الجمع بين مجهر المقاصة والتألق لتصور التغيرات في التعبير الجيني والاستجابات الفسيولوجية للبلازموديوفورا براسيكاي

Summary

يصف البروتوكول الحالي طريقة محسنة للمراقبة النسيجية للكرات التي تسببها Plasmodiophora brassicae. يتم مسح أقسام Vibratome من hypocotyls قبل التصوير الفلوري لدراسة تورط عوامل النسخ والهرمونات النباتية أثناء تطور المرض. يتغلب هذا البروتوكول على قيود تضمين الراتنج ، مما يتيح في تصور النبات للبروتينات الفلورية.

Abstract

تؤدي إصابة محاصيل الكرنب بواسطة الطلائعيات المنقولة بالتربة Plasmodiophora brassicae إلى تكوين المرارة على الأعضاء تحت الأرض. يتطلب تكوين الكرات إعادة البرمجة الخلوية والتغيرات في عملية التمثيل الغذائي للنبات المصاب. هذا ضروري لإنشاء حوض فسيولوجي موجه نحو مسببات الأمراض يتم إعادة توجيه العناصر الغذائية المضيفة نحوه. من أجل فهم كامل لهذا التفاعل بين النبات والممرض والآليات التي يتم من خلالها تخريب نمو المضيف وتطوره وإعادة تشكيله ، من الضروري تتبع ومراقبة التغيرات الداخلية المصاحبة لتكوين المرارة بدقة خلوية. غالبا ما تستخدم الطرق التي تجمع بين البقع الفلورية والبروتينات الفلورية لدراسة الاستجابات التشريحية والفسيولوجية في النباتات. لسوء الحظ ، فإن الحجم الكبير للكرات وشفافيتها المنخفضة يعملان كعقبات رئيسية في إجراء عمليات رصد كاملة تحت المجهر. علاوة على ذلك ، تحد الشفافية المنخفضة من استخدام الفحص المجهري الفلوري لدراسة تطور مرض كلوبروت وتكوين المرارة. تقدم هذه المقالة طريقة محسنة لإصلاح الكرات وإزالتها لتسهيل التألق والفحص المجهري متحد البؤر لفحص الكرات المصابة ب P. brassicae. تم استخدام بروتوكول إزالة الأنسجة للمسح البصري السريع متبوعا بتقسيم الاهتزاز للكشف عن التغيرات التشريحية وتوطين التعبير الجيني مع اندماج المروج وخطوط المراسل الموسومة ببروتينات الفلورسنت. ستثبت هذه الطريقة فائدتها في دراسة الاستجابات الخلوية والفسيولوجية في التراكيب الأخرى التي يسببها مسببات الأمراض في النباتات ، مثل المخلوي الناجم عن الديدان الخيطية وعقد الجذر ، وكذلك كرات الأوراق والتشوهات التي تسببها الحشرات.

Introduction

قد تطور النباتات المصابة بمسببات الأمراض أو الحشرات هياكل غير طبيعية (تشوهات الأعضاء أو الكرات) ، والتي تسمح للغازي بتناول العناصر الغذائية والتكاثر¹. هنا ، تم اتباع نهج نسيجي مرضي فعال لدراسة التغيرات التي تحدث في الكرات التي تتطور على الأجزاء الجوفية من النباتات المصابة بالطلائعيات Plasmodiophora brassicae (الشكل 1). ينشأ الخيط الثانوي المرتبط بهذا العامل الممرض من حقيقة أن جراثيم P. brassicae التي تستريح يمكن أن تحتفظ بقدرتها على غزو النباتات لسنوات عديدة. في حالة زراعة اغتصاب البذور الزيتية على نطاق واسع (Brassica napus) ، هذه مشكلة خطيرة لأن العوامل الاقتصادية تقيد دوران المحاصيل ، مما يؤدي إلى تراكم الأبواغ في التربة². يتم تحديد مقاومة اغتصاب البذور الزيتية لمرض كلوبروت الناجم عن P. brassicae وراثيا. للأسف ، غالبا ما يتفوق العامل الممرض على المقاومة بسبب بيولوجيته والمجموعة الجينية الضيقة التي نشأ منها اغتصاب البذور الزيتية. لذلك ، أصبح من المناسب دراسة استجابات ما بعد العدوى في النباتات المضيفة وقدرتها على إبطاء تطور المرض أو منع ظهور أعراض معينة.

