مقالة منهجية

نهج التصوير الفلوري داخل الحيوية لدراسة ديناميكيات إشارات الكالسيوم الناجمة عن الحمل في خلايا العظام في الفئران

DOI:

10.3791/64366

⸱

فبراير 24, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Sibley School of Mechanical and Aerospace Engineering, Cornell University, 3Department of Biomedical Engineering, The City College of New York, 4Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Orthopaedic Surgery, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف المقالة الحالية إجراء نهج تصوير داخل الحيوية لمراقبة إشارات الكالسيوم المستحثة ميكانيكيا لخلايا العظم المدمجة في الجسم الحي في الوقت الفعلي استجابة للتحميل الميكانيكي على مستوى الأنسجة لمشط القدم الثالث للفأر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنسجة العظام حساسة بشكل رائع للاختلافات في حجم الحمل الميكانيكي. الخلايا العظمية ، الخلايا المتغصنة التي تشكل مخلوية في جميع أنحاء العظام ، هي المسؤولة عن الوظيفة الحسية الميكانيكية لأنسجة العظام. أدت الدراسات التي تستخدم علم الأنسجة والنمذجة الرياضية وزراعة الخلايا ومزارع أعضاء العظام خارج الجسم الحي إلى تطوير فهم البيولوجيا الميكانيكية للخلايا العظمية بشكل كبير. ومع ذلك ، فإن السؤال الأساسي حول كيفية استجابة الخلايا العظمية للمعلومات الميكانيكية وترميزها على المستوى الجزيئي في الجسم الحي غير مفهوم جيدا. توفر تقلبات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العظمية هدفا مفيدا لمعرفة المزيد عن آليات النقل الميكانيكي الحاد للعظام. هنا ، نبلغ عن طريقة لدراسة علم الأحياء الميكانيكي للخلايا العظمية في الجسم الحي ، والجمع بين سلالة الفأر ومؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا الفلورية المعبر عنها في الخلايا العظمية مع نظام تحميل وتصوير في الجسم الحي للكشف مباشرة عن مستويات الكالسيوم في الخلايا العظمية أثناء التحميل. يتم تحقيق ذلك من خلال جهاز ثني ثلاثي النقاط يمكنه توصيل أحمال ميكانيكية محددة جيدا إلى مشط القدم الثالث للفئران الحية مع مراقبة استجابات الكالسيوم المشار إليها بالفلورسنت للخلايا العظمية باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون. تسمح هذه التقنية بالمراقبة المباشرة في الجسم الحي لأحداث إشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية استجابة لتحميل العظام بالكامل وهي مفيدة في السعي للكشف عن آليات في علم الأحياء الميكانيكي للخلايا العظمية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنظيم مصفوفة العظام وفقا للطلب الميكانيكي1،2 ويمكن أن تتغير ديناميكيا لمراعاة المتطلبات الميكانيكيةالمتغيرة 3،4،5. تم نشر العمل الأساسي فيما يتعلق بالآلية الحسية الميكانيكية في العظام كورقة نمذجة منذ حوالي 30 عاما6،7،8 ، حيث تم اقتراح أن الخلايا العظمية المضمنة في العظام تستشعر بالتشوه الميكانيكي على مستوى أنسجة العظام عن طريق حركة السوائل في بيئتها المحلية. تم التحقق من صحة هذا النموذج تجريبيا من خلال التجارب في المختبر وخارج الجسم الحي ، حيث تبين بوضوح أن الخلايا العظمية حساسة تماما للميكانيكا1،2،3،4،5،6 وتعبر أيضا عن السيتوكينات ، التي توجه سلوك بانيات العظم لبناءالعظام 7 وناقضات العظم8،9،10 ، 11،12.

