يوضح البروتوكول الحالي استخدام مقايسة تضخيم أسي سريعة من 3 مراحل قائمة على aptamer للكشف عن الأهداف. يتم تغطية تحضير العينة وتضخيم الإشارة وتطوير اللون لتنفيذ هذا النظام للتعرف على وجود الثيوفيلين على الكافيين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يتم تسهيل الكشف عن الهدف القائم على Aptamer بواسطة تفاعل تضخيم أسي متساوي الحرارة G-quadruplex من 3 مراحل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الأبتامير هي جزيئات التعرف على الهدف التي ترتبط بتقارب وخصوصية عالية. يمكن الاستفادة من هذه الخصائص للتحكم في الجزيئات الأخرى ذات القدرة على توليد الإشارة. بالنسبة للنظام الموصوف هنا ، فإن التعرف على الهدف من خلال مجال aptameric ، Stem II من ريبوزيم رأس المطرقة المعدل ، ينشط الريبوزيم ذاتي الشق عن طريق تثبيت البنية غير المنظمة في البداية. يعمل الحمض النووي الريبي المشقوق لرابطة الدول المستقلة عند تقاطع الجذع الثالث والجذع الأول ، مما يخلق منتجين للانقسام. يقوم منتج الانقسام الأطول بإعداد تفاعل تضخيم أسي متساوي الحرارة (EXPAR) لاثنين من رباعيات G النشطة تحفيزيا المتشابهة. تحفز منتجات التضخيم الناتجة عن ذلك تقليل البيروكسيديز ، والذي يقترن بتقليل الركيزة اللونية بإخراج يمكن للعين المجردة اكتشافه. يعمل النظام المكون من 3 أجزاء الموصوف في الدراسة الحالية على تحسين طرق الكشف مثل مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) من خلال إنتاج إشارة يمكن اكتشافها بصريا للإشارة إلى وجود ما يصل إلى 0.5 ميكرومتر من الثيوفيلين في أقل من 15 دقيقة.
المقدمة
عادة ما تكون الأبتامير عبارة عن حمض نووي أو حمض نووي ريبوزي أحادي الشريط يتم اختياره من خلال عملية تطورية ذات تقارب ارتباط عالي وخصوصية للأهداف المرجوة1. بالإضافة إلى القدرة على الربط ، يمكن ربط aptamers بالزخارف والتحكم فيها باستخدام وظائف خرج الإشارة 2,3 ، مما يؤدي إلى تضخيم الإشارة المذكورة وتحسين حساسية النظام. نظام تفاعل التضخيم الأسي متساوي الحرارة G-quadruplex (GQ-EXPAR) هو نظام من ثلاثة أجزاء (الشكل 1) يطور إشارة مرئية حيث تتم إضافة مكونات متتالية إلى وعاء تفاعل واحد لإنتاج ناتج مرئي4. يسمح هذا النظام بالكشف عن هدف محدد ، هنا الثيوفيلين ، في عينة معينة في غضون 15 دقيقة باستخدام سير عمل مبسط للسماح بالكشف السريع والمحدد عن هدف الاهتمام. يجب النظر في هذه الطريقة للعينات التي يكون فيها التحديد الكمي المحدد للتركيز المستهدف أقل إثارة للقلق من الخصوصية العالية للاستجابة في فترة زمنية قصيرة.
ينتج الريبوسويتش الخيفي ، وهو جزيء RNA لتبديل البنية (ريبوزيم) يخضع للانقسام الذاتي ، الإشارة الأولية. يعتمد هذا البناء على ريبوزيم رأس المطرقة ، مع إدخال مجال أبتاميري في Stem II كمنظم لنشاط الانقسام. يتم تنشيط وظيفة الانقسام الذاتي عندما يستقر مجاله aptameric عند الارتباط بهدفه5. خلاف ذلك ، يكون المفتاح غير نشط في حالته الأصلية.
يستخدم تفاعل التضخيم الأسي اللاحق (EXPAR) إطلاق شريط الحمض النووي الريبي المشقوق ذاتيا من المرحلة الأولى لتجهيز تفاعل تضخيم متساوي الحرارة6. يحتوي منتج التضخيم الخاص ب EXPAR على نشاط البيروكسيديز7 ، حيث يعمل كأساس للمرحلة الأخيرة من النظام. عندما تتأكسد بعض الركائز بالتزامن مع انهيار البيروكسيد ، فإنها تنتج ناتج فلورسنت يمكن قياسه على أجهزة مختلفة. يمكن استبدال الركائز الشائعة الأخرى لإنتاج منتج ملون للكشف البصري. EXPAR ونشاط البيروكسيديز لمنتجات التضخيم الخاصة به بمثابة محسن إشارة 2-stage ، وزيادة الحساسية لمستويات أعلى مقارنة بالاستراتيجيات التقليدية 7,8.
