يصف هذا البروتوكول طريقة شاملة لتقييم تنشيط الكاسباز (caspase-1 و caspase-3 و caspase-7 و caspase-8 و caspase-9 و caspase-11) استجابة لكل من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي (في الفئران) للعدوى والشتائم العقيمة والسرطان لتحديد بدء مسارات موت الخلايا ، مثل pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، necroptosis ، و PANoptosis.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم تنشيط الكاسباز لتقييم موت الخلايا المناعية الفطرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
توفر المناعة الفطرية خط الدفاع الأول الحاسم استجابة لمسببات الأمراض والإهانات العقيمة. أحد المكونات الميكانيكية الرئيسية لهذه الاستجابة هو بدء موت الخلايا المبرمج المناعي الفطري (PCD) للقضاء على الخلايا المصابة أو التالفة ونشر الاستجابات المناعية. ومع ذلك ، يرتبط PCD الزائد بالالتهاب وعلم الأمراض. لذلك ، فإن فهم تنشيط وتنظيم PCD هو جانب مركزي لتوصيف الاستجابات المناعية الفطرية وتحديد أهداف علاجية جديدة عبر طيف المرض.
يوفر هذا البروتوكول طرقا لتوصيف تنشيط PCD المناعي الفطري من خلال مراقبة caspases ، وهي عائلة من البروتياز المعتمد على السيستين والتي غالبا ما ترتبط بمسارات PCD المتنوعة ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، pyroptosis ، necroptosis ، و PANoptosis. وصفت التقارير الأولية caspase-2 و caspase-8 و caspase-9 و caspase-10 على أنها كاسباس بادئ و caspase-3 و caspase-6 و caspase-7 ككاسباز مستجيب في موت الخلايا المبرمج ، بينما وجدت الدراسات اللاحقة أن caspases الالتهابية ، caspase-1 ، caspase-4 ، caspase-5 ، و caspase-11 ، تدفع pyroptosis. من المعروف الآن أن هناك تقاطعا مكثفا بين الكاسباس وجزيئات المناعة وموت الخلايا الفطرية الأخرى عبر مسارات PCD المحددة سابقا ، مما يحدد فجوة معرفية رئيسية في الفهم الميكانيكي للمناعة الفطرية و PCD ويؤدي إلى توصيف PANoptosis. PANoptosis هو مسار التهابي فطري فريد من نوعه ينظمه مجمعات PANoptosome ، والتي تدمج المكونات ، بما في ذلك caspases ، من مسارات موت الخلايا الأخرى.
هنا ، يتم توفير طرق لتقييم تنشيط caspases استجابة للمنبهات المختلفة. تسمح هذه الطرق بتوصيف مسارات PCD في كل من المختبر والجسم الحي ، حيث تخضع الكاسباز المنشطة لانقسام بروتيني يمكن تصوره عن طريق النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة المثلى وظروف النشاف. تم إنشاء بروتوكول وتدفق عمل النشاف الغربي الذي يسمح بتقييم تنشيط كاسباز متعددة من نفس المجموعة الخلوية ، مما يوفر توصيفا شاملا لعمليات PCD. يمكن تطبيق هذه الطريقة عبر مجالات البحث في التنمية ، والتوازن ، والعدوى ، والالتهابات ، والسرطان لتقييم مسارات PCD عبر العمليات الخلوية في الصحة والمرض.
المقدمة
يعمل جهاز المناعة الفطري كخط دفاع أول أثناء العدوى واستجابة للمثيرات العقيمة، مثل إصابة الأنسجة والتغيرات في الاتزان الداخلي. تستجيب المستشعرات المناعية الفطرية على سطح الخلية وفي السيتوبلازم للأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض أو الضرر (PAMPs أو DAMPs ، على التوالي) لتحفيز مسارات الإشارات الالتهابية والاستجابات الخلوية. تتمثل إحدى العمليات الرئيسية للاستجابة المناعية الفطرية في تحريض موت الخلايا لإزالة الخلايا المصابة أو التالفة وتحفيز المزيد من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. موت الخلايا المبرمج (PCD) هو عملية محفوظة للغاية عبر الأنواع ، مما يسلط الضوء على أهميتها التطورية كآلية مناعية فطرية.
هناك العديد من مسارات PCD المناعي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على استخدام الحيوانات وإجراءاتها من قبل لجنة مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال حول استخدام الحيوانات ورعايتها.
