مقالة منهجية

فرط الحساسية التماسية كنموذج مورين لالتهاب الجلد التماسي التحسسي

3.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64329

⸱

سبتمبر 26, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

فرط الحساسية التماسية (CHS) هو نموذج تجريبي للفئران لالتهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD). يعتمد CHS على التحسس باستخدام hapten التفاعلي عن طريق طلاء الجلد الحليق للصدر والبطن ، مع تحدي جلد الأذن اللاحق باستخدام هابتن مخفف ، مما يسبب رد فعل تورم يتم تقييمه بطرق مختلفة.

الملخص

فرط الحساسية التماسية (CHS) هو نموذج تجريبي لالتهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD) يمكن دراسته على الفئران. تهدف هذه الدراسة إلى تقديم طريقة مختبرية موضوعية قد تساعد في دراسة تفاعل CHS في الفئران ، والتي يمكن قياسها وتحديدها كميا من خلال اختبارات مختلفة. وللحث على CHS، في اليوم "0"، تم تحسس الفئران على بقعة كانت محلوقة سابقا عن طريق طلاء جلد البطن باستخدام الهابتن 2،4،6-trinitrochlorobenzene (TNCB) في خليط الأسيتون والإيثانول، في حين تم تحسس الفئران ذات التحكم السلبي بخليط الأسيتون والإيثانول وحده في السيارة. في اليوم "4" ، تم قياس سمك الأذن الأساسي بميكرومتر قبل استنباط CHS (التحدي) عن طريق طلاء كلتا الأذنين ب TNCB المخفف في كل من مجموعات الاختبار والتحكم. بعد 24 ساعة ، تم قياس تورم الأذن باستخدام ميكرومتر. CHS هو مثال على الاستجابة المناعية بوساطة الخلايا التائية التي تسبب تورما في الأنسجة الملتهبة ، وتبلغ ذروتها بعد 24 ساعة من تحدي الجلد بنفس الهابتن. ارتبطت الزيادة في وذمة الأذن بزيادة وزن الأذن ، ونشاط الميلوبيروكسيديز (MPO) ، وتركيز السيتوكين المؤيد للالتهابات في مستخلصات الأذن ، وزيادة سماكة الأدمة الوذمية في الفحص النسيجي ، ونفاذية الأوعية الدموية في الأذن. كانت هناك أيضا زيادة في تركيز الأجسام المضادة IgG1 الخاصة ب TNP في مصال مجموعة الاختبار عند مقارنتها بالفئران الضابطة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن نقل هذه المواد بنجاح باستخدام الخلايا المستجيبة ل CHS التي تم الحصول عليها من الجهات المانحة التي سبق توعيتها باستخدام TNCB. تم إعطاء الخلايا المستجيبة ل CHS عن طريق الوريد في الفئران المتلقية الساذجة ، والتي تم تحديها لاحقا بنفس الهابتن المخفف. تم قياس تورم الأذن مع ميكرومتر 24 ساعة في وقت لاحق.

المقدمة

التهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD) هو مرض التهابي جلدي شائع في البلدان الصناعية ناجم عن تفاعل فرط الحساسية من النوع الرابع الناتج عن التعرض لمواد كيميائية منخفضة الوزن الجزيئي تسمى haptens. تشمل المواد المسببة للتحسس التماسي لدى البشر أيونات المعادن الثقيلة (الكروم والنيكل والحديد والكوبالت) وزيت التربنتين والعطور والأصباغ والمواد الحافظة الموجودة في مستحضرات التجميل (على سبيل المثال ، p-phenylenediamine) ، وبعض الأدوية (مثل النيومايسين والبنزوكايين) والمضادات الحيوية β-lactam (أي البنسلين) والمواد الكيميائية التي تنتجها النباتات (pentadecacatechol ، وهي مادة موجودة في اللبلاب السام) ، وكذلك الهيدروكينون المستخدم في صناعة التصوير الفوتوغرافي 1,2 . العوامل المسببة ل ACD عالية جدا حيث يتم استخدام أكثر من 100000 مادة كيميائية في الصناعة وحدها ، ويتم تصنيع 2000 مادة كيميائية جديدة كل عام. حتى الآن ، تم تحديد أكثر من 3700 جزيء قد يكون ملامسا للهابتنز / المواد المسببة للحساسية3. تفاعل فرط الحساسية التماسية (CHS) هو نموذج تجريبي ل ACD يمكن دراسته في الفئران والخنازير الغينية والجرذان ويمكن أن يسببه التطبيق الجلدي الموضعي للهابتنز الكيميائي التفاعلي المذاب في المذيبات العضوية 4,5,6. تهدف هذه الدراسة إلى وصف طريقة مختبرية موضوعية قد تساعد في دراسة تفاعل CHS في الفئران ، والتي يمكن قياسها وتحديدها كميا من خلال اختبارات مختلفة.

يتكون CHS من مراحل التوعية (الحث) والمستجيب (التحدي). في النماذج الحيوانية ، ترتبط الهابتنز أولا تساهميا بالبروتينات في الجسم لإنشاء مستضدات جديدة. خلال مرحلة التحسس، تعزز الخلايا الكيراتينية المنشطة هجرة ونضج الخلايا المتغصنة الجلدية (sDCs) عن طريق إنتاج عامل نخر السيتوكينات المؤيد للالتهابات α (TNF-α) والإنترلوكين 1β (IL-1β)7. تقدم خلايا لانجرهانز الجلدية (LCs) مستضدات خلال مراحل الحث والمستجيب CHS8. LCs المعرضة للهابتن أثناء التحسس تعزز تحريض كل من الخلايا التنظيمية والمستجيبة9. تشير الأدلة المتزايدة من العديد من الدراسات إلى أن استجابات CHS يمكن أن تتوسط فيها إما خلايا Th1 المقيدة من الفئة الثانية CD4 + MHC ، والتي تطلق محليا γ الإنترفيرون (IFN-γ) لاستخدام تسلل التهابي مميز ، والخلايا الليمفاوية Tc1 المقيدة من الفئة الأولى CD8 + MHC التي يمكنها أيضا إطلاق γ IFN ولكن في الغالب توسط الضرر السام للخلايا للخلايا الكيراتينية ، والآن أيضا خلايا Th17 المنتجة للإنترلوكين 17 (IL-17)10 ، 11.