إشارات الكالسيوم هي رسول ثان في كل مكان تم إنشاؤه كشخصية مركزية وهدف تجريبي يمكن الاعتماد عليه في علم الأحياء الميكانيكي للخلاياالعظمية 13،14،15،16. تتميز إشارات الكالسيوم بأنها تتم دراستها على نطاق واسع في بيولوجيا الخلية17 ، مما يعني أن هناك الكثير من المعلومات المعروفة عن آثارها النهائية وأدوات الفلورسنت المقابلة المتاحة للمراقبة التجريبية. استخدمت التحليلات المختبرية إشارات الكالسيوم كوسيلة لتحديد التنشيط الميكانيكي للخلايا العظمية وتوصيف سلوك الإشارات الديناميكية5،18،19. وتجدر الإشارة إلى أن ملاحظة إشارات الكالسيوم في خط خلايا العظم قدمت دليلا قاطعا على أن تنشيط السوائل في مرفقات الإنتجرين على طول عملية الخلية هو على الأرجح الشكل الرئيسي لتنشيط تدفقالسوائل 20. هذه الدراسة هي واحدة من العديد من الدراسات التي تعرض فائدة إشارات الكالسيوم. يتم تحفيزه بشكل موثوق من خلال التنشيط الميكانيكي للخلايا العظمية ، وبالتالي فهو بمثابة هدف قوي لاستجواب البيولوجيا الميكانيكية للخلايا العظمية.

يعتمد النقل الميكانيكي للخلايا العظمية في الجسم الحي بشكل كبير على بيئتها الدقيقة المباشرة. توفر البروتينات المرتبطة بالمصفوفة (على سبيل المثال ، البروتيوغليكان ، الإنتجرين) مرفقات وظيفية بين أغشية خلايا الخلايا العظمية في ترتيب بالغ الأهمية لتنشيط السوائل للخلية21،22. في حين أن التحليلات ثنائية الأبعاد (2D) في المختبر مفيدة ، إلا أنها محدودة من حيث أنها لا تتضمن هذه الميزات ثلاثية الأبعاد (3D) الحرجة. ألقت الاستعدادات خارج الجسم الحي لإشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بعض الضوء على كيفية استجابة الخلايا العظمية مع الحفاظ على المصفوفة المحيطة سليمة13،16. ومع ذلك ، يعتقد أن إزالة إمدادات الدم من العظام تغير العناصر الغذائية وديناميكيات السوائل في الجهاز الغني الجسي. يتطلب استجواب البيولوجيا الميكانيكية للخلايا العظمية تحقيقا في الجسم الحي لإشارات الخلايا العظمية الناجمة عن الحمل.

تم إعاقة التحقيق في الجسم الحي للخلايا المدمجة في العظام إلى حد كبير بسبب قيود تقنيات التصوير التقليدية ، مثل المجال الساطع والفحص المجهري متحد البؤر. يتم وضع الخلايا العظمية في مصفوفة معدنية23 تتكون من هيدروكسيباتيت ، ونوع الكولاجين 1 ، وبروتينات أخرى غير كولاجينية تحد من إمكانية الوصول البصري24 وتجعل التحقيق في الجسم الحي صعبا من الناحية الفنية. ومع ذلك ، فإن التطورات الحديثة في التصوير الفلوري غير الخطي ومراسلي الكالسيوم المشفرين وراثيا توفر الفرصة للتغلب على هذه التحديات.

هنا ، نبلغ عن نهج جديد مع القدرة على تصوير الخلايا العظمية في الجسم الحي لقياس إشارات الكالسيوم بدقة المستوى الخلوي25. يتم تحقيق ذلك باستخدام علامة فلورية ديناميكية باستخدام مؤشر كالسيوم مشفر وراثيا لأول مرة في خلايا عظم الفئران. تظهر الفئران المصابة بتعبير GCaMP6f الذي يستهدف الخلايا العظمية DMP1-Cre مضان مرئي في الخلايا العظمية في جميع أنحاء قشرة الحجاب الحاجز للفئرانمشط القدم 17،26. نستخدم نظام ثني ثلاثي النقاط من أجل تطبيق مستويات فسيولوجية لحجم الإجهاد بين 250-2,000 με27. تسمح هذه التقنية بالتصور في الجسم الحي لديناميكيات إشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية أثناء التحميل الميكانيكي للعظم بأكمله ويمكن أن تكون مفيدة لأي شخص يسعى إلى فهم البيولوجيا الميكانيكية للخلايا العظمية. ستكون هذه الطريقة مناسبة للباحثين الذين يسعون إلى توسيع عملهم من التحليلات المختبرية إلى التطبيقات في الجسم الحي ، خاصة مع الاحتفاظ بالتحليلات الجزيئية الوظيفية (أي التحقيق في النشاط الخلوي عبر إشارات الكالسيوم) بدلا من دراسات التنميط الظاهري واسعة النطاق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الأساليب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة كورنيل.