1. إعداد الحلول
- قم بإعداد الوسائط المكيفة L929.
- اللوحة 1 × 106 خلايا L929 (انظر جدول المواد) في دورق زراعة الأنسجة 182 سم2 يحتوي على 50 مل من وسائط الاستزراع L929 (انظر الجدول 1 لإعداد الوسائط).
- تنمو الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- بعد 7 أيام ، اجمع المادة الطافية وقم بالتصفية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر. تحضير 50 مل من القسومات (قم بتخزين القسوم المجمدة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لوحظ PANoptosis استجابة للعديد من الالتهابات البكتيرية والفيروسية والفطرية والمحفزات الالتهابية الأخرى ، وكذلك في الخلايا السرطانية 44،48،49،50،51،52،53،54،56،57،58،60،61
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توفر مراقبة انقسام الكاسباز وتنشيطه واحدة من أكثر الصور شمولا لتنشيط PCD المناعي الفطري كجزء من الاستجابة المناعية الفطرية. يوضح البروتوكول الموصوف هنا استراتيجية لمراقبة تنشيط الكاسباز استجابة لعدوى IAV و HSV1 و F. novicida والزناد المعقم LPS + ATP ، ولكن العديد من المحفزات الأخرى يمكن أن تحفز PCD ويمكن استخدامها في هذه الطريقة ، كما هو موضح في العديد من المنشورات 44،48،49،50،51،52،53،54،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
T.-D.K. هو مستشار لشركة فايزر.
شكر وتقدير
نشكر أعضاء مختبر Kanneganti على تعليقاتهم واقتراحاتهم ، ونشكر J. Gullett ، دكتوراه ، على دعم التحرير العلمي. يتم دعم العمل في مختبرنا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) AI101935 و AI124346 و AI160179 و AR056296 و CA253095 (إلى T.-D.K.) والجمعيات الخيرية الأمريكية اللبنانية السورية (إلى T.-D.K.). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.45 مو ؛ مرشح m | Millipore | SCHVU05RE | |
| 10 مل حقنة | BD Biosciences | 309604 | |
| 12٪ هلام بولي أكريلاميد مع 10 آبار ؛ | Bio-Rad | 4561043 | |
| لوحة 12 بئر | Corning | 07-200-82 | |
| 18 G إبرة | BD Biosciences | 305195 | |
| 25 G إبرة | BD Biosciences | 305122 | |
| أنبوب 50 مل | فيشر العلمي | 50-809-218 | |
| 70 & مصفاة الخلايا المم | أطباق زراعة الأنسجة Corning | 431751 | |
| 150 مم | Corning | 430597 | |
| 182 سم 2< / sup> قارورة ثقافة الأنسجة | Genesee Scientific | 25-211 | |
| ملحق صينية عابرة بيضاء | Cytiva | 29-0834-18 | |
| Anti & ndash ؛ الجسم المضاد caspase-1 | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
| Anti&ndash ؛ كاسبيز -11 الجسم المضاد | Novus Biologicals | NB120-10454 | |
| Anti&ndash ؛ كاسباز -3 الأجسام المضادة | تقنية إشارات الخلية | 9662 | |
| Anti & ndash ؛ تقنية إشارات الخلايا للأجسام المضادة caspase-7 | 9492 | ||
| Anti & ndash ؛ تقنية إشارات الخلايا للأجسام المضادة caspase-8 | 4927 | ||
| Anti & ndash ؛ تقنية إشارات الخلايا للأجسام المضادة caspase-9 | 9504 | ||
| Anti & ndash ؛ الجسم المضاد Caspase-3 المشقوق | تقنية إشارات الخلية | 9661 | |
| Anti & ndash ؛ الجسم المضاد Caspase-7 المشقوق | تقنية إشارات الخلية | 9491 | |
| Anti&ndash ؛ الجسم المضاد Caspase-8 المشقوق | تقنية إشارات الخلية | 8592 | |
| الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP المضاد للفأر ؛ | مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية | 315-035-047 | |
| الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP المضاد للأرانب ؛ | مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية | 111-035-047 | |
| الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP المضاد للفئران ؛ | مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية | 112-035-003 | |
| Anti&ndash ؛ > بيتا ؛ الأجسام المضادة للأكتين (C4) HRP | سانتا كروز | sc-47778 HRP | |
| ATP | InvivoGen | tlrl-atpl | |
