مقالة منهجية

تصوير ماكرو مضان مدى الحياة للتطبيقات الطبية الحيوية

DOI:

10.3791/64321

⸱

أبريل 7, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الورقة استخدام جهاز تصوير بصري جديد وسريع لتصوير عمر التلألؤ الضوئي العياني للعينات الباعثة للاضمحلال الطويل. يتم وصف إجراءات التكامل والحصول على الصور والتحليل ، جنبا إلى جنب مع إعداد وتوصيف مواد الاستشعار للتصوير وتطبيق التصوير في دراسة العينات البيولوجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الورقة جهاز تصوير جديد لمدى الحياة للتلألؤ الضوئي مصمم لرسم خريطة لتركيز الأكسجين الجزيئي (O 2) في عينات فسفورية مختلفة تتراوح من الطلاءات الصلبة الحساسة ل O 2 إلى عينات الأنسجة الحيوانية الحية الملطخة بمجسات حساسة O2 قابلة للذوبان. على وجه الخصوص ، تم استخدام مسبار الأشعة تحت الحمراء القريبة من الجسيمات النانوية NanO2-IR ، والذي يمكن استثارته باستخدام الصمام الثنائي الباعث للضوء 625 نانومتر (LED) وينبعث عند 760 نانومتر. يعتمد نظام التصوير على كاميرا Timepix3 (Tpx3Cam) والمحول البصري الميكانيكي ، والذي يضم أيضا مكثفا للصورة. O2 الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة للفسفور (PLIM) مطلوب بشكل شائع للدراسات المختلفة ، لكن المنصات الحالية لها قيود في دقتها ومرونتها العامة وسهولة استخدامها.

النظام المعروض هنا عبارة عن جهاز تصوير سريع وحساس للغاية ، وهو مبني على مستشعر بصري مدمج ووحدة رقاقة قراءة ، Tpx3Cam. يظهر أنه ينتج إشارات فسفرة عالية الكثافة وقيم عمر مستقرة من عينات الأنسجة المعوية الملطخة بالسطح أو الشظايا الملطخة داخل الأمعاء الغليظة ويسمح برسم خرائط مفصلة لمستويات الأنسجة O2 في حوالي 20 ثانية أو أقل. كما يتم تقديم التجارب الأولية على تصوير نقص الأكسجة في الأورام المطعمة في الحيوانات اللاواعية. نصف أيضا كيف يمكن إعادة تكوين جهاز التصوير للاستخدام مع المواد الحساسة O2 بناء على أصباغ Pt-porphyrin باستخدام مصباح LED 390 نانومتر للإثارة ومرشح تمرير النطاق 650 نانومتر للانبعاثات. بشكل عام ، وجد أن جهاز التصوير PLIM ينتج قياسات كمية دقيقة لقيم العمر للمجسات المستخدمة والخرائط ثنائية الأبعاد ذات الصلة لتركيز O2 . كما أنه مفيد للتصوير الأيضي لنماذج الأنسجة خارج الجسم الحي والحيوانات الحية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O 2 هو أحد المعلمات البيئية الرئيسية للأنظمة الحية ، ومعرفة توزيع O 2 وديناميكياته مهمة للعديد من الدراسات البيولوجية1،2،3. يكتسب تقييم أكسجة الأنسجة عن طريق المجسات الفسفورية4،5،6،7،8 و PLIM 9،10،11،12،13 شعبية في البحوث البيولوجية والطبية3،9،14،15،16 ، 17,18,19. وذلك لأن PLIM ، على عكس قياسات شدة التألق أو الفسفرة ، لا يتأثر بالعوامل الخارجية مثل تركيز المسبار ، والتبييض الضوئي ، وشدة الإثارة ، والمحاذاة البصرية ، والتشتت ، والتألق الذاتي.

