يصف هذا البروتوكول تحريض الالتهام الذاتي في الجسم الدهني ليرقات ذبابة الفاكهة عن طريق استنفاد المغذيات ويحلل التغيرات في الالتهام الذاتي باستخدام سلالات الذباب المعدلة وراثيا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل الالتهام الذاتي الناجم عن الجوع في الجسم الدهني ليرقات ذبابة الفاكهة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الالتهام الذاتي هو عملية الهضم الذاتي الخلوية. يسلم البضائع إلى الجسيمات الحالة للتحلل استجابة للضغوط المختلفة ، بما في ذلك الجوع. يرتبط خلل الالتهام الذاتي بالشيخوخة والأمراض البشرية المتعددة. يتم الحفاظ على آلية الالتهام الذاتي بشكل كبير - من الخميرة إلى البشر. يوفر الجسم الدهني اليرقي لذبابة الفاكهة ، وهو نظير للكبد الفقاري والأنسجة الدهنية ، نموذجا فريدا لمراقبة الالتهام الذاتي في الجسم الحي. يمكن أن يحدث الالتهام الذاتي بسهولة عن طريق تجويع المغذيات في جسم الدهون اليرقية. يتم حفظ معظم الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي في ذبابة الفاكهة. تم تطوير العديد من سلالات الذباب المعدلة وراثيا التي تعبر عن علامات الالتهام الذاتي الموسومة ، مما يسهل مراقبة الخطوات المختلفة في عملية الالتهام الذاتي. يتيح التحليل النسيلي مقارنة وثيقة لعلامات الالتهام الذاتي في الخلايا ذات الأنماط الجينية المختلفة في نفس قطعة الأنسجة. يفصل البروتوكول الحالي إجراءات (1) توليد استنساخ جسدي في جسم الدهون اليرقية ، (2) تحفيز الالتهام الذاتي عن طريق تجويع الأحماض الأمينية ، و (3) تشريح جسم الدهون اليرقية ، بهدف إنشاء نموذج لتحليل الاختلافات في الالتهام الذاتي باستخدام علامة البلعمة الذاتية (GFP-Atg8a) والتحليل النسيلي.
المقدمة
الالتهام الذاتي هو عملية "الأكل الذاتي" التي تسببها ضغوط مختلفة ، بما في ذلك تجويع الأحماض الأمينية1. الالتهام الذاتي الكبير (المشار إليه فيما يلي باسم الالتهام الذاتي) هو أكثر أنواع الالتهام الذاتي المدروسة جيدا ويلعب دورا لا غنى عنه في الحفاظ على التوازن الخلوي2. يرتبط خلل الالتهام الذاتي بالعديد من الأمراض البشرية3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي هي أهداف محتملة لعلاج الأمراض المختلفة4.
يتم تنظيم الالتهام الذاتي بطريقة متطورة للغاية5. عند الجوع ، تقوم أغشية العزل بعزل المواد السيتوبلازمية ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. عبور ذبابة الفاكهة ووضع البيض
- إدخال 3 ذكور (النمط الجيني hsFLP ubiRFP FRT19A ؛ cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) و 15 أنثى (النمط الجيني y 'w * Mu FRT19A / FM7 ، Kr GFP ) ذباب بالغ (انظر جدول المواد) في قنينة استزراع (مع دقيق الذرة القياسي / دبس السكر / أجار ذبابة الفاكهة الوسطى عند 25 درجة مئوية) للتزاوج.
