط المحول ، وبالتالي توفير الوقت11. ثانيا ، يتجنب ATAC-seq الحاجة إلى تحويل ثنائي الكبريتيت واستنساخه وتضخيمه باستخدام مواد أولية خاصة بالمنطقة مطلوبة ل MAPit7. بسبب هذه المزايا ، أصبح ATAC-seq طريقة شائعة للغاية لتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة. على الرغم من أن طريقة ATAC-seq بسيطة ، إلا أن الخطوات المتعددة تتطلب التحسين للحصول على بيانات عالية الجودة وقابلة للتكرار. تناقش هذه المخطوطة إجراءات التحسين لإعداد مكتبة ATAC-seq القياسية ، ولا سيما تسليط الضوء على ثلاثة معلمات: (1) تكوين المخزن المؤقت للتحلل ، (2) تركيز ترانسبوزاز Tn5 ، و (3) رقم الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الورقة أمثلة على البيانات من ظروف التحسين باستخدام كل من الخلايا الظهارية الملتصقة السرطانية وغير السرطانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الاستعدادات قبل بدء التجربة

  1. تحضير مخزون العازلة للتحلل.
    ملاحظة: يمكن أن يكون المخزن المؤقت الأمثل للعزل النووي مختلفا لكل نوع من الخلايا. نوصي باختبار كل من المخزن المؤقت منخفض التوتر المستخدم في الورقة الأصلية8 والمخزن المؤقت CSK12,13 لكل نوع خلية باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.
    1. لتحضير محلول منخفض التوتر (محلول غرينليف)، امزج 10 ملي مول من Tris-HCl pH 7.4، و10 mM NaCl، و3 mM MgCl2، و0.1٪ NP-40.
    2. لتحضير محلول CSK ، امزج 10 mM PIPES pH 6.8 و 100 mM NaCl و 300 mM سكروز و 3 mM MgCl2 و 0.1٪ Triton X-100.
  2. تأكد من أن ظروف زراعة الخلايا هي الأمثل ؛ فحص الخلايا تحت المجهر الضوئي للتأكد من عدم وجود مستويات مرتفعة من موت الخلايا المبرمج.
  3. قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي للسماح له بالوصول إلى 4 درجات مئوية.

2. حصاد الخلايا

  1. استنشاق الوسائط من ثقافة الخلايا عند التقاء <80٪. تزرع الخلايا عادة في طبق 35 مم أو 60 مم ، بناء على عدد الخلايا المطلوبة والعلاجات وما إلى ذلك.
  2. اغسل الخلايا ب 1 مل أو 3 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. أضف 0.5 مل أو 1 مل من التربسين واحتضانه لمدة 2-3 دقائق (حسب أنواع الخلايا). استخدم بعناية ماصة 1 مل لخلطها جيدا.
  4. أضف 1 مل أو 2 مل من الوسائط إلى اللوحة واخلطها جيدا. نقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي للخلايا في أنبوب سعة 15 مل لمدة 3 دقائق عند 300 × جم.
    ملاحظة: يوصى باستخدام دوار الجرافة المتأرجح لتقليل فقد الخلايا.
  5. استنشاق الوسائط وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل أو 2 مل من المتوسط.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان تحضير محلول متجانس أحادي الخلية. بالنسبة للأنسجة، يمكن استخدام الخالط Dounce لتجانس الأنسجة وتقليل كتل الخلايا الكبيرة أو المجاميع. تتطلب بعض الأنسجة الترشيح (على سبيل المثال ، مصافي الخلايا) و / أو فرز خلايا FACS لعزل الخلايا القابلة للحياة والحصول على محلول خلية واحدة.
  6. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام عداد خلية آلي (جدول المواد).
  7. جهاز طرد مركزي لحجم الخلية المطلوب (على سبيل المثال ، حجم يحتوي على 1 × 106 خلايا بناء على عدد الخلايا) عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  8. أعد تعليق حبيبات الخلية التي تحتوي على 1 × 106 خلايا في 1 مل من PBS البارد.
    ملاحظة: إذا كانت أرقام الخلايا أقل من 1 × 106 خلايا ، فقم بتقليل حجم PBS البارد لتحضير محلول الخلية بنفس التركيز (1 × 106 خلايا / مل).