ومع ذلك ، فإن منصات O2 PLIM الحالية محدودة بحساسيتها وسرعة التقاط الصور ودقتها وقابليتها للاستخدام بشكل عام. كثيرا ما يستخدم عد الفوتون المفرد المرتبط بالوقت (TCSPC) ، جنبا إلى جنب مع إجراء المسح النقطي ، في أجهزة PLIM والتصوير المجهري مدى الحياة (FLIM)20،21،22. ومع ذلك ، نظرا لأن PLIM يتطلب وقتا طويلا لبقاء البكسل (في نطاق ميلي ثانية) ، فإن وقت الحصول على الصور أطول بكثير مما هو مطلوب لتطبيقات FLIM20،22،23. تقنيات أخرى ، مثل كاميرات CCD / CMOS ذات البوابات ، تفتقر إلى حساسية الفوتون الفردي ولها معدلات إطارات منخفضة20،24،25،26. علاوة على ذلك ، تستخدم أنظمة PLIM الحالية في الغالب في الشكل المجهري ، في حين أن الأنظمة العيانية أقل شيوعا27.

تم إعداد جهاز تصوير الماكروPLIM 28 المستند إلى TCSPC للتغلب على العديد من هذه القيود. تم تسهيل تصميم جهاز التصوير إلى حد كبير من خلال استخدام محول ميكانيكي بصري جديد ، Cricket ، والذي يحتوي على ما يلي: ط) محولان C-mount ، يوفران سهولة اقتران وحدة الكاميرا على الجانب الخلفي والعدسة الموضوعية على الجانب الأمامي ؛ ب) مبيت داخلي لمكثف الصورة ومقبس طاقة للأخير على الجانب الخارجي من لعبة الكريكيت ؛ iii) مساحة داخلية خلف محول C-mount الأمامي حيث يمكن وضع مرشح انبعاث قياسي 25 مم أمام المكثف ؛ و iv) بصريات موازية للضوء مدمجة مع منظمات حلقية ، والتي تسمح بالمحاذاة / التركيز البصري بين العدسة والكاميرا لإنتاج صور واضحة على شريحة الكاميرا.

في جهاز التصوير المجمع ، تقترن وحدة الكاميرا بالجانب الخلفي من محول الكريكيت ، والذي يضم أيضا مكثفا للصورة يتكون من كاثود ضوئي متبوعا بلوحة قناة دقيقة (MCP) ، ومكبر للصوت ، وميض سريع ، فوسفور P47. تم تركيب مرشح انبعاث 760 نانومتر ± 50 نانومتر داخل لعبة الكريكيت ، وعدسة موضوعية ، NMV-50M11 '' ، متصلة بمحول C-mount الأمامي الجانبي. أخيرا ، يتم محاذاة العدسة والكاميرا بصريا مع منظمات الحلقة.

يتمثل دور المكثف في اكتشاف الفوتونات الواردة وتحويلها إلى رشقات نارية سريعة من الضوء على شريحة الكاميرا ، والتي يتم تسجيلها واستخدامها لتوليد اضمحلال الانبعاثات والصور مدى الحياة. تشتمل وحدة الكاميرا على مجموعة مستشعرات بصرية متقدمة قائمة على TCSPC (256 بكسل × 256 بكسل) وشريحة قراءة من الجيل الجديد29،30،31،32،33 ، والتي تسمح بالتسجيل المتزامن لوقت الوصول (TOA) والوقت فوق عتبة (TOT) من رشقات الفوتون في كل بكسل من رقاقة التصوير بدقة زمنية تبلغ 1.6 نانوثانية ومعدل قراءة 80 ميجابكسل / ثانية.

في هذا التكوين ، تتميز الكاميرا المزودة بالمكثف بحساسية فوتون واحد. إنه يعتمد على البيانات ويستند إلى نظام قراءة كاشف البكسل السريع (SPIDR)34. تميزت الدقة المكانية للتصوير سابقا بمستشعرات O2 الفسفورية المستوية وقناع لوحة الدقة. تم قياس وظيفة استجابة الجهاز (IRF) عن طريق تصوير مستشعر الفلورسنت المستوي تحت نفس الإعدادات المستخدمة في جميع القياسات الأخرى. كان عمر الصبغة البالغ حوالي 2.6 نانوثانية قصيرا بما يكفي لاستخدامه لقياس IRF في وضع PLIM. يمكن للتصوير تصوير كائنات يصل حجمها إلى 18 مم × 18 مم بدقة مكانية وزمانية تبلغ 39.4 ميكرومتر و 30.6 نانوثانية (العرض الكامل بنصف الحد الأقصى) ،على التوالي 28.