ملاحظة: يجب إعداد قوارير استزراع متعددة من نفس التهجين لضمان وجود يرقات كافية لمزيد من التجارب. سلالة الذبابة الذكور مع النمط الجيني hsFLP ubiRFP FRT19A ؛ cgGal4 UAS-GFP-Atg8a يحمل موقع FRT في كروموسوم X بالقرب من السنترومير (FRT19A). كما أنه يعبر عن FLP عند صدمة الحرارة عند ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في ظل ظروف التغذية ، ينتشر البروتين الشبيه باليوبيكويتين الموسوم ب GFP ، GFP-Atg8a ، داخل الخلايا. عند الجوع ، فإنه يشكل puncta الأخضر وتسمية البلعمة الذاتية. بمجرد اندماج البلعمة الذاتية مع الليزوزومات ، يتم إخماد GFP في الليزوزومات الذاتية الحمضية ، وتختفي النقط الخضراء. إذا لم يتم تحفيز الالتهام الذاتي أو تسريع نضوج البلعمة الذاتية ، فمن المتوقع أن يكون عدد نقاط GFP منخفضا. ومع ذلك ، إذا تم حظر الاندماج بين البلعمة الذاتية والليزوزومات أو أصبح الرقم الهيدروجيني للجسيم الذاتي أساسيا ، فمن المتوقع أن يكون عدد و / أو حجم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول طرق (1) توليد الذباب الذي يحمل مستنسخات متحولة في أجسام الدهون اليرقية ، (2) تحفيز الالتهام الذاتي من خلال تجويع الأحماض الأمينية ، و (3) تشريح أجسام الدهون اليرقية. من أجل توليد الحيوانات المستنسخة بنجاح في أجسام الدهون اليرقات ، يجب تنفيذ الخطوات الحاسمة التالية بجد. (1) يعد توقيت الصدمة الحرارية بدقة أمرا بالغ الأهمية لأن إعادة التركيب الانقسامي تحدث فقط عندما يخضع النسيج للانقسام ، و (2) كل من درجة حرارة الصدمة الحرارية ومدتها ضرورية لإحداث تعبير FLP. يوصى باستخدام حمام مائي قياسي 37 درجة مئوية لصد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نحن ممتنون ل THFC و BDSC لتوفير سلالات الذباب. يتم دعم الدكتور تونغ تشاو من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32030027 ، 91754103 ، 92157201) وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية. نشكر المرفق الأساسي في معهد علوم الحياة (LSI) على تقديم الخدمات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي | الدقيق Axygen | MCT-150-C | |
| # 5 ملقط | Dumont | RS-5015 | |
| 9 ضمادات لوحة بقعة | PYREX | 7220-85 | |
| مجهر مضان | نيكون | SMZ1500 | |
| الجلسرين | سانجون للتكنولوجيا الحيوية | A100854-0100 | |
| KCl | سانجون للتكنولوجيا | الحيويةA610440-0500 | تكوين حل 1x PBS |
| KH2< / sub>PO4< / sub | A600445 | 1x محلول PBS | |
| ملعقة مختبر | فيشر | 14-375-10 | |
| ملقط طويل | R 'DEER | RST-14 | |
| غطاء مجهر زجاجي | CITOTEST | 80340-1130 | |
| شرائح المجهر | CITOTEST 80302-2104 | ||
| Na2< / sub>HPO4< / sub> | Sangon Biotech | A501727-0500 | تكوين حل 1x PBS |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | تكوين محلول 1x PBS |
| بارافورمالدهيد | سيجما ألدريتش | 158127 | |
| طبق بتري | كورنينج | 430166 | |
| معيار دقيق الذرة / دبس السكر / أجار يطير الغذاء | تونغ مختبر | ||
| الصنع مجهر ستيريو | نيكون | SMZ745 | |
| السكروز | سينوفارم الكاشف الكيميائي المحدودة | 10021418 | |
| وسيط تركيب Vectashield المضاد للبهتان مع DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | موصى به متوسط |
| التركيب المتوسط < قوي > الأسهم الطيبة < / قوي > | |||
| < م > ذو * Iso FRT19A < / em > | ذبابة Tong | ||
| Lab < م > ذو * Mu1FRT19A / FM7 ، Kr GFP< / em> | ذبابة الأسهم | ||
| < > y'w * Mu2 FRT19A / FM7 ، Kr GFP < / em> | Tong Lab ذبابة الأسهم | ||
| < م > hsFLP ubiRFP FRT19A ؛ cgGal4 UAS-GFP-Atg8a < / em > | أسهم الذبابة Tong Lab |
المراجع
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushi....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