في مرض كلوبروت ، يتم تقييم الشدة بشكل عام بناء على تطور الكرات ودرجة تلف نظام الجذر. يعرف هذا باسم مؤشر المرض-DI³. ومع ذلك ، فإنه لا يجسد بشكل كامل التقييم الحقيقي لهذا التفاعل بين النبات والممرض. على وجه الخصوص ، لا يتناول كيفية توزيع العامل الممرض داخل الجذور وما إذا كان النبات قادرا على كبح جماح P. brassicae الحركة داخل أنسجتها. علاوة على ذلك ، ليس من السهل توقع إلى أي مدى P. brassicae يعيد برمجة تشريح الأعضاء تحت الأرض. دراسات على المصنع النموذجي Arabidopsis thaliana قد أظهرت أن P. brassicae تؤدي العدوى إلى تثبيط تكوين النسيج (كل من خطوات البدء والنضج) وتعزيز تمايز اللحاء داخل الكرات^4,5. علاوة على ذلك ، في جذور و hypocotyls من النباتات المصابة ، لا تترك ذرية الخلايا الكامبية الحالة الانقسامية وتتكاثر لفترة أطول من النباتات الصحية⁶. تتحكم هذه العملية في الحجم النهائي للمرارة وتحدد عدد جراثيم الراحة المسببة للأمراض المنتجة داخل النبات المصاب. P. brassicae- إعادة البرمجة التنموية والأيضية والفسيولوجية المدفوعة في المضيف معقدة للغاية⁷; لذلك ، فإن تطبيق الأدوات التي تسمح بفحص التغييرات الداخلية داخل الكرات أمر بالغ الأهمية لتقييم هذا التفاعل بشكل صحيح. تقدم دورة حياة P. brassicae مصحوبا بإعادة برمجة استقلاب الخلية المضيفة ، والذي يمكن ملاحظته على أنه نشا أو ترسب دهني^7,8. العقبة الرئيسية أمام الفحص المجهري الناجح للكرات تأتي من شفافيتها المنخفضة. ونتيجة لذلك ، فإن غالبية العينات النسيجية التي تقدم تغييرات مدفوعة بجذور الهراوات داخل الكرات تنشأ من تقنيات التثبيت (الشمع أو الراتنج) متبوعة بتقسيم الميكروتوم. تم استخدام هذه الأساليب بنجاح لتحديد نشاط المروج للعديد من الجينات النشطة في كرات clubroot^4,5 أو تقنيات تلطيخ مختلفة تسهل مراقبة P. brassicae تقدم دورة الحياة⁹. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن مراحل التثبيت والتضمين تستغرق وقتا طويلا وتؤدي إلى غسل جزئي أو كامل للجزيئات الحيوية المهمة (مثل الدهون) ، مما يعيق بشكل كبير بعض الملاحظات. مؤخرا P. brassicae تم تصور تقدم دورة الحياة في المضيف بمساعدة التهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، حيث تم تصوير ميثيل ترانسفيراز من نوع SABATH (PbBSMT) تم استخدام مسبار خاص بالجينات لتحديد تكوين الأبواغ أثناء الراحة¹⁰. البديل الجيد هو استخدام طرق أخرى قائمة على التألق حيث يمكن رؤية التألق الذاتي لبعض المكونات الخلوية ، ونشاط المناطق التنظيمية 5'- المنبع للجينات المنصهرة في علامات البروتين الفلوري ، وتراكم بروتينات معينة موسومة بالفلورسنت. ومع ذلك ، بالإضافة إلى الشفافية المنخفضة للعينات ، فإن العيب الرئيسي المرتبط بهذه الكائنات هو العمل مع العينات غير الثابتة ، مما يقلل بشكل كبير من الوقت الذي يمكن فيه توثيق الصور عالية الجودة. في عام 2015 ، كوريهارا وآخرون.¹¹ تطوير كاشف المقاصة ، والذي يسمح بالحفاظ على البروتينات الفلورية ويزيد من شفافية عينات الأنسجة النباتية. بالإضافة إلى ذلك ، فهو متوافق مع العديد من البقع النسيجية. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق نفس التقنية بنجاح لتصور مكونات جدار الخلية المختلفة في الأنسجة النباتية^12,13. هنا ، تم استخدام هذا البروتوكول لتحليل مختلف جوانب تطوير المرارة clubroot. يبدأ سير العمل بتثبيت الكرات ، وتقسيم الاهتزاز ، وتطهير الأنسجة ، والتلوين ، والتصوير الفلوري. اعتمادا على احتياجات الفرد ، مباشرة أو بعد تلطيخ معين ، يمكن إخضاع الأقسام الناتجة للفحص تحت المجهر epifluorescence أو المجهر متحد البؤر. توفر هذه الطريقة حلا فعالا لدراسة التغيرات المحلية في التعبير الجيني والاستجابات الفسيولوجية ، بما في ذلك توازن الهرمونات النباتية والإشارات. يمكن تتبع تطور المرض من خلال النظر في نمط توزيع الجراثيم أثناء الراحة وديناميكيات النضج. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق البروتوكول بسهولة لتصوير التغييرات المميزة داخل P. brassicae النباتات المصابة ، بما في ذلك تثبيط تكوين النسيج أو استجابات دفاع النبات المضيف المرئية على أنها تقشير موضعي في الأنماط الجينية المقاومة. تأتي الأمثلة في هذا البروتوكول من التصوير الذي تم إجراؤه على Arabidopsis thaliana نموذج; ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق البروتوكول على أنواع المحاصيل الأخرى التي تنتمي إلى Brassicaceae أسرة. الطريقة الموضحة أدناه ستسهل الدراسات التفصيلية المستقبلية للهياكل الخلوية والتغيرات الجزيئية المصاحبة لتشكيل المرارة في P. brassicae- النباتات المصابة.