يستخدم الكشف عن الثيوفيلين مقابل الكافيين كمثال على خصوصية منصة الكشف هذه ، حيث تختلف عن طريق مجموعة ميثيل واحدة فقط (الشكل 2). ينتج هذا العرض التوضيحي للنظام ناتجا لونيا للكشف البصري عن 500 نانومتر ثيوفيلين على الأقل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
انظر الجدول التكميلي 1 (جدول إعداد التفاعل) لتحضير الأنبوب، بما في ذلك الأحجام والتركيزات المحددة لمكونات التفاعل. يستخدم البروتوكول الموضح هنا مجموعة منصات الكشف المجمعة مسبقا كما هو موضح في جدول المواد. يجب حفظ جميع المكونات على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك.
1. إعداد ريبوزيم
ملاحظة: مكون الكشف الأساسي هو ريبوزيم خيفي (منظم بالتامير) يتعرف على الثيوفيلين (انظر الجدول التكميلي 2).
- اجمع 5 U من كيناز البولي نيوكليوتيد T4 (0.5 ميكرولتر ، انظر جدول المواد) في أنبوب PCR ، والذي سيتم استخدامه لتنشيط منتجات انقسام الريبوزيم.
ملاحظة: تتم إضافة هذا المكون أولا حتى يتمكن المستخدم من رؤية التوزيع الصحيح للإنزيم. - أضف 1 ميكرولتر من محلول الريبوزيم 5x المعد مسبقا (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة (أنبوب PCR).
- لأغراض إظهار الخصوصية بصريا ، أضف 1.5 ميكرولتر من 2 مللي مول ثيوفيلين (هدف) أو 2 مللي مول كافيين (تحكم) (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة كعينات اختبار.
ملاحظة: لإنشاء منحنى قياسي ، يوصى بالبدء عند تحليل 3.125 mM واختبار التخفيفات بخمسة أضعاف حتى 0.001 mM. - امزج كل أنبوب عينة جيدا عن طريق سحب 5-10 مرات.
- أضف 2 ميكرولتر من 600 نانومتر من الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على مجال aptameric خاص بالهدف (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة لعمل تركيز نهائي قدره 240 نانومتر في 5 ميكرولتر من محلول الاختبار ، ثم اخلطه بسرعة عن طريق السحب ووضعه على كتلة باردة لتقليل إشارة الخلفية.
ملاحظة: من المهم في البداية تحضير جميع التفاعلات بدون ريبوزيم ، حيث سيبدأ تفاعل الانقسام الذاتي على الفور عندما يتم دمج الريبوزيم مع محلول الريبوزيم وقد ينتج خلفية مهمة. - بمجرد تحضير جميع أنابيب التفاعل ، احتضان كل عينة (5 ميكرولتر) في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق بالضبط باستخدام جهاز توقيت. أعد أنابيب العينة على الفور إلى الثلج (4 درجات مئوية) بعد الحضانة.
2. جي كيو إكسبار
- أضف 3.5 ميكرولتر من خليط إنزيم نيكاز بوليميراز (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة واخلطه جيدا.
ملاحظة: تعتمد تركيزات الإنزيم المطلوبة على تسلسل التعرف وأنواع الإنزيمات ودرجات حرارة التفاعل ، والتي تم تحديد مزيجها تجريبيا. - أضف 31.5 ميكرولتر من خليط تفاعل EXPAR الذي يحتوي على قالب ونيوكليوتيدات ومخزن تفاعل (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة وماصة للخلط.
ملاحظة: يتم تحسين تركيزات المكونات بناء على إنزيمات وتسلسلات منتجات البلمرة. - بمجرد تحضير جميع العينات ، احتضان كل عينة محضرة (40 ميكرولتر) عند 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق بالضبط باستخدام جهاز توقيت. إذا أمكن ، احتضان على thermocycler ، على الرغم من أن غطاء ساخن غير ضروري.
- أعد أنابيب العينة على الفور إلى الثلج (4 درجات مئوية) بعد خطوة الحضانة.
3. تطوير اللون
- أضف 2 ميكرولتر من محلول Hemin (25 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة واخلطه جيدا.
- أضف 58 ميكرولتر من محلول TMB المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة واخلطه جيدا.
- احتضان تفاعل تطور اللون (100 ميكرولتر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق على الأقل وحتى 30 دقيقة.