تم تطوير العديد من نماذج CHS المختلفة التي تستخدم أنواعا مختلفة 1 2,13,14 و haptens (يتم تلخيص مقارنة مفصلة بين مختلف haptens والمذيبات ووقت التطبيق في الجدول 1). يقدم الفأر ، وهو نوع مختبري يستخدم بشكل متكرر ، بعض المزايا في دراسة CHS. هناك المزيد من السلالات والضربات القاضية (KO) والحيوانات المعدلة وراثيا بين الفئران مقارنة بالأنواع الأخرى ، مما يجعلها حيوانا جذابا للغاية15. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب نموذج CHS العديد من الحيوانات ، والفئران أكثر اقتصادا هنا. النماذج الحيوانية لا تحاكي ACD في جميع الجوانب. على وجه الخصوص ، فإنها تظهر التقشر والتقشر ، وهو أمر غير شائع بالنسبة للبشر16,17. من الصعب إعادة إنتاج ميزات الأمراض المزمنة ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن النموذج الموصوف لا يفترض تطبيق hapten لفترة طويلة من الزمن. ومع ذلك، فقد تأكد هنا أن العديد من الجوانب الهامة لحوار التعاون الآسيوي مستنسخة. وقد تبين أيضا أنه ، كما هو الحال في البشر ، ترتبط هذه الميزات بالحساسية المحلية. تم إملاء اختيار hapten ومذيبه وتطبيقه الموضح في هذا البروتوكول من خلال حقيقة أن النتائج قد تم تأكيدها من خلال العديد من الاختبارات في المختبر وأنه تم اختبارها وتعديلها في المختبر لسنوات عديدة حتى تم إنشاء الإصدار الحالي. تسمح نماذج المورين بتحليل المجموعات الفرعية للخلايا أو السيتوكينات التي تشارك في تطوير ACD وهي ضرورية للتقييمات قبل السريرية للعلاجات الجديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب المقدمة في هذه المقالة وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقية المحلية 1st للتجارب على الحيوانات في كراكوف. تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للتوصيات المحلية ، خاصة فيما يتعلق باستخدام الكيتامين / الزيلازين كمخدر ، واستخدام جانبي الأذنين لتطبيق المادة / hapten ، وقطع الأذن ، وجمع الدم عن طريق إزالة مقلة العين. تم استخدام BALB/c (النمط الفرداني H-2d) و CBA/J (H-2k) و C57BL/6 (H-2b) من ذكور وإناث الفئران التي يتراوح عمرها بين 6 و 12 أسبوعا في هذه الدراسة (انظر جدول المواد). بالنسبة للدلالة الإحصائية ، من الأفضل أن تتكون كل مجموعة من الفئران من 10-12 حيوانا.

1. إعداد الحيوان

  1. نظف طاولة العمليات بمحلول إيثانول بنسبة 70٪ قبل وبعد جميع الإجراءات. في حالة استخدام الفئران التي تتطلب ظروفا معقمة ، فقم بإجراء جميع العمليات في خزانة السلامة الأحيائية.

2. وضع علامات على الفئران لتحديد هويتها

  1. قم بتسمية الفئران عن طريق حلق الجلد بشفرة حلاقة: # 0 - بدون علامة ، # 2 - على المخلب الأمامي الأيمن ، # 3 - على الجانب الأيمن ، # 4 - على المخلب الخلفي الأيمن ، # 5 - في قاعدة الذيل ، # 6 - على المخلب الخلفي الأيسر ، # 7 - على الجانب الأيسر ، # 8 - على المخلب الأمامي الأيسر.
    ملاحظة: بسبب التفاعل المستحث، لا يمكن تمييز الفئران بشكل كلاسيكي عن طريق لكم الأذن أو وضع العلامات. لم يتم تخدير الفئران أثناء وضع العلامات.

3. تحريض CHS

ملاحظة: يوضح الشكل 1 هذا الإجراء.