| BBL مرق الصويا التربتيكاز | BD Biosciences | 211768 | |
| حمام حبة | Chemglass Life Sciences | CLS-4598-009 | |
| مقياس الضوء الحيوي D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| BME | Sigma | M6250 | |
| بروموفينول أزرق | كاشطات الخلايا Sigma | BO126 | |
| CellTreat Scientific Products | 229315 | ||
| التلألؤ الكيميائي (Amersham 600) | Cytiva | 29083461 | |
| CO2 غرفة | VetEquip | 901703 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | |
| مقص | Thermo Fisher Scientific | 221S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995-073 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| جهاز الرحلان الكهربائي ؛ | Bio-Rad | 1658004 | |
| الإيثانول | فارمكو | 111000200 | |
| مصل الأبقار الجنينية | Biowest | S1620 | |
| ورق ترشيح | Bio-Rad | 1703965 | |
| ملقط | فيشر Scientific | 22-327379 | |
| Francisella novicida (سلالة U112) | BEI Resources | NR-13 | |
| Gel releaser | Bio-Rad | 1653320 | |
| Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| HCl | Sigma | H9892 | |
| كتلة حرارية | فيشر Scientific | 23-043-160 | |
| فيروس الهربس البسيط 1 (سلالة HF) | ATCC | VR-260 | |
| ارتفاع نسبة الجلوكوز DMEM | سيجما | D6171 | |
| الإنسان المضاد – كاسباز -1 الجسم المضاد | R & D أنظمة | MAB6215 | |
| الإنسان ضد – كاسباز 8 الأجسام المضادة | Enzo | ALX-804-242 | |
| حاضنة مرطب ; | تحليل الصور Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| ImageJ | v1.53a | ||
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440-053 | |
| فيروس الأنفلونزا A (A / Puerto Rico / 8/34 ، H1N1 [PR8]) | شيدت لكل هوفمان وآخرون. | ||
| L929 خلايا | ATCC | CCL-1 | خط الخلايا لإنشاء وسائط مكيفة L929 |
| L-cysteine ؛ | Thermo Fisher Scientific | BP376-100 | |
| Luminata Forte Western HRP الركيزة | Millipore | WBLUF0500 | الركيزة HRP ذات الحساسية القياسية |
| MDCK | ATCC | CCL-34 | خط الخلية لتحديد العيار الفيروسي IAV |
| الميثانول | سيجما | 322415 | |
| الطرد المركزي | الدقيقة Thermo Fisher Scientific | 75002401 | |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية | جيبكو | 11140050 | |
| مسحوق الحليب المجفف الخالي من الدسم | محلول كروجر | ||
| NP-40 | سيجما | 492016 | |
| PBS | ثيرمو فيشر العلمي | 10010023 | |
| البنسلين والستربتومايسين ؛ | Sigma | P4333 | |
| طبق بتري | فيشر Scientific | 07-202-011 | |
| PhosSTOP | Roche | PHOSS-RO | |
| مصدر الطاقة | Bio-Rad | 164-5052 | |
| قرص مثبط للبروتياز | Sigma | S8820 | |
| PVDF غشاء ؛ | Millipore | IPVH00010 | |
| هزاز شاكر | Labnet | S2035-E | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| كلوريد الصوديوم | Sigma | S9888 | |
| Deoxycholate الصوديوم | Sigma | 30970 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | Sigma | 72068 | |
| بيروفات الصوديوم | Gibco | 11360-070 | |
| طبق بتري مربع | فيشر FB0875711A | ||
| التجريد العازلة | الحرارية فيشر العلمية | 21059 | |
| إشارة فائقة فيمتو HRP الركيزة | الحرارية فيشر العلمية | 34580 | عالية الحساسية HRP الركيزة |
| الطرد المركزي المنضدية | Thermo Fisher Scientific | 75004524 | |
| نظام Trans-Blot شبه الجاف | Bio-Rad | 170-3940 | |
| تريس | سيجما | TRIS-RO | |
| توين 20 ؛ | Sigma | P1379 | |
| عديد السكاريد الدهني فائق النقاء (LPS) من الإشريكية القولونية 0111: B4 | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
| خلايا Vero | ATCC | CCL-81 | خط الخلايا لتحديد العيار الفيروسي HSV1 |
المراجع
- Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171(1996).
- Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