ملاحظة: (اختياري) يمكن إيقاف تطور اللون بإضافة 20 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 2 متر. - اقرأ العينات نوعيا بالعين ، أو حدد النتائج باستخدام قارئ لوحة الامتصاص عند 450 نانومتر إذا تم إيقاف تفاعلات تطور اللون باستخدام حمض الكبريتيك.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تقوم منصة الكشف الموضحة في الشكل 1 بتحويل التعرف على الهدف aptameric إلى اختلافات متميزة بصريا بين مستحضرات العينة (الهدف مقابل غير الهدف ، الشكل 2) في فترة زمنية قصيرة. كان الريبوزيم الخيفي الذي حدده Soukup et al.5 بمثابة نقطة انطلاق لإنشاء تسلسل أقل ضوضاء مع الاستجابة للهدف على العينات الضابطة والسالبة. كان البناء الأمثل قادرا على التعرف على أقل من 500 نانومتر من الثيوفيلين في 30 دقيقة (الشكل 3) - تنتج مستحضرات العينة المعرضة للهدف لونا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تستفيد الطريقة المعروضة هنا من الانتقال بين بنية ثانوية مضطربة في البداية في ريبوزيم خيفي والاستقرار الإضافي الممنوح من خلال ربط الهدف بالمجال الأبتاميري لتنشيط ريبوزيم رأس المطرقة المشقوق لرابطة الدول المستقلة. تم تعديل استقرار الريبوزيم لتقليل النشاط التحفيزي في غياب الهدف مع السماح لربط الهدف باستعادة البنية النشطة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب توخي الحذر لتحقيق التوازن بين المخازن المؤقتة للإنزيمات المتعددة المطلوبة لتسهيل EXPAR وتطوير اللون. أخيرا ، بالنظر إلى أن هذا نظام من 3 مراحل ، فإن الجمع بين أوقات الحضانة ودرجات ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تقوم Aptagen، LLC بتصنيع وتسويق مجموعة عرض GQ-EXPAR لأولئك الذين يرغبون في تجربة مباشرة مع نظام الكشف القائم على aptamer.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث من خلال تمويل البحث والتطوير من Aptagen LLC.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محلول 3،3 '، 5،5 '-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) مع H2< / sub>O2< / sub> ، "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | كاشف تطوير اللون PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | . قلل من التعرض للضوء والغلاف الجوي. سابقا ، تم توفير كتالوج BIOO Scientific رقم 1806. في مجموعة Apta-beacon Demonstration Kit مثل الأنبوب 3-2. |
| 5 '- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-BIOTIN-3 ' | تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) قالب | الحمض النووي QtQ47 المحسن المخصص ل EXPAR لإنتاج G-quadruplex ، مهيأ بواسطة G-quadruplex. يستخدم هذا للجزء "الأسي" من EXPAR ، لزيادة كمية DNAzyme المستخدمة في تطوير ألوان الخطوة 3 بسرعة. يتضمن القالب 3'-biotin لمنع الامتداد غير المقصود بواسطة Bst 2.0 DNA polymerase أثناء EXPAR. جزء من Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. | |
| 5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GU UAG UU-3 ' | تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) تسلسل | الريبوزيم الخيفي المخصص للتعرف على الثيوفيلين (الريبوزيم ذاتي الشق الذي ينظمه مجال أبتامر الحمض النووي الريبي للثيوفيلين) تم تعديله من Soukup et al. Soukup، G.A.، Emilsson، G.A.، and Breaker، R. R. (2000) تغيير التعرف الجزيئي على أبتامير الحمض النووي الريبي عن طريق الانتقاء الخيفي، مجلة البيولوجيا الجزيئية 298، 623-632. تم توفيرها في مجموعة عرض Apta-beacon كأنبوب 1-3. | |
| 5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3 ' | تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) قالب | الحمض النووي P3tQ49 المحسن المخصص ل EXPAR لإنتاج G-quadruplex ، مهيأ بمنتج الانقسام P3. يستخدم هذا في الخطوة 2 لترجمة منتج الانقسام إلى DNAzyme المستخدم لتطوير ألوان الخطوة 3. يتضمن القالب 3'-biotin لمنع الامتداد غير المقصود بواسطة Bst 2.0 DNA polymerase أثناء EXPAR. جزء من Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. | |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen ، LLC | N / A | 5x التركيب: 600 ملي ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 150 ملي MgCl 2< / sub > ، 25 ملي مولار DTT. تستخدم في الخطوة 1. الموردة في مجموعة العرض التوضيحي Apta-beacon كأنبوب 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) مجموعة العرض التوضيحي | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | تعرض المجموعة التجريبية خصوصية الاختبار اللوني من خلال الكشف عن أهداف الجزيئات الصغيرة الصعبة, الثيوفيلين مقابل الكافيين, والتي تختلف فقط بمجموعة ميثيل واحدة. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | بوليميراز تضخيم متساوي الحرارة مع نشاط إزاحة الخيوط جزء من مزيج Nickase-Polymerase ، المحضر في 9.375 U / uL. جزء من أنبوب Apta-beacon Demonstration Kit 2-1. |