1. تحضير المواد والمعدات

  1. تصميم وبناء جهاز تحميل مشط القدم لاستخدامه مع مجهر متعدد الفوتون العلوي.
    ملاحظة: تفاصيل مواصفات المكون وتشغيل الجهاز موصوفة في الوثائق التكميلية لدراسةسابقة 25. باختصار ، تتكون المكونات الرئيسية من مشغل في سلسلة مع خلية تحميل وقوس تحميل وحمام مائي ودبوس نقطة ارتكاز. يمكن الحصول على المشغل وخلية الحمل تجاريا ويجب أن يكونا قادرين على استيعاب أحمال تصل إلى 300 جم. يجب أن يكون الحمام المائي ودبوس نقطة الارتكاز وقوس التحميل مبنيا من التيتانيوم أو الفولاذ المقاوم للصدأ. يمكن تصنيعها داخليا أو تجاريا عبر الطباعة المعدنية ثلاثية الأبعاد.
  2. معايرة قيم حجم الإجهاد لإزاحة المشغل مسبقا لمجموعات الفئران الفردية (أي الجنس والعلاج والنمط الجيني). يتم ذلك باستخدام رسم خرائط الإجهاد السطحي في إجراء موضح في دراسةسابقة 25.
  3. استخدم الفئران ذات الخلفية C57BL / 6 ، التي تتراوح أعمارها بين 16 و 18 أسبوعا ، والتي تعبر عن تركيبات مؤشر الكالسيوم الفلوري في الخلايا العظمية. يتم تحقيق التعبير المستهدف للخلايا العظمية عن طريق عبور الفئران GCaMP6f و Dmp1-Cre التي يتم تنشيطها بواسطة flox. تم وصف تفاصيل استراتيجيات التربية والبائعين للفئران المؤسسية في دراسة نشرتسابقا 25.
  4. تعقيم جميع الأدوات الجراحية ، قوس التحميل ، الحمام المائي ودبوس نقطة الارتكاز باستخدام الأوتوكلاف (57.2 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، 3-4 دقائق). تطهير أهداف المجهر بالإيثانول بنسبة 100٪.
  5. قم بتشغيل المكونات الإلكترونية ، بما في ذلك مصدر الليزر والمجهر وخلية الحمل والمشغل. اترك 15-20 دقيقة لكل مكون للتسخين قبل التصوير داخل الحيوية.
    1. تأكد من توصيل المشغل ومكونات خلية الحمل وتنشيطها في جهاز التحكم. قم بإنشاء برنامج التحكم باستخدام مجموعة متنوعة من الأنظمة الأساسية ، بما في ذلك Matlab و LabView و Python ، وفقا لتفضيلات المستخدم. يسمى رمز Matlab الرئيسي المستخدم في هذه الدراسة Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (داخل مجلد MT3 Loading Device Control Software.zip الملف التكميلي 1).
      ملاحظة: تأتي معظم أنظمة المجهر ثنائية الفوتون المتوفرة تجاريا مع برنامج تصوير قوي. الميزات الرئيسية المطلوبة لهذه الطريقة هي القدرة على ضبط الليزر على الإثارة المناسبة ل GCaMP6f (920 نانومتر) ، والقدرة على ضبط شدة طاقة الليزر ، ومجموعة السلاسل الزمنية بتردد لا يقل عن 6 هرتز. قبل التجريب ، يجب تأكيد اتصال الليزر ببرنامج التصوير وترتيب مسار الضوء المناسب للتصوير ثنائي الفوتون. يتم تأكيد ذلك بطرق مختلفة اعتمادا على إعداد التصوير. عادة ، هناك مؤشر ضوئي.