  1. قم بإجراء التحسس (الحث) باتباع الخطوات أدناه.
    1. في اليوم "0" ، حلق الفئران على الصدر والبطن (مربع 2 سم × 2 سم) عن طريق تطبيق الصابون الرمادي بالماء والحلاقة بشفرة حلاقة.
      ملاحظة: قبل تطبيق hapten ، انتظر لمدة 6 ساعات حتى لا يتهيج الجلد.
    2. تحضير 5٪ هابتن: 2،4،6-ترينيتروكلوروبنزين (TNCB ، انظر جدول المواد) في خليط الأسيتون والإيثانول (نسبة 1: 3) أو السيارة وحدها (الأسيتون - الإيثانول). قم بإعداد المحاليل قبل الاستخدام مباشرة في قارورة زجاجية وحمايتها من الضوء عن طريق تغطية القارورة بورق الألومنيوم.
    3. في نفس اليوم ، قم بتحسس الفئران عن طريق تطبيق 150 ميكرولتر من 5٪ hapten على البقعة المحلوقة سابقا. في مجموعة الفئران الضابطة ، ضع السيارة وحدها لتقييم التفاعل الالتهابي غير المحدد. قبل وضع الحيوان مرة أخرى في القفص ، انتظر لمدة 30 ثانية ، واترك hapten يجف.
      تحذير: استخدام القفازات; يسبب TNCB رد فعل تحسسي شديد لدى معظم الناس.
  2. إجراء الاستنباط (التحدي) وقياس تورم الأذن.
    1. في اليوم "4" ، قم بإعداد 0.4٪ hapten: TNCB في خليط الأسيتون والإيثانول (نسبة 1: 1). قم بإعداد المحلول قبل الاستخدام مباشرة في قارورة زجاجية وقم بحمايته من الضوء عن طريق تغطية القارورة بورق الألومنيوم.
    2. تخدير الفئران عن طريق حقن داخل الصفاق (i.p) من خليط من الكيتامين (90-120 ملغم / كغ) والزيلازين (5-10 ملغ / كغ) (انظر جدول المواد) للتخدير العميق. تأكد من تخدير الماوس بالكامل لمدة 5 دقائق على الأقل عن طريق قرصة إصبع القدم.
    3. قم بقياس سمك الأذن (قياس 0 ساعة ، خط الأساس) باستخدام ميكرومتر (انظر جدول المواد) من قبل مراقب غير مدرك للمجموعات التجريبية.
    4. ضع 10 ميكرولتر من 0.4٪ hapten على جانبي الأذنين في كلتا المجموعتين (الاختبار والتحكم). قبل وضع الحيوان مرة أخرى في القفص ، انتظر لمدة 30 ثانية واسمح للهابتن أن يجف.
    5. في اليوم "5" ، بعد 24 ساعة من تطبيق hapten ، كرر الخطوات 3.2.2-3.2.3 لقياس 24 ساعة.
    6. قم بتقييم استجابة CHS عن طريق حساب الفرق في سمك الأذن قبل وبعد التحدي باستخدام hapten: سمك الأذن 24 ساعة (ميكرومتر) - 0 ساعة سمك الأذن (ميكرومتر). عد كل أذن كقياس منفصل. بعد ذلك ، عبر عن تورم الأذن بالميكرومتر (μm) ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) (الجدول 2 ، الشكل 3).

4. خزعات الأذن

  1. مباشرة بعد قياس 24 ساعة لسمك الأذن (عندما لا يزال الماوس تحت التخدير العميق) ، اقطع الأذنين بالقرب من الجمجمة قدر الإمكان باستخدام مقص. اجمع الخزعات من الجانب البعيد من الأذنين عن طريق عمل لكمة قطرها 6 مم باستخدام لكمة خزعة (انظر جدول المواد).
    1. قم بقياس وزن الأذن (الخطوة 4.2) بالإضافة إلى إجراء أحد الاختبارات التالية على خزعة الأذن نفسها: فحص الميلوبيروكسيديز (MPO) (الخطوة 4.3) أو القياس المختبري لتركيز السيتوكين في مستخلصات الأذن (على سبيل المثال ، IFN-γ ، IL-17A ، TNF-α [الخطوة 4.4]).
      ملاحظة: قطع الأذنين قبل جمع الدم. بعد هذا الإجراء ، يجب قتل الفئران الرحيم (على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم).
  2. قياس وزن كل خزعة أذن على التوازن التحليلي والتعبير عنها بالملليغرام (ملغ) (الشكل 4).
  3. قم بإجراء فحص MPO باتباع الخطوات أدناه.
    1. تحضير المخزن المؤقت للتجانس عن طريق إذابة بروميد الأمونيوم سداسي أديل ثلاثي ميثيل الأمونيوم بنسبة 0.5٪ في مخزن فوسفورات 50 مليمول KH 2 PO 4/ Na2HPO4 وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.0 (يستخدم في درجة حرارة الغرفة ، RT).
    2. تجانس الخزعات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحضر لمدة 10 دقائق باستخدام مجانس مع حبات الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها 5 مم (أضف خرزتين / قارورة) (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، قم بتبريد العينة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتجانسها لمدة 10 دقائق إضافية.
      ملاحظة: تحتوي أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة على قاع دائري بحيث يمكن للخرز التحرك بسهولة.
    3. تجميد المتجانسات عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ذوبان الجليد والدوامة (تأكد من إذابة العينات). كرر هذا الإجراء 3x.
    4. جهاز الطرد المركزي المتجانسات عند 3000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. حصاد supernatants مع ماصة. عبر عن نشاط MPO بالوحدات (U) لكل 1 ملغ من البروتين.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. العينات مستقرة عند -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.
    5. لقياس نشاط MPO ، قم بإجراء تفاعل إنزيمي عن طريق خلط 20 ميكرولتر من supernatant و 200 μL من ركيزة MPO (0.167 mg / mL من ortho-dianisine dihydrochloride في 50 مليمول من KH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 المخزن المؤقت مع 5 × 10-4٪ H 2 0 2) وأضف إلى 96 لوحة مسطحة القاع. احتضان اللوحات لمدة 20 دقيقة في RT.
    6. قم بإعداد المنحنى القياسي باستخدام 20 ميكرولتر من معيار MPO بتركيزات من 0.008 U إلى 0.5 U في 200 ميكرولتر من ركيزة MPO. قم بإعداد العينة الفارغة باستخدام الركيزة MPO وحدها.
      تنبيه: استخدم قناعا أثناء العمل مع ثنائي هيدروكلوريد أورثو ديانيسين.
      ملاحظة: يجب أن تكون الألواح مصنوعة من مادة البولي بروبيلين ، والتي لديها قدرة ربط أقل حتى لا ترتبط البروتينات أو الحمض النووي.
    7. قياس الكثافة البصرية (OD) عند الطول الموجي λ = 460 نانومتر. التفاعل الأنزيمي مستقر لمدة 10 دقائق. اقرأ نشاط MPO في العينات المختبرة من المنحنى القياسي.
    8. لقياس تركيز البروتين ، استخدم 20 ميكرولتر من supernatant ، وقم بإجراء اختبار باستخدام مجموعة حمض Bicinchoninic لتحديد البروتين (انظر جدول المواد) ، وقياس OD عند λ = 562 nm (الشكل 5).
  4. إجراء قياس في المختبر من السيتوكينات في مستخلص الأذن.
    1. تجانس خزعات الأذن في RT في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل مع 500 ميكرولتر من كاشف استخراج بروتين الأنسجة (T-PER) لمدة 10 دقائق باستخدام مجانس مع خرز الفولاذ المقاوم للصدأ قطره 5 مم (أضف خرزتين / قارورة). بعد ذلك ، قم بتبريد العينة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتجانسها لمدة 10 دقائق إضافية.
      ملاحظة: تحتوي أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة على قاع دائري بحيث يمكن للخرز التحرك بسهولة.
    2. جهاز الطرد المركزي المتجانسات عند 3000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. العينات مستقرة عند -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
    3. تقييم مستويات السيتوكين باستخدام مجموعة ELISA المتاحة تجاريا (على سبيل المثال، IFN-γ) (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة (الشكل 6).