تصف البروتوكولات التالية تجميع جهاز تصوير الماكرو واستخدامه اللاحق لرسم خرائط تركيز O 2 في العينات البيولوجية الملطخة بمسبار O2 القريب من الأشعة تحت الحمراء ، NanO2-IR35. المسبار عبارة عن مسبار O2 ساطع وقابل للضوء ومنفذ للخلايا يعتمد على صبغة البلاتين (II) البنزوبورفيرين (PtBP). إنه مثير عند 625 نانومتر ، وينبعث عند 760 نانومتر ، ويوفر استجابة بصرية قوية ل O 2 في النطاق الفسيولوجي (0٪ -21٪ أو 0-210 ميكرومتر من O2). كما تم عرض جهاز التصوير لتوصيف مواد الاستشعار المختلفة بناء على أصباغ البورفيرين Pt (II). بشكل عام ، يكون جهاز التصوير مضغوطا ومرنا ، على غرار كاميرا التصوير الفوتوغرافي الشائعة. في الإعداد الحالي ، يكون جهاز التصوير مناسبا لتطبيقات PLIM واسعة المجال المختلفة. سيؤدي استبدال LED بمصدر ليزر سريع إلى زيادة تحسين أداء جهاز التصوير ويمكن أن يؤدي إلى تمكين تطبيقات FLIM نانوثانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات مع الحيوانات بموجب تراخيص صادرة عن هيئة تنظيم المنتجات الصحية (HPRA ، أيرلندا) وفقا لتوجيه مجلس المجتمعات الأوروبية (2010/63 / EU) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات في كلية كورك الجامعية.

1. إعداد العينة

  1. تلطيخ مع التحقيق من عينات الأنسجة الحية خارج الجسم الحي
    1. للتطبيقات خارج الجسم الحي ، استخدم عينات الأنسجة المعزولة حديثا من إناث الفئران Balb / c البالغة من العمر 4 أسابيع.
    2. في يوم التجربة ، القتل الرحيم للفأر عن طريق قطع الرأس ، وتشريح شظايا القولون (الأمعاء الغليظة) بسرعة ، بحجم 10 مم تقريبا. اغسلها على الفور باستخدام محلول PBS ، وضعها في وسط DMEM مع استكمال 10 mM Hepes buffer (درجة الحموضة 7.2) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية36.
    3. للتلطيخ السطحي للجانب المصلي من الأمعاء ، انقل عينات الأنسجة الحية إلى طبق صغير ، ضع 2 مل من DMEM الكامل الذي يحتوي على مسبار NanO2-IR 1 مجم / مل لتغطية عينات الأنسجة ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تبقى الخلايا في أنسجة ما بعد الوفاة حية لعدة ساعات في الثقافة. يظهر NaNO2-IR سمية خلوية طفيفة ، لذلك تم الانتهاء من جميع التجارب في غضون 4 ساعات بعد عزل الأنسجة.
    4. لتلطيخ الأنسجة العميقة داخل الجسم الحي ، انقل قطع الأمعاء إلى طبق بتري جاف ، وقم بإزالة أي DMEM زائد باستخدام ورق الترشيح.
    5. حقن 1 ميكرولتر من DMEM يحتوي على 1 ملغ / مل NanO2-IR 35 في التجويف باستخدام حقنة هاملتون ، واحتضان العينات لمدة15 دقيقة أو لمدة تصل إلى 4 ساعات.
      ملاحظة: يظهر NaNO2-IR تأثيرات سامة للخلايا طفيفة على المدى الطويل ؛ لذلك ، يجب إكمال جميع التجارب في غضون 4 ساعات بعد عزل الأنسجة.
  2. تحضير أنسجة الورم الملطخة في الحيوانات الحية
    1. بالنسبة للتطبيقات في الجسم الحي ، خلايا CT26 قبل الصبغة لمدة 18 ساعة في وسط خال من المصل يحتوي على مسبار NaNO2-IR عند 0.05 مجم / مل.
    2. خذ الماوس ، احلق منطقة الحقن في الجهة اليمنى ، واحقن بحقنة 200 ميكرولتر من خليط من 1 × 10 5 خلايا غير ملطخة و 1 × 105 خلايا ملطخة مسبقا ب NanO2-IR .
    3. السماح للأورام بالنمو في الفئران ، ومراقبة حجم الورم باستخدام الفرجار ووزن الحيوان بشكل دوري37. تصبح الحيوانات المصابة بأورام مطعمة جاهزة للتصوير في اليوم السابع من نمو الورم.
      ملاحظة: تم حساب حجم الورم باستخدام المعادلة (1):
      V = (L × W 2) / 2 (1)
      حيث L هو قطر الورم ، و W is القطر عمودي على القطر L.
    4. التضحية بالحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم قبل التصوير مباشرة.