2. الجراحة

  1. تحضير مرحلة جراحية وتعقيم السطح بنسبة 70٪ من الإيثانول. تأكد من استخدام تقنيات التعقيم طوال العمليات الجراحية. الحفاظ على مستوى النظافة المطلوب لهذا البروتوكول ، لأنه إجراء نهائي.
  2. قم بتخدير الفأر باستخدام الأيزوفلوران المتبخر الممزوج بهواء أو أكسجين طبي بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة. إجراء التخدير الأولي في غرفة تحريض القوارض مع 3٪ -5٪ إيزوفلوران. الحفاظ على التخدير عند 1٪ -2.5٪ من الأيزوفلوران في مخروط الأنف لإجراءات التصوير الجراحية وداخل الحيوية.
  3. ضع جهاز تسخين أسفل الماوس أو بجانبه للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية التماثلية. راقب درجة حرارة جسم الفأر ومعدل ضربات القلب وتشبع الأكسجين طوال الجراحة. حافظ على معدل التنفس بين 60-80 نفسا في الدقيقة وحافظ عليه عن طريق ضبط جرعة الأيزوفلوران.
  4. ضع الماوس في وضع ضعيف. تأكد من عمق التخدير قبل الشق عن طريق قرصة إصبع القدم. تحديد الموقع بين مشط القدم الثاني والثالث. قم بعمل شق مشرط عبر الأدمة بين مشط القدم الثاني والثالث ، بدءا من الطرف البعيد ويتقدم بشكل قريب على طول العظام (~ 5 مم).
    ملاحظة: مشط القدم بعيد عن عظام الكاحل على المخلب وتتبع مباشرة بالقرب من الكتائب البعيدة. وهي تتكون من مشط القدم (الإنسي إلى الجانبي) الأول والثاني والثالث والرابع والخامس. يتركز مشط القدم الثالث في منتصف الجانب الأخمصي للمخلب الخلفي.
  5. باستخدام الملقط ، افتح موقع الجراحة عن طريق سحب الجلد باتجاه الحواف الإنسية / الجانبية. استئصال الأوتار الباسطة باستخدام مقص Vannas المستقيم لكشف مشط القدم الثالث.
  6. أدخل دبوس نقطة الارتكاز المركزي لجهاز تحميل مشط القدم أسفل مشط القدم الثالث.
    1. في البداية ، أدخل الدبوس في المساحة الصغيرة في الطرف البعيد حيث يلتقي مشط القدم الثالث بالكتائب القريبة ثم حرك الدبوس بالقرب منه حتى يستقر في منتصف العمود الثالث.
    2. احرص بشكل خاص على ضمان وجود واجهة مباشرة بين العظم والدبوس ، باستثناء أي عضلات ووجه. هذا أمر بالغ الأهمية للتصوير المستقر أثناء بروتوكولات التحميل.
  7. أمسك الكاحل بالملقط وضع القدم في حمام مائي مملوء بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco (8-10 مل). قم بتثبيت المخلب في مكانه باستخدام كتيفة التحميل وقم بتوصيل الحامل بترتيب المشغل / خلية الحمل. يظهر التحضير والترتيب الجراحي المكتمل داخل الجهاز في الشكل 1.

3. التصوير

ملاحظة: يحتوي إعداد الفحص المجهري الكامل ثنائي الفوتون المستخدم في هذا البروتوكول على حزمتين من البرامج: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 لليزر (الشكل 2) و ThorImageLS4.0 للمجهر (الشكل 3). للتصوير على الفوتونين ، اضغط على Live (الشكل 3 ، زر التشغيل الأزرق). عند إجراء تجربة لتصوير البيانات وحفظها، اضغط على Capture (الشكل 3، علامة التبويب في الأعلى، بجوار إعداد الالتقاط). هذه خاصة بالمعدات والبائعين المستخدمين في هذه التجربة ، ولكن العديد من البدائل ذات المواصفات الضرورية الموجودة في هذا البروتوكول (الأطوال الموجية للإثارة ، وحجم النافذة القابلة للعرض ، ومعدل التقاط الصور ، وما إلى ذلك) ستعمل أيضا.