3. تحلل الخلية

  1. نقل 25 ميكرولتر (= 2.5 × 104 خلايا) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية وتخلص بعناية من المادة الطافية
    ملاحظة: يوصى باستخدام دوار الجرافة المتأرجح لتقليل فقد الخلايا. اترك حوالي 3 ميكرولتر من المادة الطافية لضمان عدم التخلص من الخلايا.
  2. أضف 25 ميكرولتر من محلول التحلل وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب اللطيف لأعلى ولأسفل. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق
  3. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية وتخلص بعناية من المادة الطافية.
    ملاحظة: يوصى باستخدام دوار الجرافة المتأرجح لتقليل فقد الخلايا. اترك حوالي 3 ميكرولتر من المادة الطافية لضمان عدم التخلص من الخلايا.

4. علامة Tn5

  1. أعد تعليق الحبيبات على الفور في 25 ميكرولتر من خليط تفاعل Tn5. خليط تفاعل Tn5 هو كما يلي: 12.5 ميكرولتر من 2x Tagmentation DNA buffer (TD buffer) ، 1.25-5 ميكرولتر من Tn5 transposase ، و 11.25-7.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
    ملاحظة: التركيز القياسي ل Tn5 هو 2.5 ميكرولتر لخلايا 2.5 × 104 .
  2. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: اخلطي المحلول كل 10 دقائق.

5. تنقية الحمض النووي

ملاحظة: التنقية مطلوبة قبل التضخيم. تتم تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية MinElute PCR (جدول المواد).

  1. أضف 5 ميكرولتر من 3 م أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.2).
  2. أضف على الفور 125 ميكرولتر من Buffer PB واخلطه جيدا.
  3. اتبع بروتوكول مجموعة تنقية PCR بدءا من الخطوة 2.
    1. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع سعة 2 مل.
    2. ضع العينة على عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 17900 × جم عند RT.
    3. تخلص من التدفق من خلال وضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع.
    4. أضف 750 ميكرولتر من Buffer PE إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 17,900 x g عند RT.
    5. تخلص من التدفق من خلال وضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع.
    6. قم بالطرد المركزي لعمود الدوران لمدة 5 دقائق لتجفيف الغشاء تماما.
    7. تخلص من التدفق من خلال وضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 مل.
    8. تخلص من شظايا الحمض النووي باستخدام 10 ميكرولتر من Buffer EB.
    9. دع العمود يقف لمدة 1 دقيقة في RT.
    10. جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة عند 17,900 × جم في RT لتقليب الحمض النووي.

6. تضخيم PCR

ملاحظة: يعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي المنقول (الموسوم) ضروريا للتسلسل. تم استخدام محولات مجموعة Nextera (جدول المواد) في هذا المثال. يتم سرد البادئات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1.