5. علم الأنسجة من أنسجة الأذن

  1. مباشرة بعد قياس 24 ساعة لسمك الأذن ، عندما لا يزال الماوس مخدرا بعمق ، اقطع الأذنين بالقرب من الجمجمة قدر الإمكان باستخدام المقص (الخطوة 4.1).
    ملاحظة: بعد هذا الإجراء ، يجب قتل الفئران الرحيم (على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم).
  2. قم بإجراء تضمين البارافين لكتل الأنسجة باتباع الخطوات أدناه.
    1. مباشرة بعد الإزالة ، ضع الأذن في ~ 10 مل من الفورمالين بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة.
    2. ضع الأذنين في كاسيت معالجة الأنسجة. ضع الكاسيت في معالج آلي (انظر جدول المواد) لدورات الجفاف (الكحول 70٪ ، 90٪ ، 100٪ ، 30 دقيقة لكل منها في RT) ، دورات التطهير (الزيلين 3x ، 30 دقيقة لكل منها في RT) ، ودورات تسلل الشمع (البارافين 3x ، 30 دقيقة لكل منها عند 56 درجة مئوية).
    3. قم بإزالة الكاسيت من المعالج الآلي، واحتفظ بلوحة التسخين حتى الحاجة. املأ قالب الشمع بالشمع الدافئ (من الموزع).
    4. قم بإزالة الأقسام من الكاسيت باستخدام ملقط دافئ ووضعها في القالب ؛ بعد ذلك ، ضع قاعدة الكاسيت في الجزء العلوي من القالب ثم املأها بمزيد من الشمع. ضعه في ماء مبرد على طبق بارد لمدة 30 دقيقة حتى يتصلب البارافين لتشكيل كتلة تحتوي على العينة.
    5. استخدم ميكروتوم دوار (انظر جدول المواد) لقطع المقاطع بسماكة ~ 5 ميكرومتر. تطفو الأقسام في حمام دافئ لتسطيحها. التقط الأقسام على شريحة مجهر زجاجية. اتركها لتجف في RT لضمان التصاق الأقسام بالشرائح.
      ملاحظة: استخدم الشرائح التي تلغي الحاجة إلى تطبيق مواد لاصقة أو طلاءات بروتينية لمنع فقدان أجزاء الأنسجة أثناء التلطيخ.
  3. أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E).
    1. قم بإعداد 17 طبقا ملطخا بما يلي: الزيلين (أربعة أطباق) ، الإيثانول 100٪ (الكحول المطلق) (أربعة أطباق) ، 90٪ الإيثانول ، 80٪ الإيثانول ، الإيثانول 70٪ ، الإيثانول 50٪ ، PBS (ثلاثة أطباق) ، محلول الهيماتوكسيلين ، محلول الإيوسين. انقل الشرائح من طبق إلى آخر وفقا للخطوات التالية ، وقم بإجراء كل ذلك في RT.
      ملاحظة: يمكن تكرار الإجراء في كل طبق حوالي 10 أضعاف (على سبيل المثال، إذا تم استخدام طبق مكون من 20 طبقة، يمكن عمل 200 بقعة دون تغيير السوائل).
    2. قم بإزالة البارافينات من الأقسام عن طريق الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الحاضنة. اغمر الشرائح في الزيلين لمدة 30 دقيقة. كرر 1x في الزيلين الجديد لمدة 30 دقيقة.
    3. اغمر الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. كرر 1x في الإيثانول الجديد 100٪ لمدة 5 دقائق. اغمر الشرائح في صف الإيثانول ، 90٪ ، 80٪ ، 70٪ ، و 50٪ ، لمدة 2 دقيقة في كل تخفيف.
    4. اغمر الشرائح في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 5 دقائق. امسح السائل الزائد من حول الأنسجة والجانب الخلفي من الشرائح.
    5. قم بتلطيخ الأقسام في محلول الهيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) لمدة 7-8 دقائق. اغسل في الماء الجاري لمدة 30 ثانية من الجانب الخلفي حتى لا تتلف الأقسام. كرر الخطوة 5.3.4.
    6. قم بتلطيخ الأقسام بمحلول eosin (انظر جدول المواد) لمدة 30 ثانية. اغسل كما هو مذكور في الخطوة 5.3.5 ثم كرر الخطوة 5.3.4.
    7. اغمر الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ (الكحول المطلق) لمدة 2 دقيقة. كرر 1x في الإيثانول الجديد 100٪ لمدة 2 دقيقة.
    8. اغمر الشرائح في الزيلين لمدة 5 دقائق. كرر 1x في الزيلين الجديد لمدة 5 دقائق.
    9. اترك الأقسام تجف في الهواء لمدة 15 دقيقة في RT. أضف قطرة من وسط التركيب (انظر جدول المواد) على غطاء ثم ضعها في الجزء العلوي من القسم.
  4. افحص القسم تحت المجهر الضوئي تحت تكبير 20x أو 40x ، والتقط الصور (الشكل 7).