سير العمل العام للبروتوكول واضح تماما ، ويمكن بسهولة تصوير جميع مراحل تطور المرارة وتوصيفها (الشكل 2). نظرا لأن P. brassicae هو أحد مسببات الأمراض المنقولة بالتربة ، يجب إجراء جميع التجارب في الأنظمة القائمة على التربة. الممرض يفضل الظروف الحمضية. لذلك ، يجب استخدام ركائز التربة غير المعالجة بالجير. على الرغم من أن P. brassicae لا تشكل تهديدا للإنسان ، إلا أنها من مسببات الأمراض النباتية التي يمكن أن تنتشر عبر التربة والمياه. لذلك ، يجب تدمير جميع أجزاء النبات المصاب ، وكذلك التربة ، بعد التجربة عن طريق التعقيم أو عن طريق العلاج بالتبييض.

Protocol

1. ظروف نمو النبات

1. تنمو نباتات Arabidopsis thaliana في نظام ضوء النهار القصير مع 9 ساعات من الضوء عند 22 درجة مئوية و 15 ساعة من الظلام عند 20 درجة مئوية وإشعاع 120 μmol · m − ²s ^{− 1} (يقاس بالإشعاع النشط ضوئيا ، PAR على مستوى المظلة ، انظر جدول المواد).

2. إعداد لقاح البوغ

ملاحظة: للحصول على التفاصيل، انظر Fuchs et ^al.14.

1. قم بتجانس اثنين إلى ثلاثة كرات مجمدة من نباتات الكرنب الصينية (صنف Brassica rapa var. pekinensis "Granaat") في خلاط يحتوي على 300 مل من الماء المقطر المعقم وقم بالتصفية من خلال أربع طبقات من الشاش المعقم.
2. قم بالطرد المركزي للمرشح (عند 6000 × جم ، لمدة 5 دقائق ، وعند 4 درجات مئوية) وقم بإزالة طبقة النشا ميكانيكيا من حبيبات البوغ باستخدام ملعقة. كرر هذه العملية حتى تتم إزالة معظم النشا.
3. أوجد تركيز الأبواغ باستخدام مقياس الدم¹³ عن طريق حساب عدد الجراثيم في 20 منطقة حقل مختلفة.
4. تأكد من أن التركيز النهائي لمعلق البوغ المستخدم للتلقيح هو 1 × 10⁶ جراثيم · مل ^{− 1} لأرابيدوبسيس ثاليانا. تلقيح كل نبات بعد 20 يوما من الإنبات باستخدام 2 مل من معلق البوغ المعاير.

3. إعداد الأنسجة وتثبيتها

1. تحضير الأنسجة النباتية.
   1. قم بإزالة التربة بعناية من أنظمة جذر النباتات المصابة وغير المصابة. نظف جيدا بالماء واجمع hypocotyls والكرات (الطول بين 0.5-2 سم) في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
2. قم بإجراء تثبيت PFA (4٪ بارافورمالدهيد ، PFA في 1x PBS + 0.01٪ Triton X-100) باتباع الخطوات أدناه.
   1. أضف 4 جم من مسحوق PFA (انظر جدول المواد) إلى 100 مل من PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4 ، الجدول 1) عن طريق التحريك عند 65 درجة مئوية (لا تغلي). استخدم KOH (10 M و 1M) قطرة قطرة للحصول على محلول واضح مع درجة حموضة حوالي 11.
   2. اضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام H₂SO₄ لخفضه إلى 6.9 وإضافة 0.01٪ (v / v) Triton X-100 لتحسين التثبيت. احصل على المحلول للتخزين عند -20 درجة مئوية (لا تقم بإعادة التجميد) أو تخزينه عند 4 درجات مئوية.
3. أداء تثبيت الأنسجة.
   1. إصلاح العينات في 200-500 ميكرولتر من مثبت PFA لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة عن طريق تطبيق فراغ ثابت (700 ملي بار) باستخدام مضخة تفريغ. تأكد من أن الكائن مغمور تماما في حل PFA.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات لبضعة أسابيع عند 4 درجات مئوية (ثلاجة) واستخدامها لاحقا للتقسيم.