2. إعداد التصوير PLIM

  1. خذ محول الكريكيت ، وقم بإزالة محول C-mount الخلفي للوصول إلى غلاف المكثف بالداخل. أدخل مكثف الصور MCP-125 في هذه الحجرة ، ثم أعد محول C-mount.
  2. قم بإزالة محول C-mount الأمامي للكريكيت ، وأدخل مرشح الانبعاثات 760 نانومتر ± 50 نانومتر ، وقم بإصلاحه عن طريق إعادة C-mount.
  3. قم بتوصيل وحدة الكاميرا Tpx3Cam بالجانب الخلفي من وحدة الكريكيت عبر محول C-mount الخاص بها
  4. قم بتوصيل العدسة بالجانب الأمامي من وحدة الكريكيت عبر محول C-mount الخاص بها.
  5. قم بتركيب مجموعة الكاميرا بالكامل أعلى الصندوق الأسود البصري ، متجها لأسفل إلى المرحلة التي سيتم تصوير العينات عليها (الشكل 1).
  6. قم بتركيب مصباح LED فائق السطوع 624 نانومتر على عمود متصل بلوح تجارب داخل الصندوق الأسود.
  7. قم بتوصيل مؤشر LED بمصدر طاقة ومولد نبض. قم بتشغيل LED ، وركزه لضمان إثارة فعالة وموحدة للعينات المصورة.
  8. قم بتوصيل الكاميرا بمولد نبضات آخر ، وقم بمزامنة النبضات المرسلة إلى الكاميرا ومؤشر LED38.
  9. باستخدام الكبل والمقبس الخاصين على وحدة الكريكيت ، قم بتوصيل المكثف بمصدر طاقة قياسي ، واضبط الكسب على 2.7 فولت.
  10. باستخدام إمكانات التركيز البؤري للعدسة ومحول الكريكيت ، ركز بصريات الكاميرا على مرحلة العينة لإنشاء صور واضحة للعينات ذات تباين وسطوع جيدين.
  11. لاستخدام جهاز التصوير مع أصباغ Pt-porphyrin ، استبدل 625 نانومتر LED بمصباح LED 390 نانومتر للإثارة ، واستبدل مرشح 760 نانومتر ± 50 نانومتر بمرشح 650 نانومتر ± 50 نانومتر في وحدة الكريكيت.