6. اختبار نفاذية الأوعية الدموية

ملاحظة: بالتناوب مع قياس سمك الأذن، يمكن إجراء اختبار نفاذية الأوعية الدموية.

  1. قم بتحسس الفئران في اليوم "0" (الخطوات 3.1.1-3.1.3) ، ثم في اليوم "4" ، قم بتخدير الفئران (الخطوة 3.2.2) وتطبيق hapten مباشرة على الأذنين (الخطوة 3.2.4) ، مع حذف قياس الأذن لمدة 0 ساعة.
  2. في الساعة 23 بعد التحدي ، قم بتخدير الفئران (الخطوة 3.2.2).
  3. حقن عن طريق الوريد (i.v.) 8.3 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم من صبغة إيفانز الزرقاء 1٪ (انظر جدول المواد) في دولبيكو الفوسفات الملوحة المخزن مؤقتا (DPBS).
  4. تخدير الفئران مرة أخرى التخدير العميق (الخطوة 3.2.2) -1 ساعة بعد حقن إيفانز الأزرق.
  5. جمع خزعات الأذن (الخطوة 4.1).
    ملاحظة: بعد هذا الإجراء ، يجب قتل الفئران الرحيم (على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم).
  6. استخراج الصبغة من الأنسجة ، ووضع لكمات الأذن في الأنابيب التي تحتوي على 1 مل من الفورماميد ، وحضان في 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي من 5 ٪ CO2 لمدة 18 ساعة.
  7. الطرد المركزي للخزعات في 3000 × غرام لمدة 3 دقائق في RT. جمع supernatants مع ماصة.
  8. قم بقياس OD عند طول موجي λ = 565 نانومتر في لوحات مسطحة القاع ذات 96 بئرا مقابل فورماميد فارغ يحتوي على فورماميد. اللون مستقر لمدة 24 ساعة. اقرأ تركيز عينات الاختبار من المنحنى القياسي (استخدم تركيزات إيفانز الزرقاء التي تتراوح بين 0.2-30 ميكروغرام من فورماميد الصبغة / مل ) (الشكل 8).
    ملاحظة: يجب أن تكون الألواح مصنوعة من مادة البولي بروبيلين ، والتي لديها قدرة ربط أقل حتى لا ترتبط البروتينات أو الحمض النووي.

7. جمع المصل وقياس الأجسام المضادة للغلوبولين المناعي المضاد ل TNP (IgG1)

  1. بعد جمع خزعات الأذن (الخطوة 4.1) ، عندما لا يزال الماوس تحت التخدير العميق ، قم بإزالة مقلة العين باستخدام ملاقط ، ووضع ضغط لطيف على الماوس ، وجمع الدم من الجيوب الأنفية المدارية الرجعية إلى الأنبوب (قارورة مع هلام للحصول على مصل ، انظر جدول المواد). قد تكون الطريقة البديلة لجمع الدم هي ثقب القلب بحقنة وجمع الدم.
    ملاحظة: يجب جمع الدم بعد إزالة الأذنين. يجب استخدام نفس طريقة النزيف عبر دراسة كاملة بسبب الاختلافات المحتملة في معلمات الدم18. بعد هذا الإجراء ، يجب قتل الفئران الرحيم (على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم).
  2. عكس ما لا يقل عن 6x ، وانتظر 30 دقيقة حتى يتجلط الدم ، ثم قم بجهاز طرد مركزي عند 1,300-2,000 x g لمدة 10 دقائق في RT.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. العينة مستقرة عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
  3. قم بتغطية صفيحة مسطحة القاع من 96 بئرا مع 50 ميكرولتر من ألبومين مصل البقر المقترن ب 2,4,6-trinitrophenyl (TNP-BSA) المذاب في DPBS عند تنسيق 10 ميكروغرام / مل. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوحة الثانية بألبومين مصل البقر (BSA) وحده المذاب في DPBS (الخلفية) بتركيز 10 ميكروغرام / مل. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يحتوي مصل الماوس على أجسام مضادة (ABS) ضد BSA ، لذلك يجب اختبار العينات على كلا اللوحتين ، وبعد ذلك ، يجب إجراء عملية حسابية (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. اغسل الألواح ب 300 ميكرولتر من DPBS تحتوي على 0.05٪ Tween 20. كرر 3x.
  5. تحضير مخفف المقايسة (AD): DPBS يحتوي على 1٪ BSA. سد الآبار مع AD لمدة 1 ساعة في RT. غسل مرة أخرى (الخطوة 7.4).
  6. إعداد معيار داخلي (iSTD): توعية الفئران باستخدام TNCB (الخطوات 3.1.1-3.1.3) ، وبعد 10 أيام من التوعية ، جمع واستطلاع المصل من جميع المانحين (الخطوة 7.1 والخطوة 7.2).
  7. أضف إلى اللوحة 50 ميكرولتر من التركيزات المتدرجة من iSTD المخفف باستخدام AD لصنع المنحنى القياسي (الموضح في الجدول 3). أضف إلى اللوحة 50 ميكرولتر من عينات المصل. اختبر كل عينة ومنحنى قياسي على كلا اللوحتين (TNP-BSA و BSA مغلفة). احتضان لمدة 2 ساعة في RT. اغسل الألواح (الخطوة 7.4).
  8. أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد للماوس الحيوي IgG1 أحادي النسيلة (mAb ، انظر جدول المواد) المخفف 1:250 مع AD واحتضنه لمدة ساعة واحدة في RT. اغسل مرة أخرى (الخطوة 7.4).
  9. أضف 50 ميكرولتر من الفجل بيروكسيديز ستربتافيدين (HRD streptavidin ، انظر جدول المواد) المخفف 1:2000 مع AD ، واحتضن لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. اغسل اللوحة (الخطوة 7.4).
  10. أضف 50 ميكرولتر من ركيزة TMB (انظر جدول المواد) واحتضنها لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
  11. أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 25 ميكرولتر من 1 M H2SO4 ؛ التفاعل مستقر لمدة 30 دقيقة.
  12. قم بقياس OD بطول موجي λ = 450 نانومتر وخلفية 570 نانومتر (يجب طرح الخلفية من كل قياس 450 نانومتر). عند عرض النتائج، اطرح قياسات BSA من TNP-BSA للعينات والمنحنى القياسي. ثم احسب الوحدة (U) للأجسام المضادة وفقا للمنحنى القياسي (الشكل 9).