4. تضمين الأنسجة وتقسيمها

1. استخدم 4٪ وزن / فولت من الأغاروز لتضمين الأغاروز من hypocotyls غير المصابة والكرات المصابة. غلي المحلول لإذابة الأغاروز وصبه عندما يبرد بينما لا يزال لزجا.
2. جفف الجسم قليلا على منديل لبضع ثوان لإزالة PFA الزائد.
3. استخدم أعواد الأسنان / الملقط لتضمين وتوجيه كائن النبات بعناية في الأغاروز. لمنع المقاطع المائلة ، تأكد من توجيه الكائن وتشكيله بشكل صحيح بحيث يكون محوره عموديا على مستوى شفرة الاهتزاز (للأقسام الشعاعية).
4. لتسريع تصلب الأغاروز ، ضع طبق بتري أو متعدد الثقافات عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: إذا كان الكائن كبيرا جدا (كما في حالة الكرات الكبيرة من Arabidopsis في 21 يوما بعد التلقيح [DPI]) ، فيمكن تقسيم الكائن حتى بدون تضمينه في agarose.

5. تقسيم الاهتزاز

ملاحظة: تم تجهيز الاهتزاز بشفرة حلاقة تهتز لقطع أعضاء / أنسجة النبات. سرعة الاهتزاز والسعة وزاوية الشفرة وسمك المقطع كلها معلمات يمكن تعديلها (انظر جدول المواد).

1. باستخدام شفرة ، قم بقص الكائن وتشكيله بعناية داخل كتلة أغاروز ، مع ملاحظة الاتجاه المفضل للتقسيم.
2. قم بلصق كتلة الأغاروز / المرارة الكبيرة لتركيبها بشكل صحيح على حامل العينة باستخدام cyanoacrylate / الغراء الفوري وشريط التقنيع (انظر جدول المواد).
3. بالنسبة ل Arabidopsis hypocotyls and galls (المراحل المبكرة) ، حافظ على سمك الأقسام بين 30-40 ميكرومتر للحصول على صور عالية الجودة.
   ملاحظة: لتحليل المراحل اللاحقة من تقدم المرارة ، يمكن أن يتراوح سمك الأقسام بين 50-80 ميكرومتر.
4. الامتناع عن قطع الأجزاء الرقيقة لأنها يمكن أن تدمر عينة المرارة بسبب اهتزازات الشفرة المتحركة.
5. اضبط سمك الأقسام والسرعة وسعة الاهتزاز وفقا لسمك المرارة وحجمها (40 ميكرومتر أو 60 ميكرومتر).
6. أضف الماء المقطر إلى حمام الماء وابدأ بالتقسيم.
7. اجمع الأقسام بعناية باستخدام ملقط أو فرشاة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 1 مل من 1x PBS buffer (درجة الحموضة 7.4).
   ملاحظة: عادة ، كلما زادت سعة الاهتزاز ، كانت جودة التقسيم أفضل. بالنسبة للهيبوكوتيل أو الكرات غير المصابة التي لا تحتوي على جراثيم استراحة ناضجة ، يمكن الحفاظ على سعة الاهتزاز عند 1.2 مم بسرعة 0.60 مم · ثانية ⁻¹ . في حالة الكرات الكبيرة مع فقدان جزئي للسلامة الخلوية وعلامات واضحة على نضوج البوغ ، يجب تقليل سعة الاهتزاز إلى 0.55 مم بسرعة 0.45 مم · ثانية ⁻¹ .

6. تطهير العينات

1. قم بإزالة 1x PBS من أنبوب الطرد المركزي الدقيق وأضف 200-500 ميكرولتر من محلول المقاصة (الجدول 1).
2. من الآن فصاعدا ، قم بتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تأكد من أن الكائنات مغمورة دائما في محلول المقاصة في جميع الأوقات.
3. استبدل محلول المقاصة بالحل الجديد إذا تغير لونه بعد مرور بعض الوقت أثناء معالجة العينة.
   ملاحظة: يمكن أن يتحول لون محلول المقاصة إلى اللون الأصفر بسبب معالجة العينات. في مثل هذه الحالة ، يوصى باستبدال المحلول لتحسين إزالة الأنسجة.