  1. التقط بعناية فائقة إعداد جهاز التحميل بالماوس وضعه على منصة المجهر.
  2. ابدأ بهدف تكبير منخفض في وضع التألق (الشكل 3 ، القائمة المنسدلة في الأعلى مع تحديدات Multiphoton أو Fluorescence Setup) لتحديد موقع منتصف الحجاب الحاجز للعظم وتوسيطه.
  3. بعد تحديد موقع منطقة الاهتمام ، قم بالتبديل إلى تكبير موضوعي غمر الماء أعلى (20x-40x) وقم بتبديل البصريات إلى فوتونين (الشكل 3 ، القائمة المنسدلة في الأعلى مع تحديدات Multiphoton أو Fluorescence Setup).
    ملاحظة: حجم مجال الرؤية الموصى به لا يقل عن 250 ميكرومتر × 250 ميكرومتر للنشاط الخلوي ويمكن تحقيقه إما بالتكبير/التصغير البصري أو الرقمي حسب نظام التصوير.
    1. الحد الأدنى المناسب لكثافة البكسل هو 512 بكسل × 512 بكسل. لتعيين كثافة البكسل، استخدم إعدادات Galvo/Resonance Area Control (الشكل 3).
    2. عند العثور على عائد الاستثمار ، تجنب التبييض الضوئي عن طريق تقليل الطاقة باستخدام خيار التحكم في الطاقة (الشكل 3) وزيادة تضخيم PMT في إعدادات التحكم في Galvo / Resonance Scanner (الشكل 3).
    3. حدد سطح العظم في وضع الفوتون الثنائي من خلال البحث عن التألق الذاتي للسمحاق الليفي في القناة الخضراء التي تستخدم مرشح ممر النطاق المتمركز عند 525 نانومتر.
      ملاحظة: يكون التألق الذاتي أكثر وضوحا مع الطول الموجي للإثارة عند 1,000 نانومتر ولكنه متاح أيضا عند إثارة 920 نانومتر (الشكل 3 ، التحكم بالليزر متعدد الفوتونات). هذا المعلم مهم لتحديد العمق النسبي لعائد الاستثمار في قشرة مشط القدم عند مراقبة الخلايا العظمية. وتجدر الإشارة إلى أنه أثناء تجارب السلاسل الزمنية ، لا يتم تسجيل العمق الدقيق للمستوى المصور ، على الرغم من أنه يميل إلى أن يتراوح بين 15-30 ميكرومتر. إذا كانت قياسات العمق الدقيقة مطلوبة ، فيجب أخذ مكدس z.
  4. قم بإجراء نوبة تحميل تجريبية للتأكد من أن التحضير الجراحي وتحديد المواقع داخل جهاز التحميل كانا فعالين في تحقيق مجال عائد استثمار مستقر (أي عدم وجود إزاحة للمستوى z). باختصار ، قم بتشغيل دورة تحميل لتقييم استقرار المستحضر الجراحي. قم بإجراء التحميل عن طريق تشغيل القسم Switch on Servo و Move في كود Matlab.
    1. ضع حمولة فارغة صغيرة. تأكد من إعداد بروتوكولات تحميل موجات الهافرسين المناسبة في وقت مبكر. إدخال معلمات التحميل المناسبة التي تم الحصول عليها أثناء المعايرة في القسم 2.1. قم بإجراء التحميل عن طريق تشغيل القسم Switch on Servo و Move في كود Matlab.
    2. إذا كانت هناك حركة مرئية للخلايا على الشاشة ، والتي تأتي من الحركة الدقيقة للعظم استجابة للتحميل أو التنفس ، فحدد عائد استثمار مختلف على طول الاتجاهين y أو z للتأكد من أنه فوق دبوس نقطة الارتكاز المركزي مباشرة. إذا استمرت الحركة ، اضبط الوضع الجراحي للدبوس يدويا أسفل مشط القدم الثالث.
      ملاحظة: منطقة الاهتمام الجيدة (ROI) هي تلك التي لا تتحرك فيها الخلايا داخل وخارج المستوى / التركيز. يمكن ضبط الحركة في اتجاهي x و y للمعالجة اللاحقة باستخدام المكون الإضافي لمطابقة القالب على ImageJ.
  5. إجراء تصوير z-stack أو t-series مع التحميل وفقا للتصميم التجريبي لتسجيل أحداث الإشارات المورفومترية أو الديناميكية الناجمة عن الحمل ، على التوالي.
    1. اضبط الطول الموجي للإثارة لمؤشر الفلورسنت (على سبيل المثال ، 920 نانومتر ل GCaMP6f). بالنسبة إلى z-stack ، استخدم دقة منخفضة بما يكفي لالتقاط ميزات الخلايا العظمية ، مثل خطوات 0.25-1 ميكرومتر. بالنسبة للسلسلة t، استخدم الإعدادات لأخذ عينات من معدل التحميل 6 أضعاف على الأقل. بالنسبة لمعدل تحميل 1 هرتز ، يمثل التصوير بمعدل 6 إطارات في الثانية (FPS) الحد الأدنى من معدل الالتقاط المناسب (الشكل 3 ، التحكم في Galvo / Resonance Scanner).
    2. للتحميل والتصوير المباشر ، قم بتجميع بيانات خط الأساس غير المحملة مع كل نوبة. في هذه الدراسة ، يفضل 60 ثانية من التصوير غير المحمل متبوعا ب 60 ثانية من التحميل والتصوير. تصميم بروتوكولات التحميل والتصوير وفقا لذلك. لجمع البيانات، اضغط على الالتقاط (الشكل 3، علامة التبويب في الأعلى، بجوار إعداد الالتقاط).