| Buffer 3.1 | England Biolabs | B6003SVIAL | جنبا إلى جنب مع 2 ميكرولتر من 10X مخزن تضخيم متساوي الحرارة و 27.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز لإنتاج 1.11X EXPAR Buffer في EXPAR Mix. يحل هذا المنتج محل B7203SVIAL المستخدم سابقا والذي كان جزءا من التطوير الأولي للنظام (نفس التكوين باستثناء BSA غير المؤتلف). جزء من أنبوب Apta-beacon Demonstration Kit 2-2. |
| الكافيين | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer الهدف المضاد (التحكم) ، محضر بماء خال من النوكلياز. يتم توفيره في مجموعة مظاهرة Apta-beacon كأنبوب 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | جزء من خليط تفاعل EXPAR. جزء من أنبوب مجموعة العرض التوضيحي Apta-beacon 2-2. |
| خليط تفاعل EXPAR | Aptagen، LLC | N / A | 0.44 mM dNTPs ، 0.38 & م P3tQ49 ، 0.38 & M QtQ47 ، 44.44 ملي Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.4) ، 63.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 31.5 ملي كلوريد كلوريد ، 6.35 ملي ملي كلوريد المغنيم2 ، 1.27 ملي مجم سولات 4 ، 6.35 ملي مولار (NH4) 2SO4 ، 63.5 مو ؛ جم / مل BSA ، 0.0635٪ توين 20. جزء من أنبوب Apta-beacon Demonstration Kit 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | معلق في DMF إلى تركيز نهائي قدره 25 uM. يتم توفيره في مجموعة عرض Apta-beacon كأنبوب 3-1. |
| المخزن المؤقت للتضخيم متساوي الحرارة | B0537SVIAL نيو إنجلاند بيولوجي | جنبا إلى جنب مع 2 ميكرولتر من 10x Buffer 3.1 و 27.5 & micro ؛ لتر من الماء الخالي من النوكلياز لإنتاج 1.11x EXPAR Buffer في EXPAR Mix. جزء من أنبوب مجموعة Apta-beacon Demonstration Kit 2-2. | |
| MgCl2< / sub> | Amresco (VWR) | E525-500ML | عامل ريبوزيم رأس المطرقة ، ضروري للانقسام الذاتي. جزء من أنبوب مجموعة العرض التوضيحي Apta-beacon 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research، Inc. | PTC-100 | Thermocycler للتحكم في درجات حرارة الحضانة. يمكن استخدام أي جهاز تدوير حراري أو كتلة ساخنة. |
| N ، N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | يستخدم لتعليق الهيمين وزيادة العمر الافتراضي في الفريزر. جزء من أنبوب مجموعة العرض التوضيحي Apta-beacon 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen، LLC | N / A | Nt.BstNBI (9.375 وحدة/μ L) و Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 وحدة/μ L). يتم توفيره في مجموعة العرض التوضيحي Apta-beacon كأنبوب 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | إنزيم Nicking للسماح بتضخيم متساوي الحرارة المستمر. جزء من مزيج Nickase-Polymerase ، المحضر في 0.5 U / uL. جزء من أنبوب Apta-beacon Demonstration Kit 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer للإنزيم الضروري لإزالة الفوسفات الدوري. جزء من أنبوب Apta-beacon Demonstration Kit 1-4. |
| T4 عديد النوكليوتيدات كيناز | نيو إنجلاند Biolabs | M0201S | يزيل الفوسفات الدوري بعد الانقسام للسماح لمنتج الانقسام بتفاعل تضخيم متساوي الحرارة. يتم توفيره في مجموعة عرض Apta-beacon كأنابيب PCR. |
| لوحة Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | لقياس إشارة الامتصاص من نتائج الخطوة 3. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer ، محضر بماء خال من النوكلياز. يتم توفيره في مجموعة عرض Apta-beacon كأنبوب 1-2. |
| Tris-HCl | الأمريكية للتحليل الحيوي | AB14043-01000 | Aptamer ملزمة عازلة. جزء من أنبوب مجموعة العرض التوضيحي Apta-beacon 1-4. |
المراجع
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