7. إجراء تلطيخ

1. بالنسبة لتلطيخ Calcofluor الأبيض لجدران الخلايا (لخلايا النبات الناتفة) ، قم بإعداد 5٪ v / v من صبغة Calcofluor البيضاء (انظر جدول المواد) في محلول التطهير. وصمة عار لمدة 5 دقائق على الأقل في الظلام.
2. لتلطيخ الدهون بأحمر النيل (لتلطيخ جراثيم الراحة وقطرات الزيت في الخلايا المصابة) ، قم بإعداد 1 مجم / مل من المرق (انظر جدول المواد) في محلول التطهير. قم بتخفيفه أكثر للحصول على 1:99. وصمة عار لمدة 10 دقائق على الأقل في الظلام.
3. لتلطيخ اللجنين Fuchsin الأساسي ، قم بإعداد 0.2٪ وزن / حجم من البقعة (انظر جدول المواد) في محلول التطهير. وصمة عار لمدة 10 دقائق على الأقل في الظلام.
   ملاحظة: أثناء التلوين المزدوج ، يتم تلطيخ العينات أولا ب Nile Red لمدة 10 دقائق قبل تطبيق Calcofluor الأبيض. تمت إزالة محاليل التلوين الزائدة بعد كل خطوة. إذا بدا الجسم ملطخا ، فقم بإزالة البقعة الزائدة عن طريق الغسيل بمحلول التطهير. تمييع البقع باستخدام محلول المقاصة ، إذا لزم الأمر. قم دائما بتلطيخ العينة بأحمر النيل / الفوشين الأساسي قبل تلطيخ Calcofluor. يمكن أن يؤدي التلوين أولا باستخدام Calcofluor إلى منع تلطيخ الجراثيم بواسطة النيل الأحمر.

8. الفحص المجهري

1. قم بتركيب أقسام تم مسحها على شريحة الفحص المجهري والمراقبة تحت مجهر فوق الفلور أو مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد). استخدم محلول المقاصة كوسيط تركيب لمنع تجفيف العينة.
2. استخدم أوضاع اكتساب متعددة لتصوير أكثر من طيف مضان واحد في وقت واحد.
   ملاحظة: أطياف الإثارة/الانبعاث المستخدمة في البروتوكول المقدم هي كما يلي: لأحمر النيل 553/636 نانومتر، للتألق الذاتي لنسيج الخشب 380/475 نانومتر، للفوشين الأساسي 561/650 نانومتر، للكالكوفلور الأبيض 405/475 نانومتر، ل erRFP 585/608 نانومتر، ول GFP 488/509 نانومتر (الجدول 2).

Results

مع النيل الأحمر الذي يلطخ الدهون والسوبرين ، من الممكن رؤية جراثيم الراحة المسببة للأمراض التي تحتوي على الدهون (الشكل 3 أ ، ب). ومن ثم ، باستخدام تلطيخ مزدوج ، يمكن الحصول على صور واضحة للنظر في نمط توزيع مسببات الأمراض داخل الكرات. يخلق التلوين المضاد باللون الأبيض Calcofluor تباينا ويساعد على تتبع تطور نسيج الخشب في وقت واحد مع نضوج P. brassicae (الشكل 3B).

يمكن أيضا التحقق من تكوين نسيج الخشب وتطوره من خلال مراقبة التألق الذاتي في العينات غير الملوثة (الشكل 4 أ) أو باستخدام بقع مثل الفوشين الأساسي الذي يتيح التصوير القائم على التألق للجنين (الشكل 4 ب).

باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء تتبع تغيرات التعبير الجيني أو الاستجابات لمنظمات النمو. وخير مثال على ذلك هو المكان الذي تم فيه استخدام نباتات Arabidopsis التي تحتوي على بنية pHCA2: erRFP لتصور التعبير الجيني HIGH CAMBIAL ACTIVITY 2 (HCA2) في أنسجة اللحاء داخل كرات clubroot. تم العثور على نشاط جين HCA2 سابقا في خلايا الكامبيوم النشطة مرستيماتيكيا وخلايا سلالة اللحاء¹⁵. هنا ، يتزامن مع اللحاء في المراحل المتأخرة من تطور المرارة التي تحركها P. brassicae ، ويعكس نشاطه كيف تزيد P. brassicae من تعقيد اللحاء (الشكل 5). توضح الصورة الناتجة تكاثر اللحاء في المرحلة المتأخرة من نمو المرارة عندما يتفكك الكامبيوم. يوضح الشكل 5A قسما يدويا غير واضح من المرارة ، بينما يوضح الشكل 5B إشارات فلورية أكثر وضوحا وموضعية تم الحصول عليها عن طريق تقسيم الاهتزاز متبوعا بتطهير الأنسجة. تم تلطيخ الأشياء باللون الأبيض Calcofluor. يقارن الشكل 6 هذه الصورة (الشكل 6B) بمنطقة مماثلة موضحة في كرات مدمجة بالراتنج ومقطعية ميكروتوم (الشكل 6 أ) عند 21 نقطة في البوصة. تم تقييم استجابات السيتوكينين التفاضلية بين النباتات المصابة وغير المصابة عن طريق التحقق من تعبير علامة TCS: GFP (الإشارات المكونة من عنصرين)¹⁶ في تطوير الكرات (الشكل 7). أثناء تصوير إشارات GFP الضعيفة في الكرات والأنسجة ذات السماكة الثانوية ، من المهم ملاحظة أن إشارة الخلفية الإضافية الناتجة عن التألق الذاتي لخلايا نسيج الخشب الناضجة يتم التقاطها أيضا أثناء التصوير.