8. النقل بالتبني للخلايا المستجيبة ل CHS

ملاحظة: يبين الشكل 2 هذا الإجراء.

  1. الجهات المانحة (بنسبة متبرع واحد: متلق واحد): توعية الفئران ب TNCB في اليوم "0" (الخطوات 3-1-1-3-3).
  2. في اليوم "4" ، قم بتخدير التخدير العميق للفئران (الخطوة 3.2.2).
  3. عزل الغدد الليمفاوية الإبطية والإربية (ALNs) والطحال (SPLs) باستخدام الملقط. قم بتجميع ALNs معا في قارورة واحدة و SPLs في قارورة أخرى.
    ملاحظة: هناك عقدة ليمفاوية إبطية واحدة خلف العضلة الصدرية في كل إبطين. تقع إحدى العقدة الليمفاوية الإربية في منطقة الورك بجوار ثلاثة أوعية دموية. يقع الطحال على الجانب الأيسر من الجسم خلف الأمعاء والمعدة19. العمل باستخدام أدوات معقمة في خزانة السلامة الأحيائية للحفاظ على ظروف معقمة. بعد هذا الإجراء ، يجب قتل الفئران الرحيم (على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم).
  4. اهرسي الأنسجة بين الأطراف المتجمدة لشريحتين مجهريتين. مرر تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية بحجم مسام 70 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
  5. اغسل الخلايا باستخدام DPBS المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 1٪ (FBS). جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتزيين السوبرناتانت وإعادة تعليق حبيبات الخلايا المتبقية في 1-5.0 مل من DPBS.
  6. عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم20 مع أزرق تريبان ، وامزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 90-990 ميكرولتر (اعتمادا على رقم الخلية) من أزرق تريبان. ضع في اعتبارك التخفيف عند حساب رقم الخلية (10x-100x).
  7. تحضير خليط من ALNs و SPLs (نسبة 1: 1): 8.0 × 106 حتى 7.0 × 107 / الماوس في 200 ميكرولتر من DPBS.
  8. المتلقين (الفئران المتجانسة الساذجة): تخدير الفئران المتلقية الساذجة (الخطوة 3.2.2) وحقن i.v. بمزيج محضر من الخلايا المستجيبة ل CHS (الخطوة 8.7). في المجموعة الضابطة من الفئران ، لا تحقن أي خلايا.
  9. قياس سمك الأذن قبل (0 ساعة) وبعد (24 ساعة) التحدي (الخطوات 3.2.1-3.2.6) (الشكل 10).
  10. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء اختبارات على الخلايا المستجيبة المعزولة ل CHS (على سبيل المثال ، النمط الظاهري للخلية أو قياس السيتوكينات المنتجة بواسطة الخلايا المستجيبة ل CHS عن طريق قياس التدفق الخلوي). يمكن أيضا إنشاء مزارع الخلايا ، ويمكن تقييم قدرة الخلايا المستجيبة ل CHS على التكاثر في وجود المستضد أو كمية السيتوكينات المفرزة في supernatants المستزرعة21,22 (البيانات غير المقدمة).
    ملاحظة: يتطلب إجراء اختبارات إضافية المزيد من المتبرعين بالخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بالنسبة لتحريض CHS ، تم تحسس الحيوانات عن طريق طلاء الجلد (البطن) مع 150 ميكرولتر من 5٪ TNCB أو تحسس زائف مع السيارة وحدها. في اليوم "4" ، تم تحفيز استجابات تورم الأذن لكلتا الأذنين عن طريق الطلاء بالاتصال (التحدي) مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ TNCB في كل من الفئران التي كانت على اتصال سابق مع TNCB (مجموعة اختبار) وفئران المجموعة الضابطة (الوهمية الحساسة). وتبين البيانات المقدمة أن الفئران التي تحسست ب TNCB وتحدت بعد 4 أيام أصيبت بزيادة كبيرة في تورم الأذن مقارنة بالفئران التي تم تحسسها بالخداع (ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتم تحفيز CHS عن طريق haptens ، والتي ترتبط بمستضدات البروتين الذاتي في الجلد ، مما يخلق مستضدات جديدة. يتم التوسط في CHS من خلال التوظيف المحلي خارج الأوعية الدموية للخلايا التائية المستجيبة ل CHS المستجيبة للمستضد ، مما يؤدي إلى تورم في الأنسجة المتحدية ، ويبلغ ذروته بعد 24 ساعة من تعرض الجلد الثانوي لنفس الهابتن6. يحدث تورم الأنسجة بشكل رئيسي بسبب تسلل الكريات البيض وترسب الفيبرين المعتمد على الكريات البيض24. يمكن الكشف عن هذه التغييرات باستخدام ميكرومتر يقيس تو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من خلال الإعانة SUBZ. A020.22.060 من الجامعة الطبية في فروتسواف ، بولندا ، ومن خلال منح من وزارة العلوم والتعليم العالي N N401 545940 إلى MS و IP2012 0443 72 إلى MMS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
70٪ إيثانولMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا65350-Mلتطهير السطح
96 بئر ألواح مسطحة القاع ، بولي بروبيلينGreiner Bio-One GmbH ، كريمسمونستر ، النمسا655101لقياس MPO و Evans الأزرق - يجب أن تكون الألواح مصنوعة من مادة البولي بروبيلين ، التي لديها قدرة ربط أقل حتى لا تربط البروتينات أو الحمض النووي
الأسيتون (كاشف ACS ، & ge ؛ 99.5٪)Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا179124
رقائق الألومنيومMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياZ185140
الميزان التحليليSartorius Weighing Technology GmbH ، Goettingen ، ألمانياPRACTUM224-1s ، معالج الأنسجة الآلي 29105177
MediMeas Instruments ، Sarsehri ، هاريانا ، الهندMTP-E-212تحضير عينات الأنسجة تلقائيا عن طريق تثبيتها وتجفيفها وإزالتها والتسلل إليها باستخدام البارافين