3. الحصول على الصور

  1. ضع العينة أمام عدسة الكاميرا.
    ملاحظة: استخدم مرحلة قابلة للتعديل x-y-z كحامل للعينة لضبط موضع العينة للحصول على تركيز جيد.
  2. أطفئ جميع الأنوار في الغرفة.
  3. قم بتشغيل برنامج Sophy لضبط المعلمات التشغيلية ، مثل التركيز ومحاذاة العينة.
    ملاحظة: يتم توفير برنامج Sophy مع الكاميرا لإعداد معلمات التصوير وتسجيل البيانات. تأكد من توصيل البرنامج بالكاميرا عن طريق التحقق من رمز الكاميرا. ومع ذلك ، استخدمنا برنامجا مختلفا للحصول على البيانات.
  4. في الوحدات النمطية، حدد إطارات لا نهائية، واضبط وضع تشغيل البيكسل على الوقت فوق الحد.
  5. في الوحدات النمطية، انتقل إلى معاينة، وحدد الوحدة النشطة. يؤدي هذا إلى فتح نافذة إطارات Medpix / Timpix .
  6. في هذه النافذة ، قم بتغيير مقياس الألوان ، وقم بتدوير الصورة إلى الاتجاه المطلوب.
  7. قم بتشغيل المكثف ، وابدأ التسجيل.
    ملاحظة: استخدم شاشة التسجيل الخاصة ببرنامج Sophy للتأكيد بصريا على محاذاة العينة وتركيزها ولتحسين معلمات إثارة LED للتسجيل.
  8. أوقف التسجيل وأغلق برنامج Sophy.
  9. انتقل إلى المحطة ، واستخدم البرنامج المصمم خصيصا للحصول على البيانات الأولية بالتنسيق الثنائي ومعالجتها بعد ذلك (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. في المحطة الطرفية ، قم بتشغيل الأوامر التالية لتسجيل البيانات:
      وثيقة القرص المضغوط / SPIDR / الجذع / الإصدار /
       هل
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {اسم الملف} - t {وقت الاستحواذ}
      ملاحظة: عند كتابة "ls" ، تحقق من قائمة الملفات في الدليل الحالي ؛ تأكد من رؤية Tpx3daq.
    2. انتظر حتى يتم تسجيل جميع الإطارات.
    3. لمعالجة البيانات ، قم بتشغيل الأوامر التالية في الجهاز:
      وثائق القرص المضغوط / معالجة البيانات / Timepix3 / Timepix3 /
      جذر
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. انتظر حتى تفتح نافذة RRGui . حدد جميع المتغيرات على اليسار وجميع البيانات وملف واحد و Centroid على اليمين.
    5. حدد الملف المراد معالجته وتشغيل مخفض البيانات.
      ملاحظة: ستظهر كافة الملفات المعالجة في نفس المجلد مثل الملف الخام.

4. تحليل البيانات

  1. قم بتحليل البيانات التي تمت معالجتها بعد المعالجة باستخدام برنامج مخصص مكتوب بلغة C والذي سيكتب البيانات في ملف صورة .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
  2. افتح ملفات الصور .ics باستخدام برنامج Time Resolved Imaging المتاح مجانا (انظر جدول المواد). استخدم الدوال الأسية الثنائية لتناسب اضمحلال الفسفرة.
  3. افتح ملفات الصور .ics المجهزة باستخدام برنامج تحليل الصور المتاح (انظر جدول المواد).
  4. باستخدام جداول البحث ، قم بإنشاء صور فسفورية مدى الحياة ، وقم بترميزها بمقياس ألوان زائفة (على سبيل المثال ، اللون الأزرق للأعمار القصيرة والأحمر للأعمار الطويلة). استخدم وظيفة القياس لحساب متوسط قيم العمر للصورة بأكملها أو مناطق اهتمام محددة (ROIs).
  5. قم بتحويل قيم العمر إلى تركيز الأكسجين باستخدام المعادلة التي تم الحصول عليها من تركيب معايرة O2 للمسبار36.
    ملاحظة: استخدمت المعادلة (2) لهذا العمل:
    O 2 [ميكرومتر] = −86.16 + 770.35 × e−0.049 × LT (2)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لتطبيقات التصوير خارج الجسم الحي ، تم تلطيخ شظايا الأنسجة المعوية من خلال التطبيق الموضعي لمسبار NanO2-IR على الجانب المصلي من الأنسجة. لتلطيخ أعمق ، تم حقن 1 ميكرولتر من المسبار في التجويف. في الحالة الأخيرة ، يحمي جدار الأمعاء بسمك 0.2-0.25 مم المسبار من الكاميرا. يتم توضيح عمليتي التلوين في الشكل 2 أ.