الشكل 1: أعراض مرض كلوبروت على اغتصاب البذور الزيتية (B. napus) وأرابيدوبسيس ثاليانا (كولومبيا-0) عند 26 نقطة في البوصة مع جراثيم Plasmodiophora brassicae . أثناء المرض ، تتطور الكرات الكبيرة على نظام الجذر بأكمله ، مما يجعلها هشة للغاية. ويختتم بإطلاق الجراثيم في التربة المحيطة لتعزيز العدوى في المستقبل. تظهر الأجزاء العلوية من جسم النبات أيضا علامات ضعف النمو والتطور. أخيرا ، تستسلم النباتات المصابة للآثار المدمرة على استقلاب النمو وتطوره بمجرد تلف نظام الجذر تماما ولم يعد النبات قادرا على التعامل مع المرض. يمثل شريط المقياس 1 سم. يرمز -INF إلى التلقيح الوهمي ، بينما يرمز +INF إلى النباتات الملقحة ب P. brassicae. في هذه المناسبة ، يتم تقديم صورة لنباتات لفت البذور الزيتية قبل إزالة التربة لتقديم أنظمة جذر صحية. بعد الغسيل ، يتم جمع hypocotyl والجزء العلوي فقط من الجذر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: سير العمل العام. أنظمة جذر أرابيدوبسيس المغسولة هي (أ) تشريح ، (ب) ثابت ، (ج) أغاروز مضمن ، (د) مثبت ، و (ه) مقسم على الاهتزاز. تخضع الأجسام الناتجة لإزالة الأنسجة (من 3 أيام إلى عدة أسابيع في RT في الظلام ، اعتمادا على نوع الأنسجة وسمكها). (و) يمكن بعد ذلك تلطيخ الأجسام التي تم تطهيرها وفحصها تحت المجهر. (ز) موجز لتدفق العمل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تمييز جراثيم مسببات الأمراض بصبغة النيل الحمراء . (أ، ب) بقع النيل الأحمر الدهون في جراثيم الراحة ، والتي تعمل بشكل مثالي لتتبع نضج P. brassicae. أ: الخلايا المتضخمة التي تستعمرها المتصورة البراسيكية وتمتلئ بالجراثيم المسببة للأمراض. (ب) تلطخ خلايا نسيج الخشب الناضجة أيضا بواسطة النيل الأحمر. تم تلطيخ القسم باللون الأبيض Calcofluor لمعرفة نفقات الخلايا المضيفة (A: العدسة الموضوعية = 20x وسمك القسم = 60 ميكرومتر ؛ B: عدسة موضوعية = 5x وسمك المقطع = 60 ميكرومتر). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تتبع مدى نمو نسيج الخشب ونضجه. (أ) يعطي اللجنين تألقا ذاتيا قويا عند الإثارة بالأشعة فوق البنفسجية ؛ ومن ثم، يمكن تمييز نسيج الخشب الناضج بسهولة نسبية. (ب) يعطي التلوين المزدوج باستخدام الفوشين الأساسي والكلكوفلور نتائج أفضل؛ لأن جميع الخلايا تتلطخ بالصبغة الأخيرة، في حين أن نسيج الخشب الناضج ملطخ بشكل واضح بالفوشين الأساسي. وبهذه الطريقة ، يوفر التلوين المزدوج صورا ذات تباين محسن يصور تثبيطا ملحوظا لتكوين النسيج (A: العدسة الموضوعية = 10x وسمك المقطع = 60 ميكرومتر ؛ B: العدسة الموضوعية = 10x وسمك المقطع = 60 ميكرومتر). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: إشارة خاصة باللحاء لجين HCA2 في hypocotyls للنباتات المصابة ب P. brassicae عند 21 نقطة لكل بوصة. يمكن رؤية نشاط المروج ل proHCA2::erRFP الذي يؤوي أرابيدوبسيس ثاليانا المعدل وراثيا في (أ) و (ب). يمكن ملاحظة الاختلافات بين قسم اليد غير المسحة في اللوحة (A) حيث تظهر إشارة erRFP منتشرة بسبب التراكب وتداخل طبقات الخلايا ، خاصة في أقسام اليد غير المستوية. من ناحية أخرى ، يظهر (B) مقطع اهتزازي بعد إزالة الأنسجة حيث تحدد إشارة erRFP بدقة خلايا اللحاء في حزمة وعائية ناضجة (العدسة الموضوعية = 20x وسمك القسم = 60 ميكرومتر). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: مقارنة بين الكرات المضنية بالراتنج والكرات المقطعة بالميكروتوم بمساعدة التألق. (أ) مقارنة بين صور الكرات الزرقاء التولويدين (TB) ، والكرات المضمنة بالراتنج ، والكرات المقطعية بالميكروتوم ، و (ب) كائن تمثيلي (موضح أيضا في الشكل 5 ب) تم الحصول عليه بمساعدة مضان. يشار إلى خلايا نسيج الخشب بعلامات نجمية صفراء، والمنطقة الكامبية بأقواس خضراء زاهية، ولحاء الشعر بعلامات نجمية سماوية، وخلايا مستعمرة من البلازموديوفورا براسيكاي برمز PB أبيض. توفر الأقسام المدمجة بالراتنج (A) دقة جيدة لدراسة توزيع الجراثيم المستريحة في الأعضاء المتضخمة ، ودرجة تطور المرض ، وغيرها من العمليات مثل التقشير الموضعي في النباتات المقاومة. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الموصوف هنا (B) يتيح الملاحظة الحساسة للتعبير الجيني أو تراكم البروتين وتصور التغيرات الفسيولوجية الأخرى والجزيئات المهمة مثل الدهون (في الجراثيم). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: تتبع استجابات إشارات السيتوكينين في hypocotyls لنباتات Arabidopsis غير المصابة (-INF) و P. brassicae (+INF) المصابة عند 16 نقطة في البوصة. TCS::تم استخدام علامة GFP للتوصيف في استجابات سيتوكينين النبات. خضعت أقسام الاهتزاز لمعالجة التطهير تليها تلطيخ باللون الأبيض Calcofluor. استنادا إلى الصورة ، عند 16 نقطة في البوصة ، يبدو أن استجابات السيتوكينين تتضاءل إلى حد كبير في الكرات المصابة (اللوحة اليمنى) ، بينما تظل قوية ، خاصة في تجمع اللحاء (الخلايا التي ستتمايز في النهاية لتشكيل نسيج اللحاء) ، في النباتات غير المصابة (اللوحة اليسرى) (العدسة الموضوعية = 5x والسمك = 30 ميكرومتر). يمكن أيضا رؤية مستويات معينة من التألق الذاتي لنسيج الخشب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