BD Vacutainer SST II Advance (أنبوب مع هلام للحصول على المصل)Becton Dickinson (BD) ، Franklin Lakes ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكيةBD
مجموعة حمض البيسينشونينيك لتقدير البروتينMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياBCA1-1KT
البيوتين الفئران المضادة للفأر IgG1بيكتون ديكنسون (BD Biosciences) ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية553441
BSA (ألبومين مصل الأبقار) MerckKGaA ، دارمشتات ، ألمانياA9418مقايسات وتحليل البروتين ، مصفاة خلوية 2 مجم / مل
، حجم المسام 70 مو ؛ مBIOLOGIX ، الصين15-1070مناسبة لأنابيب 50 مل
CoverslipVWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة631-158324 مم ، ولكن من الممكن استخدام أحجام مختلفة
سعة الماصات التي تستخدم لمرة واحدة: 5 مل ، 10 مل ، 25 ملMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياZ740301 ، Z740302 ، Z740303
DPBS (Dulbecco & prime; s فوسفات مخزن محلول ملحي)ThermoFisher العلمي ،   ؛ والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية14190144لا يوجد كالسيوم ، لا مغنيسيوم ، ثقافة خلايا الثدييات
DPX Mountant لعلم الأنسجةMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا6522وسائط التركيب ل H-E ، يمكن استخدامها بعض وسائل الإعلام الأخرى على سبيل المثال ، كندا بلسم
دومون 5 ملاقط - مستقيمAnimalab ، بوزنان ، بولندا11251-10FSTالأدوات الجراحية للإجراءات على الفئران (يجب تعقيمها)
ملاقط Dumont 7 - عازمةAnimalab ، بوزنان ، بولندا11272-50FSTالأدوات الجراحية للإجراءات على الفئران (يجب تعقيمها)
محلول Eosin Y ، الكحوليMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياHT110116
أنابيب Eppendorf Safe-Lock 1.5 ملEppenforf ، ألمانيا3،01،20،086أنابيب القفل الآمن من مادة البولي بروبيلين
Eppendorf ، 2.0 ملEppenforf ، ألمانيا3،01،20،094مادة البولي بروبيلين ، قاع دائري (يمكن أن تتحرك حبات التجانس بسهولة)
الإيثانول 100٪ (الكوهول المطلق)Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا1.07017
الإيثانول 96٪Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا1.59010
إيفانز الأزرقMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياE2129
FBS (مصل الأبقار الجنينية)ThermoFisher Scientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةA3160802
محلول الفورمالين ، محايد التخزين المؤقت ، 10٪Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياHT501128
فورماميد 99.5٪ (GC) MerckKGaA ، دارمشتات ، ألمانياF7503
فريزر -20 درجة ؛ CBosch ، ألمانياثلاجة GSN54AW30
+4 درجة ؛ C / الفريزر -20 درجة ؛ CBosch ، ألمانياKGV36V10زراعة خلايا الثدييات ، مؤهلة ، البرازيل ،
microskope زجاجية 10 × 50 مل ، SuperFrost PlusVWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة631-0108 ، 631-0446 ، 631-0447 ، 631-0448 ، 631-0449تلغي الحاجة إلى تطبيق مواد لاصقة أو طلاءات بروتينية ، لمنع أي فقدان لأقسام الأنسجة أثناء التلوين.
الرسم البياني لوحة المنشورGraphPad البرمجيات Inc.v. 9.4.0
صابون رماديحبوب اللقاح Ostrzesz & oacute; ث, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., بولنداBialy jelen شريطالصابون رمادي لوح الصابون الطبيعي هيبوالرجينيك. المنتج المتاح بشكل عام
H2< / sub>SO4< / sub> (حمض الكبريتيك) 1 مول / لتر (1 م) MerckKGaA ، دارمشتات ، ألمانيا1.60313
محلول هاريس الهيماتوكسيلينMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياHHS16
مقياس الدمVWR ، أفانتور ، الولايات المتحدة612-5719يوصى بغرفة العد اليدوي ، وهو أكثر دقة
Hexadecyltrimethylammonium bromideMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياH5882
الخالطQIAGEN Hilden ، ألمانياTissue Lyser LT ، SN 23.1001 / 05234الخالط مع حبات الفولاذ المقاوم للصدأ (قطر 5 مم) لأنابيب الطرد المركزي سعة 2 مل
الفجل بيروكسيداز ستربتافيدين (HRP ستربتافيدين)Vector Laboratories، Inc. ، Burlingame ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكيةSA-5004-1
محلول بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>02< / sub>) MerckKGaA ، دارمشتات ، ألمانياH1009
حاضنة Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh ، ألمانيا4107106837 o< / sup>C في الغلاف الجوي بنسبة 5٪ CO2< / sub> ، و 65 0< / sup>C لإزالة البارافينات أقسام الأنسجة
الكيتامين 100 مجم / مل ، حل للحقنBiowet Pulawy Sp. z o.o. ، Pulawy ، بولنداcat. # غير متوافرة
KH2< / sub>PO4< / sub> (فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم) 99.995٪ أساس لا مائيMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا1.05108
جهاز طرد مركزي مختبرHeraeus Megafuge 1.0R ، Thermo Scientific ، ألمانياB00013899سرعة تصل إلى 300 × جم ، مع تبريد إلى 4 0< / sup>C
جهاز الطرد المركزي المختبريHeraeus Fresco 21 ، Thermo Scientific ، ألمانيا75002425السرعة إلى 3,000 × جم ، مع التبريد إلى 4 0< / sup>C
قناع (FFP2)VWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة111-0917ثنائية هيدروكلوريد أورثوث