      1. تقدر فترة المقاومة للاستجابة الكاملة لإشارات الكالسيوم في خلايا العظام بحوالي 15 دقيقة28. انتظر على الأقل هذه المدة الطويلة بين نوبات التحميل المتسلسلة عند جمع بيانات الإشارات الديناميكية.
      2. طوال التجربة بأكملها ، لا تترك دون رقابة للتأكد من أنه لا يستيقظ بشكل غير متوقع من التخدير أو يعاني من الضيق دون فرصة للتدخل.
        ملاحظة: يجب إجراء القتل الرحيم في نهاية الإجراء عن طريق خلع عنق الرحم أو غيرها من التدابير المناسبة وفقا للطرق المعتمدة من IACUC. هذا بروتوكول عدم البقاء على قيد الحياة مما يعني أن جميع يتم قتلها رحيما بعد التصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نبلغ هنا عن منهجية لدراسة إشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية المدمجة في الجسم الحي باستخدام التحضير الجراحي الحاد والتصوير الفلوري متعدد الفوتونات. يمكن ملاحظة إشارة الفلورسنت الخضراء من مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا في الخلايا العظمية عبر تعبير DMP1-Cre. الشكل 4 عبارة عن صورة أحادية المستوى لخلايا العظم المدمجة. لاحظ أن جميع الخلايا مصنفة وتعبر عن التألق الأخضر الأساسي ، مما يجعل من السهل العثور على مرشحين للمراقبة التجريبية. تكون أجسام الخلايا مرئية بوضوح ، وفي بعض الأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من الصعب دراسة الخلايا العظمية تجريبيا بسبب موقعها المضمن في مصفوفة الأنسجة الصلبة ، والتي تتدهور بسرعة أو تتمايز عند إزالة هذا المكان. تطلب البحث عن الخلايا العظمية براعة هائلة على مدى العقود الثلاثة الماضية ، مثل إنشاء خطوط شبيهة بالخلاياالعظمية 29،30،31 ، وإنشاء بروتوكولات لعزل الخلايا العظمية الأولية32،33 ، وحتى الجهود المبذولة لتحمي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 3 التعامل مع مشرطعلوم المجهر الإلكتروني72040-03المستلزمات الجراحية
20x هدف الغمر في الماءأوليمبوسXLUMPLFLN20XWهذا هدف 20x ، ولكن يمكن أيضا استخدام 40x لهذا البروتوكول. نوصي بالغمر في الماء لأنه يحتاج إلى غمس في الحمام أثناء التصوير ، لذلك قد يتسبب الهدف في الهواء الطلق في حدوث اختصارات
A.M. Bickford Omnicon F / AIRAM Bickford80120إجابة معقولة لمشاكل غاز التخدير في غرفة العمليات ، تم تصميم فلتر غاز التخدير F / AIR خصيصا لإزالة نفايات غازات التخدير مثل Isoflurane ، Halothane ، Enflurane ، إلخ من بيئة غرفة العمليات.
A.M. Bickford Omnicon F / AIR Kit  AM Bickford80000مجموعة كاملة مع أنبوب ومحولات لتوصيل F / AIR لإعداد
B6J. Cg-GT (ROSA) 26Sortm95.1 (CAG-GCaMP6f) Hze / MwarJمختبر جاكسون28865GCaMP6f الفئران للتهجين مع الفئران Dmp1-Cre
B6N. FVB-Tg (Dmp1-cre) 1Jqfe / BwdJمختبر جاكسون23047Dmp1-Cre الفئران للتكاثر المهجين مع GCaMP6f   الفئران
خلية تحميل الضغطFUTEK Advanced Sensor Technology، Inc.905898LCM100 ، 1000 جم ، خلية تحميل الضغط والضغط شبه المصغرة (مصغرة / مضمنة الملولبة) ، خالية من الرصاص بنفايات ، مادة - 17-4 PH S.S. ، M3x0.5-thread ، 34 Awg 4 كابل بوليستر مضفر موصل ، 5 أقدام Corning Long
500 مل DPBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco) ، 1x [+] كالسيوم ، مغنيسيومVWR International21-030-CVحمام متوازن أيونيا يحتوي على الكالسيوم يغمر مشط القدم أثناء التصوير
أداة اختيار الأسنانعلوم المجهراللوازم الجراحية
الكحول الإيثيلي النقي 200 دليل على كاشف ACS >99.5٪Sigma AldrichSIAL-459844-500MLأغراض التعقيم
دبوس نقطة الارتكازFathomN / Aملفقة عن طريق التلبيد بالليزر ثلاثي الأبعاد المباشر للفولاذ المقاوم للصدأ (سبيكة PH1) من ملفات 3D SolidWorks STL. كان البائع الأصلي هو GPI Prototype & amp يتم توفير المواصفات لشركة Manufacturing Services، Inc ، التي استحوذت عليها FATHOM الآن ، في الوثيقة المنشورة سابقا مجموعة
إخراج USB220 عالية الدقة والسرعةFUTEK Advanced Sensor Technology، Inc.717435يستخدم لتوصيل خلية التحميل بالكمبيوتر المحمول