حل المقاصة (سام)
مكونات	النسبة المئوية (٪)	في 100 مل ماء مقطر
إكسيليتول	10%	١٠ غرام
ديوكسي كولات الصوديوم	15%	١٥ غرام
يوريا	25%	٢٥ غرام
10x PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)		1x PBS (100 مل)
كلوريد الصوديوم	٨ غرام	10 مل 10x PBS + 90 مل ماء مقطر
ككل	0.2 غ
KH2PO4	0.24 غ
Na2HPO4 · 2 ساعة2س	1.81 غ
ماء مقطر	100 مل
الرقم الهيدروجيني	تعديل درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك
الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجة مئوية.

الجدول 1: تكوين محلول المقاصة والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS).

صبغة فلورية / علامة	الأطوال الموجية للإثارة / الانبعاث	مجموعة مرشح المجهر المستخدمة
النيل الأحمر	553/636 نيوتن متر	مجموعة التصفية 43
مضان نسيج الخشب الذاتي	380/475 نيوتن متر	مجموعة تصفية 49
كالكوفلور وايت	405/475 نيوتن متر	مجموعة تصفية 49
فوشين الأساسية	561/650 نيوتن متر	مجموعة التصفية 43
erRFP	585/608 نيوتن متر	مجموعة التصفية 43
هيئة أجيال السلام	488/509 نيوتن متر	مجموعة التصفية 38

الجدول 2: أطياف الإثارة/الانبعاث المختارة لهذه الدراسة.

Discussion

من المؤكد أن تطبيق محلول المقاصة على أقسام الكرات المقطوعة بالاهتزاز يعزز القدرة على دراسة التفاعل الحيوي بين P. brassicae والنبات المضيف. على الرغم من أن بروتوكول المقاصة ينطبق حتى على أقسام اليد ، إلا أنه يعمل بشكل أفضل مع أقسام الاهتزاز. يعمل إصلاح العينات في مثبت PFA كخطوة حاسمة في البروتوكول حيث يمكن بعد ذلك تخزين العينات عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام قبل الشروع في التقسيم. يوفر هذا المرونة لتخزين العينات لفترة محدودة دون المساس بالتعبير عن البروتينات الفلورية والحفاظ عليها أثناء التثبيت.

النيل الأحمر (في DMSO أو الميثانول) غير متوافق مع أقسام الراتنج بسبب كرهه للماء ، الذي يذيب الراتنج ويدمر الأقسام المضمنة في الراتنج¹⁷. وبالتالي ، تثبت أقسام الاهتزاز أنها مفيدة لدراسة توزيع مسببات الأمراض ودورة حياتها داخل الكرات النامية ، حيث يمكن استخدام تلطيخ النيل الأحمر بسهولة.