  1. قم بإعداد تفاعل PCR التالي في أنابيب PCR سعة 200 ميكرولتر (50 ميكرولتر لكل عينة). خليط تفاعل PCR هو كما يلي: 10 ميكرولتر من الحمض النووي الممسوغ (الخطوة 5.) ، 2.5 ميكرولتر من محول 25 مللي متر 1 ، 2.5 ميكرولتر من محول 25 مللي متر 2 ، 25 ميكرولتر من مزيج PCR الرئيسي 2x ، و 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز
  2. تنفيذ برنامج تضخيم PCR الجزء 1 (الجدول 2).
    ملاحظة: للتضخيم الأولي ، يتم استخدام نفس الظروف لجميع العينات باستخدام دورة حرارية قياسية.
  3. qPCR في الوقت الحقيقي (إجمالي 14.5 ميكرولتر لكل عينة)
    1. باستخدام 5 ميكرولتر من المنتج من الجزء 1 من تضخيم PCR (الخطوة 6.2.) ، قم بإعداد التفاعل التالي ، هذه المرة بما في ذلك ذهب SYBR والكشف في جهاز PCR في الوقت الفعلي.
    2. تحضير خليط تفاعل PCR على النحو التالي: 5 ميكرولتر من منتج PCR من الخطوة 6.2 ، 0.75 ميكرولتر من ذهب SYBR (1000x مخفف) ، 5 ميكرولتر من مزيج PCR الرئيسي 2x ، و 3.75 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
      ملاحظة: يتم تحديد أرقام الدورات الدقيقة لتضخيم المكتبة قبل الوصول إلى التشبع لكل عينة بواسطة qPCR (الجدول 3) لتقليل GC وتحيز الحجم في PCR10. تم تخفيف SYBR Gold بالماء الخالي من النيوكلياز. لصنع المحلول المخفف ، تمت إضافة 1 ميكرولتر من SYBR Gold (تركيز المخزون 10000x) إلى 999 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. وقت تشغيل RT-qPCR المذكور في الجدول 3 حوالي 60 دقيقة.
  4. حدد العدد المطلوب من دورات PCR الإضافية باستخدام معلمات التشغيل من الخطوة 6.3.
    1. عدد الدورات = 1/4 الحد الأقصى لشدة التألق (المشبعة) (عادة 3 أو 4 دورات PCR)
  5. برنامج تضخيم PCR الجزء 2 (الحجم = 45 ميكرولتر ؛ الجدول 4): بمجرد تحديد رقم الدورة ، قم بإعداد PCRs مع دورات إضافية محسوبة في الخطوة 6.4.1. على سبيل المثال ، إذا كان رقم الدورة المحسوب هو 3 ، فقم بإعداد 3 دورات في البرنامج أدناه. سيكون إجمالي الدورات 8 (5 في الخطوة 6.2 ، بالإضافة إلى 3 دورات إضافية في الخطوة 6.5.)

7. تنقية الخرز

ملاحظة: هنا ، تم استخدام حبات AMPure XP (جدول المواد).

  1. إلى منتجات PCR التي تم تضخيمها في الخطوة السابقة ، أضف 150 ميكرولتر من الخرز في RT.
    ملاحظة: يمكن استخدام حبات AMPure14 محلية الصنع في هذه العملية.
  2. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  3. ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة 5 دقائق.
  4. قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
  5. اغسل الخرز ب 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪.
    ملاحظة: يجب تحضير 80٪ من الإيثانول طازجا.
  6. كرر الخطوة 7.4.
  7. قم بإزالة الإيثانول تماما.
  8. جفف العينات في الهواء لمدة 10 دقائق في RT.
  9. أعد التعليق باستخدام 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف (10 مللي مول Tris-HCL pH 8.0).
  10. كرر تنقية الخرز (الخطوات 7.1.-7.9.) لتقليل التلوث التمهيدي بشكل أكبر.

8. تركيز الحمض النووي وفحص الجودة

  1. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات قياس كمية الحمض النووي (جدول المواد).
  2. تحقق من شظايا الحمض النووي المضخمة عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي باستخدام SYBR Gold (0.5x TBE ، 1.5٪ هلام الأغاروز) أو نظام الرحلان الكهربائي الآلي (على سبيل المثال ، TapeStation ، المحلل الحيوي).