يتم عرض الكثافة الناتجة وصور PLIM في الشكل 2B-G. تعكس الألوان بوضوح الاختلاف في ق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم البروتوكولات المذكورة أعلاه وصفا تفصيليا لتجميع جهاز التصوير الجديد وتشغيله في وضع FLIM / PLIM بالميكروثانية. تنتج كاميرا Tpx3Cam من الجيل الجديد المستندة إلى TCSPC ، إلى جانب المحول البصري الميكانيكي Cricket مع مكثف الصورة ومرشح الانبعاثات وعدسة الماكرو ، وحدة بصرية مستقرة ومضغوطة ومرنة سهلة التشغيل. وقد تبين أن جهاز التصوير يعمل بشكل جيد مع مجموعة من العينات المختلفة والمهام التحليلية ، والتي تضمنت توصيف المواد الفسفورية وتصوير الأنسجة الحية O2 . تم استخدام مسبار NanO2-IR القابل للذوبان القائم على الأشع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدعم المالي لهذا العمل من مؤسسة العلوم في أيرلندا ، والمنح SFI / 12 / RC / 2276_P2 و SFI / 17 / RC-PhD / 3484 و 18 / SP / 3522 ، وأبحاث السرطان الخارقة (علم الأورام الدقيق أيرلندا) معترف بها بامتنان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

يمكن استبدال أجزاء برنامج Software

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
LED 627 نانومترالسريعةبمصابيح LED مختلفة بناء على الطول الموجي للإثارة للمستشعر. تستخدم 390 نانومتر LED لأصباغ Pt-porphyrin.
760 & plusmn; 50 نانومتر مرشح انبعاثEdmund Optics84-788يمكن استبداله بمرشح مختلف بناء على الطول الموجي للانبعاث للمستشعر. مستعملة 650 & plusmn; مرشح ممر النطاق 50 نانومتر لأصباغ Pt-porphyrin.
Balb / ج الفئرانEnvigo, المملكة المتحدةBalb / ج
الصندوق الأسودThorlabsXE25C9 / M
محول الكريكيتPhotonisCricket-2
CT26 الخلايا  ATCCCT26. WThttps://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEMSigma-AldrichD0697يمكن أيضا استخدام وسائط أخرى
ImageJImageJFree Image Analysis. يمكن تنزيله من: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
مكثف الصور MCP-125 مع شاشة الفوسفور P47PhotonisPP0360EF
أطباق صغيرةSarstedt83.3900.300قطر 35 مم   ؛
فيلم مايلر بلاستيك ، 75 ميكرون   ؛RS Ireland785-0795يمكن أيضا استخدام الركائز البلاستيكية
NanO2-IRمحلية الصنعn / aيمكن تصنيع المسبار وفقا للطريقة المنشورة "Tsytsarev V و Arakawa H و Borisov S و Pumbo E و Erzurumlu RS و Papkovsky DB. التصوير في الجسم الحي لنشاط التمثيل الغذائي في الدماغ باستخدام مسبار حساس للأكسجين الفسفوري. طرق علوم العصاب J. 2013 يونيو 15; 216(2):146-51. دوي: 10.1016 / j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 أبريل 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' أو مقدمة من مختبرنا.
NMV-50M11 "50 مم عدسةNavitarيمكن استخدام عدسات أخرى متوافقة مع Adators C-mount
لوح تبريد بصريThorlabsMB1836
أطباق بتريSarstedt82.1472.001قطر 92 مم
مزود الطاقةTenma72-10495
مولد النبضTenmaTGP110
Sophyأمستردام للأدوات العلميةn / zمقدمة من ASI جنبا إلى جنب مع برنامج Tpx3Cam
Tpx3CamAmsterdam Scientific InstrumentsTPXCAM
Tri2University of OxfordN / aبرنامج التصوير الذي تم حله في وقت الفراغ ، يمكن تنزيله من:
https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml مرحلة الترجمة XYZThorlabsLT3

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  2. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  3. Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
  4. Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
  5. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  6. O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
  7. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
  8. Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150(2017).
  9. Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
  10. Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
  11. Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
  12. Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
  13. Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
  14. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  15. Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111(2016).
  16. Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
  17. Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
  18. Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
  19. Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
  20. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
  21. Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
  22. Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
  23. Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800(2017).
  24. Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003(2017).
  25. Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602(2014).
  26. Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707(2017).
  27. Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
  28. Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591(2020).
  29. Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
  30. Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
  31. Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013(2014).
  32. Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017(2017).
  33. Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104(2017).
  34. Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028(2015).
  35. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  36. Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006(2020).
  37. Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
  38. Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
  39. Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
  40. Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459(2020).
  41. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Timepix3 TCSPC

مقالات ذات صلة