ديانيسين في كرسي العلوم الطبية الحيوية ، كلية العلوم الصحية ، كلية الطب بجامعة جاجيلونيان ، كراكوف ، بولنداCBA / J ، C57BL / 6
ميكرومترميتوتويو ، طوكيو ، اليابان193-111رقما من الميكرومتر الخارجي ، توقف السقاطة ، نطاق 0-25 مم ، تخرج 0.001 مم ، دقة +/- 0.002 مم ، https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml   ؛
صفيحة دقيقة ، 96 بئر ، ميكرولون ، ارتباط عالي (لاختبار ELISA)Greiner Bio-One GmbH ، Kremsmunster ، النمسا655061مع أسطح ربط maxi-sorp للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار في مجهر المقايسات اللونية
مع أهدافLeica Microsystems CMS GmbH ، ألمانياDM1000 ، 294011-082007تم إجراء علم الأنسجة المقدم في الورقة تحت نظام التصوير ThermoFisher Scientific EVOS M5000 ، مع الأهداف: FL 20X LWDPH ، 0.40NA / 3.1WD و FL 40X LWDPH 0.65NA / 1.79WD
Myeloperoxidase من الكريات البيض البشرية (معيار MPO) MerckKGaA ، دارمشتات ، ألمانياM6908
Na 2< / sub>HPO4< / sub> x 7 H2< / sub>O (سباعي هيدرات فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة)Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياS9390
زيت الزيتونMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا75343نقي ، طبيعي
OptEIA Mouse IFN- & gamma ؛ مجموعة ELISABecton Dickinson (BD Biosciences) ، Franklin Lakes ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية555138
Ortho-dianisine dihydrochlorideMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياD3252
شمع البارافينMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا76242حبة ، PBS الصلبة الشمعية
(محلول ملحي مخزن بالفوسفات)ThermoFisher Scientific ،   ؛ والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية20012027درجة الحموضة 7.2 ، مقياس الأس الهيدروجيني لزراعة خلايا
Elmetron ، بولنداCP-401
Pipettes ، حجم متغير مع نصائحMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياEP3123000900-1EA3-pack ، الخيار 1 ، 0.5-10 uL / 100-100 uL / 100-1000 uL ، بما في ذلك epT.I.P.S.
شفرة الحلاقةVWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدةPERS94-0462مكشطة وشفرات قاطعة ، حافة واحدة ، عمود فقري من الألومنيوم ، 100 شفرة لكل صندوق ، ملفوفة بشكل فردي
مختبر MRC microtome الدوارة- أدوات ، إسيكس ، CM20 2HU UKHIS-202A
مقص - مستقيم ، حاد / حادAnimalab ، بوزنان ، بولندا14060-10FSTأدوات جراحية للإجراءات على الفئران (يجب تعقيمها)
غطاء لولبي (مفتوح)Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا27056غطاء ثقب بولي بروبلين أسود ، للاستخدام مع 22 & nbsp ؛ قارورة مل مع 20-400 خيط
مقياس الطيفBioTek Instruments ، الولايات المتحدة201446مقياس الطيف الضوئي الدقيق: & lambda ؛ المدى: 200 - 999 نانومتر ، نطاق قياس الامتصاص: 0.000 - 4.000 طبق تلطيخ ABS
20 شريحة مع رفMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياS6141على سبيل المثال 20 صحن تلطيخ منزلق كاملة مع أغطية ورف منزلق ومقبض
خزعة معقمة يمكن التخلص منها 6 ممIntegra LifeSciences ، برينستون ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية33-36
مقص جراحيAnimalab ، بوزنان ، بولندا52138-46أدوات جراحية للإجراءات على الفئران (يجب تعقيمها)
أشرطة معالجة الأنسجةMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياZ672122معالجة الأنسجة / تضمين أشرطة مع غطاء
مجموعة كاشف الركيزةTMB Becton Dickinson (BD Biosciences) ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية555214
TNCB (2،4،6-trinitrochlorobenzene)شركة طوكيو للصناعة الكيميائية ، المحدودة ، اليابانC0307
TNP-BSA (ألبومين مصل البقر المقترن ب 2،4،6-trinitrophenyl)Biosearch Technologies LGC ، Petaluma ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكيةT-5050
T-PER (كاشف إخراج بروتين الأنسجة)ThermoFisher Scientific ، Waltham ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية78510
أنابيب 15 مل معقمةMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياCLS430055 (كورنينج)بولي بروبيلين ، قاع مخروطي
الأنابيب 50 مل ، معقمMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياCLS430290 (كورنينج)بولي بروبيلين ، قاع مخروطي
Tween 20Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياP1379
قارورة ، أعلى لولبي ، زجاج شفاف (قارورة فقط) 22 ملMerck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا27173لإعداد hapten ، مشدود حتى لا يتبخر
حمام مائيAJL Electronic ، بولنداLW102
موزع الشمع (البارافين)VWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة114-8737
محلول زيلازين (زيلابان 20 مجم / مل) للحقنفيتوكينول Biowet Sp. z o.o. ، Gorzow Wielkopolski ،بولندا cat. # غير متوافرة
الزيلين (درجة النسيجية)Merck KGaA, دارمشتات, ألمانيا534056
366882 شرائح شرائح الأمريكية للعمل مع وحدة تربية الفئران الثدييات الضوئي الأمريكية

المراجع

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016(2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765(2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

الوسوم

مقالات ذات صلة