9. التسلسل

  1. قم بإجراء تسلسل عالي الإنتاجية باستخدام عينات الحمض النووي المضخمة12,13.
    ملاحظة: عينات الحمض النووي المضخمة جاهزة للتسلسل عالي الإنتاجية. للاحتفاظ بمعلومات شظايا الحمض النووي النووي ، يوصى بالتسلسل المزدوج على التسلسل أحادي النهاية. يشير كلا طرفي شظايا الحمض النووي إلى مكان ارتباط الترانسبوزاز. لرسم خرائط لمناطق الكروماتين المفتوحة ، عادة ما تكون 30 مليون قراءة / عينة كافية.

10. تحليل البيانات

  1. فلترة البيانات استنادا إلى جودة المكالمة الأساسية: اضبط الحد الأدنى لمتوسط نقاط الجودة الأساسية على 20 (دقة 99٪).
  2. تشذيب المحول: قم بإزالة تسلسلات المحول باستخدام أداة مناسبة.
    ملاحظة: تم استخدام أداة التغليف Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) لإزالة تسلسلات المحول. بالنسبة لمكتبات ATAC-seq التي أعدتها Illumina Tn5 ، يتم استخدام التسلسل التالي كتسلسل محول: CTGTCTCTTATACACATCT. يتم تعيين الحد الأدنى لطول التسلسل للتعرف على تلوث المحول على 5.
  3. رسم خرائط الجينوم: قم بتعيين القراءات إلى الجينوم المناسب باستخدام Bowtie باستخدام المعلمات التالية "-I 0 -X 2000 -m 1"15. فيما يلي مثال على جودة الخرائط من خلايا سرطان الثدي القاعدية MDA-MB-231:
    يقرأ مع محاذاة واحدة على الأقل تم الإبلاغ عنها: 52.79٪
    القراءات التي فشلت في المحاذاة: 13.10٪
    يقرأ مع المحاذاة التي تم قمعها بسبب -m: 34.11٪
  4. إلغاء البيانات المكررة: ضع علامة على تكرارات PCR بواسطة أدوات Picard16.
  5. إنشاء ملف تغطية الجينوم لتصور البيانات: تحويل القراءات المزدوجة غير المكررة إلى أجزاء قراءة أحادية النهاية. يتم الحصول على مسارات تغطية الجينوم باستخدام GenomeCoverageBed من أدوات السرير17.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للحصول على بيانات ATAC-seq ناجحة وعالية الجودة ، من المهم تحسين الظروف التجريبية. يمكن فصل إعداد مكتبة ATAC-seq إلى خمس خطوات رئيسية (الشكل 1) ، وهي تحلل الخلايا ، ووضع العلامات (التجزئة وإدخال المحول بواسطة Tn5) ، وتنقية الحمض النووي الجينومي ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتحليل البيانات. كعملية أولية ، يجب أولا تحسين المخزن المؤقت لتحلل الخلية (العزل النووي) لكل نوع من الخلايا. تم استخدام المخزن المؤقت منخفض التوتر الموصوف في ورقة ATAC-seqالأصلية 8 أو المخزن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام ATAC-seq على نطاق واسع لرسم خرائط مناطق الكروماتين المفتوحة والنشطة. غالبا ما يكون تقدم الخلايا السرطانية مدفوعا بالتغيرات الجينية وإعادة البرمجة اللاجينية ، مما يؤدي إلى تغيير إمكانية الوصول إلى الكروماتين والتعبير الجيني. يظهر مثال على إعادة البرمجة هذه أثناء الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة (EMT) وعمليتها العكسية ، الانتقال من اللحمة المتوسطة إلى الظهارة (MET) ، والتي تعرف بأنها عمليات إعادة برمجة خلوية رئيسية أثناء ورم خبيثالورم 30. مثال آخر هو اكتساب مقاومة للأدوية ضد العلاج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح مالية ذات صلة أو مادية تتعلق بالبحث الموصوف في هذه الورقة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونعرب عن امتناننا لمرفق UND Genomics Core للمساعدة التقنية المتميزة.