ImageJ 1.53t مع Java 1.8.0_172 (لنظام التشغيل Windows 64 بت)NIHN / Aقم بالتثبيت هنا https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranePiramal Critical Care66794-013-25100٪ سائل بخار استنشاق
قوس تحميلFathomN / Aملفقة عن طريق التلبيد المباشر بالليزر ثلاثي الأبعاد للفولاذ المقاوم للصدأ (سبيكة PH1) من ملفات 3D SolidWorks STL. كان البائع الأصلي هو GPI Prototype & amp تم توفير المواصفات لشركة Manufacturing Services، Inc ، التي استحوذت عليها FATHOM الآن ، في الوثيقة المنشورة مسبقا
MATLAB R2019aMathWorksلتشغيل جهاز التحميل
Matrx VIP 3000 المرذاذ ملء جيدا الأيزوفلورانبتلر شاين صحة14309المرذاذ للتخدير
مقياس التأكسج النبضي نونين موديل 2500A Vet2500A Vet
Pie Piezo servo وحدة تحكمPI-USAE-625مكون إلكتروني موصى به من قبل الشركة لاستخدامه مع المشغل
PiezoMove مشغل بيزو خطي عالي الصلابةPI-USAP-602.5SLالمحرك لجهاز التحميل
شفرات مشرط ، رقم 10 للمقبض رقم 3 ، حزمة من 100علوم المجهر الإلكتروني72044-10مستلزمات جراحية
ملاقط من الفولاذ المقاوم للصدأ بأطراف حادة ودقيقة. الطول: 120 ملمعلوم المجهر الإلكتروني78326-42المستلزمات الجراحية
مجهر Thorlabs Bergamo متعدد الفوتونThorLabsN / Aهذا هو نظام التصوير فقط ولا يحتوي على الليزر المتضمن ، على الرغم من أن ThorLabs لديها خيارات ليزر إذا رغبت في
التيتانيوم سافير Chameleon Discovery NX مع التحكم الكلي في الطاقة (TPC)متماسكN / Aيحتوي هذا النظام تقنيا على ليزرين ، ليزر قابل للضبط وليزر ثابت. ومع ذلك ، بالنسبة للبروتوكول ، هناك حاجة فقط إلى القابل للضبط.
مقص زنبركي Vannas - أدواتالعلوم15018-10مستلزمات جراحية
حمام مائيFathomN / Aملفقة عن طريق التلبيد المباشر بالليزر ثلاثي الأبعاد للفولاذ المقاوم للصدأ (سبيكة PH1) من ملفات 3D SolidWorks STL. كان البائع الأصلي هو GPI Prototype & amp يتم توفير المواصفات لشركة Manufacturing Services، Inc ، التي استحوذت عليها FATHOM الآن ، في الوثيقة المنشورة سابقا
الإلكتروني ذلك الدقيقة 4 مم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid. Bone. 51 (3), 466-473 (2012).
  2. Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Matrix-dependent adhesion mediates network responses to physiological stimulation of the osteocyte cell process. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12096-12101 (2013).
  3. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: A fluid-structure interaction approach. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 85-97 (2013).
  4. Genetos, D. C., Kephart, C. J., Zhang, Y., Yellowley, C. E., Donahue, H. J. Oscillating fluid flow activation of gap junction hemichannels induces atp release from MLO-Y4 osteocytes. Journal of Cellular Physiology. 212 (1), 207-214 (2007).
  5. Lu, X. L., Huo, B., Chiang, V., Guo, X. E. Osteocytic network is more responsive in calcium signaling than osteoblastic network under fluid flow. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (3), 563-574 (2012).
  6. Schaffler, M. B., Kennedy, O. D. Osteocyte signaling in bone. Current Osteoporosis Reports. 10 (2), 118-125 (2012).
  7. Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/ -Catenin signaling is required for normal bone homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
  8. Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
  9. Kennedy, O. D., et al. Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations. Bone. 50 (5), 1115-1122 (2012).
  10. Rawlinson, S. C. F., Wheeler-Jones, C. P. D., Lanyon, L. E. Arachidonic acid for loading induced prostacyclin and prostaglandin E2 release from osteoblasts and osteocytes is derived from the activities of different forms of phospholipase A2. Bone. 27 (2), 241-247 (2000).