حل المقاصة المستخدم في هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات^{للغاية 12} ، مما يسمح باستخدام مجموعة متنوعة من بقع التألق في مجموعات مختلفة لتلطيخ الجزيئات الحيوية / مكونات جدران الخلايا المختلفة (السوبرين واللجنين والسليلوز والكيتين في التفاعلات الفطرية). من الممكن أيضا مواجهة أقسام خطوط علامة GFP الفلورية وبالتالي ربط نشاط المروج أو نمط تراكم البروتين بوجود العامل الممرض في خلايا أو مناطق معينة من المرارة. ومع ذلك، لا يمكن القضاء على التألق الذاتي الخلفي من نسيج الخشب والخلايا العملاقة المملوءة بمسببات الأمراض حتى بعد بروتوكول المقاصة. يمثل هذا قيدا على النظر إلى علامات الفلورسنت خلال المراحل اللاحقة من تكوين المرارة ، خاصة عند استخدام مجهر فوق التألق وتصوير الإشارات الضعيفة.

نظرا لانخفاض مستويات التعبير / تراكم الإشارات الفلورية ، يصعب اكتشاف عوامل النسخ ، ولكن باستخدام هذه التقنية ، من الممكن الحصول على صور مرضية لها. بشكل عام ، يؤدي الجمع بين تقسيم الاهتزاز ونهج إزالة الأنسجة إلى توسيع مجموعة أدوات الملاحظات النسيجية لأنسجة المرارة المعقدة. تسهل مرونة هذا البروتوكول عملية تثبيت الأنسجة وتقلل من الوقت اللازم لقطع وتصوير عينات الأنسجة الطازجة لمراقبة البروتينات الفلورية وأنشطة المروج. مع مزيد من التحسينات ومن خلال استخدام أصباغ الفلورسنت الأخرى الخاصة بالجزيئات الحيوية المختلفة ، ستشهد هذه الطريقة تقدما أكبر في الدراسات النسيجية وتحليل الصور للأنسجة الكثيفة غير الشفافة ذات التنظيم المعقد للأنسجة. في الآونة الأخيرة ، ظهرت طريقة إزالة الأنسجة المقدمة كبروتوكول شائع ومستخدم على نطاق واسع للجمع بين وتمكين الاكتساب المتزامن لإشارات الفلورسنت المختلفة¹¹،^12،13. سيؤدي التطوير والتعديلات المستقبلية في مثل هذه التقنيات إلى تحسين دقة الصورة بشكل كبير لمراقبة تفاعلات مسببات الأمراض النباتية على المستوى الخلوي.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2N حمض الكبريتيك (H2< / sub>SO4< / sub>) تعديل	الأس الهيدروجيني	Roth	UN2796
Agarose	PRONA	BGQT100	تضمين
أساسي Fuchsin	BIOSHOP	BSF410.5	صبغة الفلورسنت
Calcofluor White	Sigma Aldrich	18909-100ML-F	صبغة الفلورسنت
التبييض التجاري	Domestos
Cyanoacrylate / الغراء الفوري	Kropelka		لاصق
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	BIOSHOP	DMS555.500	Epifluorescence المذيب
	Carl Zeiss M2 مجهر epifluorescence الآلي مع نظام Colibri LED	Zeiss M2	Filter Set مجموعة المرشحات 38 ، 43 ، 49 المستخدمة
الأوتوماتيكية بالكامل Vibratome	Leica	VT1200 S مقياس
الضوء / مقياس الضوء	LI-COR Biosciences	LI-250A + LI-190R مستشعر كمي	لقياس شدة الضوء داخل شريط الموجة
			للصق كتلة الاغاروز على القالب
Murashige & Skoog Medium (MS Medium)	Duchefa Biochemie	MO222.0050	نمو النبات متوسط
النيل الأحمر	Sigma Aldrich	N3013-100MG	صبغة الفلورسنت
Paraformaldehyde PFA	Sigma Aldrich	158127-100G
كلوريد البوتاسيوم المثبت (KCl)	POCH	739740114	مكون PBS
هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)	سيجما ألدريتش	P1767-250G	تعديل الأس الهيدروجيني
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2< / sub>PO4< / sub>) BIOSHOP		PPM302.500	مكون PBS
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) BIOSHOP		SOD001.1	مكون PBS
Deoxycholate الصوديوم	Sigma Aldrich	D6750-25G	محلول المقاصة
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na 2< / sub >HPO4< / sub> & middot ؛ 2H 2< / sub >O)	POCH	799490116	PBS مكون
Triton X-100	BIOSHOP	TRX506.100	مثبت
اليوريا	Sigma Aldrich	U5378-100G	المقاصة
/ مضخة الضغط و Dessicator	Welch بواسطة Gardner Denver	2522C-02	للفراغ محلول
الترشيح Xylitol	Sigma Aldrich	X3375-25G	(componenet)