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [P20GM104360 إلى M.T. ، P20 GM104360 إلى AD] وأموال البدء المقدمة من كلية الطب والعلوم الصحية بجامعة نورث داكوتا ، قسم العلوم الطبية الحيوية [إلى M.T.].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1615-5500طبيعي
10 & نصائح L XL TipOneالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1120-3810مفلترة ومنخفضة الاحتفاظ
100 & مايكرو ؛ نصائح L XL TipOne RPTالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1182-1830مفلترة ومنخفضة الاحتفاظ
100 & مايكرو ؛ نصائح L XL TipOneالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1120-1840مفلترة ومنخفضة الاحتفاظ. مشطوفة الصف
15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية Corning352096
20 & L TipOne RPT نصائحالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1183-1810مفلترة ومنخفضة الاحتفاظ
200 & مايكرو ؛ L TipOne نصائح RPTالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1180-8810المركزي المفلترة ومنخفضة
الاحتفاظ 50 ملFisherbrand06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010التحليل الجيني
الصف يتم الحصول على جميع خطوط الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة من ATCCATCC
Allegra X-30R أجهزة الطردالمركزي Beckman Coulter364658SX2415
AMPure XP الخرزBeckman CoulterA63881طقم تنقية الخرزة
CellDrop Cell CounterDeNovixCellDrop FLCell counter
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra ، اللامائي ، & ge ؛ 99٪ (معايرة بالتحليل الحجمي)
EGTAMilliporeSigmaE3889
الإيثانول 100٪ThermoFisher ScientificAC615100020اللامائي ؛ فيشر ساينتفيك - منتجات التعقيم من مختبرات ديكون
مصل الأبقار الجنينية - تم اختبارهمن قبل TET R& D SystemsS10350Triple 0.1 & micro; م مرشح
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4.5 جم / لتر D-glucose ؛ [+] لام-الجلوتامين; [-] بيروفات الصوديوم
جيبكو PBS 1xThermoFisher Scientific10010023درجة الحموضة 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0.25٪) ، الفينول الأحمر
الجلسرينIBI Scientific56-81-5
GlycineMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2< / sub>MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR طقم تنقيةQiagen28004طقم تنقية الحمض النووي
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra ، & ge 98٪ (حمضي) ، كريات (لامائية)
NEBNext عالية الدقة 2x PCR ماستر ميكسنيو إنجلاند بيولابزM0541
Nextera طقم تحضير عينة الحمض النوويIlluminaFC-121-10302x TD و Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896للبيولوجيا الجزيئية
نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسلBioRad1855484نظام CFX384 في الوقت الحقيقي. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance معتمد ، ومناسب لزراعة الخلايا
Qubit dsDNA HS Assay KitThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen ؛ طقم كمية الحمض النووي
أنابيب فحص QuibitThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
أسيتات الصوديوممحليةالصنع -درجة الحموضة 5.2
السكروزIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Green Supermix ، 1.25 ملBioRad1708882
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
TempAssure 0.2 مل PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Flex-free ، طبيعي ، بولي بروبيلين
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700أحادي الشقة. قاعدة البولي بروبيلين
الطبيعية تريسMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003
Tricpan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra ، سائل لزج
WaterMilliporeSigmaW3500معقم مفلتر ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا
الدقيقة أنابيب الطرد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  2. Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
  3. Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732(2021).
  4. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
  5. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  6. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  7. Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
  8. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  9. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1(2015).
  11. Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687(2021).
  12. Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516(2019).
  13. Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36(2016).
  14. Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  15. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25(2009).
  16. Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  19. Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
  20. Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059(2018).
  21. Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072(2019).
  22. Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672(2019).
  23. Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
  24. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  25. Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
  26. Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
  27. McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
  28. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
  29. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  30. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  31. Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786(2021).
  32. Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
  33. Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Chromatin AccessibilityTn5 TransposaseLibrary PreparationOpen Chromatin RegionsCell Lysis BufferPCR AmplificationNucleosome Free FragmentsPeak Annotation

مقالات ذات صلة