  11. David, V., et al. Ex vivo bone formation in bovine trabecular bone cultured in a dynamic 3D bioreactor is enhanced by compressive mechanical strain. Tissue Engineering Part A. 14 (1), 117-126 (2008).
  12. Davies, C. M., et al. Mechanically loaded ex vivo bone culture system "Zetos": systems and culture preparation. European Cell & Materials. 11, 57-75 (2006).
  13. Adachi, T., et al. Osteocyte calcium signaling response to bone matrix deformation. Journal of Biomechanics. 42 (15), 2507-2512 (2009).
  14. Huo, B., Lu, X. L., Guo, X. E. Intercellular calcium wave propagation in linear and circuit-like bone cell networks. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 368 (1912), 617-633 (2010).
  15. Morrell, A. E., et al. Mechanically induced Ca2+ oscillations in osteocytes release extracellular vesicles and enhance bone formation. Bone Research. 6, 6(2018).
  16. Jing, D., et al. In situ intracellular calcium oscillations in osteocytes in intact mouse long bones under dynamic mechanical loading. FASEB Journal. 28 (4), 1582-1592 (2014).
  17. Chen, T. -W., Wardill, T. J., Sun, Y., Pulver, S. R., Renninger, S. L. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  18. Jacobs, C. R., Temiyasathit, S., Castillo, A. B. Osteocyte mechanobiology and pericellular mechanics. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 369-400 (2010).
  19. Jing, D., et al. Spatiotemporal properties of intracellular calcium signaling in osteocytic and osteoblastic cell networks under fluid. Bone. 53 (2), 531-540 (2013).
  20. Thi, M. M., Suadicani, S. O., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Mechanosensory responses of osteocytes to physiological forces occur along processes and not cell body and require αVβ3 integrin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21012-21017 (2013).
  21. Wang, Y., McNamara, L. M., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for the role of integrins in flow induced mechanotransduction in osteyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15941-15946 (2007).
  22. McNamara, L. M., Majeska, R. J., Weinbaum, S., Friedrich, V., Schaffler, M. B. Attachment of osteocyte cell processes to the bone matrix. The Anatomical Record. 292 (3), 355-363 (2009).
  23. Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K., Witten, P. E. Buried alive: How osteoblasts become osteocytes. Developmental Dynamics. 235 (1), 176-190 (2005).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  25. Lewis, K. J., et al. Osteocyte calcium signals encode strain magnitude and loading frequency in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11775-11780 (2017).
  26. Lu, Y., et al. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. Journal of Dental Research. 86 (4), 320-325 (2007).
  27. Rubin, C. T., Lanyon, L. E. Dynamic strain similarity in vertebrates; an alternative to allometric limb bone scaling. Journal of Theoretical Biology. 107 (2), 321-327 (1984).
  28. Jacobs, C. R., et al. Differential effect of steady versus oscillating flow on bone cells. Journal of Biomechanics. 31 (11), 969-976 (1998).
  29. Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
  30. Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
  31. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  32. vander Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
  33. Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
  34. Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة