تحديد وعزل وحدة تشكيل الانفجار ووحدة تشكيل المستعمرات أسلاف الإريثرويد من أنسجة الفأر عن طريق قياس التدفق الخلوي

يمكن تقسيم تكون الكريات الحمر إلى مرحلتين رئيسيتين: تكون الكريات الحمر المبكر والتمايز النهائي للإريثرويد (الشكل 1) ^1،2،3. في الكريات الحمر المبكرة ، تلتزم الخلايا الجذعية المكونة للدم بسلالة الكريات الحمر وتؤدي إلى ظهور أسلاف الإريثرويد المبكرة ، والتي تم تحديدها لأول مرة في 1970s بناء على إمكاناتها في تكوين مستعمرة في وسط شبه صلب⁴،⁵،⁶،⁷،^8،9 . على نطاق واسع ، تنقسم أسلاف الإريثرويد إلى فئتين: السلف السابقة التي يؤدي كل منها إلى "انفجار" (مجموعة كبيرة من مجموعات خلايا الإريثرويد الأصغر) ، تسمى "وحدة تشكيل الانفجار erythroid" أو BFU-e⁴،^5،6 ؛ وذريتهم ، التي يشكل كل منها مجموعة خلايا أو مستعمرة واحدة صغيرة من الكريات الحمر ، تسمى "وحدة تشكيل مستعمرة erythroid" أو CFU-e⁷،^8،9. BFU-e و CFU-e لا يعبران بعد عن جينات الإريثرويد الطرفية ولا يمكن التعرف عليهما شكليا. بعد عدد من انقسامات خلايا التجديد الذاتي أو التوسع ، يخضع CFU-e لتبديل نسخي يتم فيه تحفيز جينات الإريثرويد مثل الغلوبين ، وبالتالي الانتقال إلى التمايز الطرفي الإريثرويد (ETD)^1,10. أثناء ETD ، تخضع الأرومات الحمراء لثلاثة إلى خمسة انقسامات خلوية قبل استئصالها لتشكيل خلايا شبكية تنضج إلى خلايا حمراء.

تم تصنيف الأرومات الحمراء أثناء التمايز النهائي في الأصل بناء على مورفولوجيتها إلى أرومات الدم الحمراء ، والقاعدية ، ومتعددة الألوان ، وتقويم الألوان. سمح ظهور قياس التدفق الخلوي بفرزها وعزلها المحتمل بناء على حجم الخلية (يقاس بالتشتت الأمامي ، FSC) وعلامتين لسطح الخلية ، CD71 و Ter119 11،^12،13 (الشكل 1). أحدث هذا النهج ونهج قياس التدفق الخلوي^{المماثل 14} ثورة في التحقيق في الجوانب الجزيئية والخلوية ل ETD ، مما يسمح بتحليل المرحلة التنموية الخاصة بالأرومات الحمراء في الجسم الحي وفي المختبر 10،¹⁵،^16،17،¹⁸،^19،20. يستخدم نهج CD71 / Ter119 الآن بشكل روتيني في تحليل سلائف الإريثرويد.

حتى وقت قريب ، كان نهج قياس التدفق الخلوي المماثل الذي يمكن الوصول إليه للعزل المباشر وعالي النقاء ل CFU-e و BFU-e من أنسجة الفئران قد استعصى على المحققين. بدلا من ذلك ، استخدم الباحثون استراتيجيات قياس التدفق الخلوي التي تعزل جزءا صغيرا فقط من هذه الأسلاف ، غالبا في وجود خلايا غير حمراء تشارك في التنقية داخل نفس المجموعات الفرعية لقياس التدفق الخلوي²¹. وبالتالي ، اقتصر التحقيق في BFU-e و CFU-e على أنظمة التمايز في المختبر التي تستمد وتضخم BFU-e و CFU-e من أسلاف نخاع العظم السابقة. من الممكن بعد ذلك تطبيق استراتيجيات قياس التدفق الخلوي التي تميز CFU-e عن BFU-e في هذه الثقافات المخصب بالسلف الإريثرويد^22،23. يستخدم نهج بديل CFU-e الجنيني و BFU-e ، والتي يتم تخصيبها بدرجة عالية في الجزء السلبي Ter119 من كبد الجنين الفأر في منتصف الحمل¹⁰،^24،25. ومع ذلك ، لا يسمح أي من هذين النهجين بالتحقيق في البالغين BFU-e و CFU-e في حالتهم الفسيولوجية في الجسم الحي. يمكن تقدير حجم التحدي عند تذكر أنه بناء على فحوصات تكوين المستعمرة ، توجد هذه الخلايا في نخاع العظم البالغ بتردد 0.025٪ و 0.3٪ فقط على التوالي⁶.

البروتوكول الموصوف هنا هو نهج جديد لقياس التدفق الخلوي يعتمد على التحليل النسخي أحادي الخلية لخلايا نخاع عظم الفأر ^{Kit +} التي تم حصادها حديثا (يتم التعبير عن Kit من قبل جميع مجموعات السلف المبكرة لنخاع العظام)¹. يحتوي نهجنا على بعض علامات سطح الخلية التي كانت قيد الاستخدام بالفعل بواسطة Pronk et ^al.21,26. تم استخدام النسخ أحادي الخلية لتحديد مجموعات من علامات سطح الخلية التي تحدد الكريات الحمر وغيرها من السلف المكونة للدم المبكرة (الشكل 2). على وجه التحديد ، يمكن تقسيم جزء CD55 + من خلايا Kit ⁺ سالبة النسب (Lin^-) إلى خمس مجموعات ، ثلاثة منها تنتج أجزاء متجاورة من مسار الكريات الحمر (الشكل 2). تم تأكيد الهويات النسخية لكل من هذه المجموعات السكانية عن طريق الفرز ، متبوعا ب scRNAseq وإسقاط النسخ أحادية الخلية المصنفة مرة أخرى على خريطة النسخ الأصلية (يمكن استكشاف التعبير الجيني في كل من المجموعات السكانية الخمس ومجموعة بيانات نخاع العظم بأكملها في https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . تم تأكيد إمكانات مصير الخلية لكل مجموعة من المجموعات باستخدام مقايسات تكوين المستعمرة التقليدية (الشكل 2) ، بالإضافة إلى مقايسة مصير خلية واحدة جديدة عالية الإنتاجية ^1,27. تظهر هذه التحليلات أن نهج قياس التدفق الخلوي الجديد يؤدي إلى عزل عالي النقاء لجميع أسلاف BFU-e و CFU-e لنخاع العظم والطحال البالغين الجدد. على وجه التحديد ، يحتوي السكان 1 (P1) فقط على CFU-e ولا يحتوي على أسلاف أخرى مكونة للدم ، ويحتوي السكان 2 (P2) على جميع أسلاف BFU-e في نخاع العظم وعدد صغير من CFU-e ولكن لا يوجد أسلاف أخرى¹. يتم توضيح البروتوكول المفصل أدناه بمزيد من التفصيل مع مثال على تجربة في الفئران التي تم حقنها إما بالمحلول الملحي أو بهرمون الإريثروبويتين المنبه لتكوين الكريات الحمر (Epo).

أجريت جميع التجارب وفقا لبروتوكولات الحيوانات A-1586 و 202200017 المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان.

ملاحظة: تم تفصيل بروتوكولين هنا: أولا ، تحليل التدفق الخلوي (القسم 1) ، متبوعا بتعديلات البروتوكول للفرز الخلوي للتدفق (القسم 2). يستخدم البروتوكول أدناه مقياس التدفق الخلوي / فارز مع 10 قنوات. ويرد مثال على الإعداد في الجدول 1، المشار إليه في الخطوة 1-14-5. من الممكن أيضا تشغيل هذا البروتوكول بتسع قنوات فقط ؛ انظر وسيلة الإيضاح في الجدول 2.

1. تحليل التدفق الخلوي

1. القتل الرحيم للفئران البالغة (>6 أسابيع) Balb / C أو C57BL6 باستخدام طريقة مناسبة معتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (على سبيل المثال ، استنشاق CO₂ متبوعا بخلع عنق الرحم). لتحليل التدفق الخلوي ، سيكون نخاع العظم (BM) من فأر واحد كافيا. للفرز ، يعتمد عدد الفئران على تطبيقات المصب. ويرد أدناه غلة الخلية لكل مجموعة سكانية (الخطوة 2.3.3).
2. حصاد الأنسجة:
   1. قم بإعداد أنابيب فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) بسعة 5 مل تحتوي على 3 مل من محلول تلطيخ بارد (4 درجات مئوية) ("SB5": محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 0.2٪ ألبومين مصل بقري (BSA) ، 0.08٪ جلوكوز ، 5 مللي متر EDTA) على الثلج. استخدم هذا لوضع الأنسجة المحصودة.
   2. إعداد أنابيب منفصلة لكل الأنسجة تشريح من كل ماوس. لا تجمع المناديل من الفئران المتعددة.
   3. حصاد كل من عظم الفخذ وكلا الساقين. قم بإزالة جميع العضلات من العظام قبل وضعها في الأنبوب باستخدام SB5.
   4. تشريح الطحال من خلال شق على الجانب الأيسر من البطن.
3. استخراج خلايا نخاع العظم:
   1. ضع عظم الفخذ والساق الذي تم تشريحه حديثا مباشرة في مخزن تلطيخ بارد (SB5) واحتفظ بالأنابيب على الثلج حتى تصبح جاهزة لاستخراج نخاع العظم (BM). ضع ملاطا معقم نظيفا على الثلج في دلو. نقل العظام إلى هاون جنبا إلى جنب مع SB5 من الأنبوب.
   2. قص ما يقرب من 1 مم من نهايات كل عظم بمقص تشريح بحيث تصبح فتحة العظم مرئية فقط.
   3. استخدم إبرة 26 جم ومحقنة سعة 3 مل مملوءة ب SB5 لطرد النخاع من العظام وتجميعه في الهاون. كرر العملية 3-5 مرات باستخدام مخزن مؤقت جديد في كل مرة حتى تظهر العظام عديمة اللون.
   4. قم بتصفية النخاع المتدفق من خلال مرشح شبكي 100 ميكرومتر وجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يوضع على الثلج.
   5. استخدم الهاون والمدقة لسحق العظام المتدفقة في 5-10 مل من SB5. قم بتصفية خليط العظام المسحوقة والعازلة من خلال مصفاة الخلايا 100 ميكرومتر وتجمع مع الخلايا التي تم جمعها في الخطوة 1.3.4.
4. استخراج خلايا الطحال:
   1. قم بإعداد مرشح شبكي 100 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي فارغ سعة 50 مل يوضع على الجليد. ضع طحالا واحدا على مرشح الشبكة.
   2. أضف 0.5-1 مل من SB5 إلى الطحال لضمان عدم جفافه.
   3. باستخدام الجانب المطاطي من مكبس حقنة سعة 3 مل أو 5 مل ، اهرس الطحال عبر الشبكة. أضف المزيد من SB5 ، 5 مل في المرة الواحدة ، واستمر في الهرس حتى يتم جمع جميع الخلايا في الأنبوب.
5. من هذه النقطة فصاعدا ، يتم التعامل مع نخاع العظم وخلايا الطحال بنفس الطريقة.
6. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بشفط المادة الطافية باستخدام إعداد شفط الفراغ.
7. لعمل تعليق أحادي الخلية ، أعد تعليق الخلايا في 2 مل من SB5 وماصة لأعلى ولأسفل 50 مرة باستخدام P1000 مع طرف فتحة كبير (انظر جدول المواد). هذه لها فتحات طرف واسعة للمساعدة في منع تلف الخلايا الهشة.
8. لعد الخلايا ، أعد التعليق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 20 مرة. تمييع الخلايا بنسبة 1: 100 في SB5. امزج 10 ميكرولتر من الخلايا المخففة مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق واعتمد على مقياس الدم و / أو عداد الخلايا.
9. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا عند 33 × 10⁶ خلايا حية / مل في SB5.
10. تحضير كوكتيل Lin-FITC عن طريق خلط كميات متساوية من كل جسم مضاد في الجدول 3.
11. قم بإعداد الخلايا لعناصر التحكم أحادية اللون وعناصر التحكم "مضان ناقص واحد" (FMO). نفذ الخطوات 1.11-1.12 بالتوازي مع تحضير وتلطيخ خلايا العينة في الخطوة 1.14 (عينات لتحليل التدفق الخلوي) و / أو الخطوة 2.1 (فرز التدفق الخلوي).
    1. قم بإعداد الخلايا للتحكم في الخلايا غير الملوثة عن طريق نقل 50 ميكرولتر (1.6 × 10⁶ خلايا) من تعليق الخلية إلى أنبوب FACS على الجليد. قم بإعداد الخلايا لكل عنصر تحكم في اللون (11 أنبوبا) عن طريق نقل 50 ميكرولتر (1.6 × 10⁶ خلايا) من تعليق الخلية إلى أنبوب FACS على الجليد.
    2. قم بإعداد عناصر تحكم FMO للألوان التالية (Kit ، CD41 ، CD150 ، CD49f [أربعة أنابيب]) عن طريق نقل 300 ميكرولتر (10 × 10⁶ خلايا) من تعليق الخلية إلى أنبوب FACS منفصل على الجليد.
    3. قم بتدوير الخلايا عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الطافية.
12. تلطيخ الأجسام المضادة ل FMOs وأدوات التحكم في اللون الواحد
    1. وصم FMOs عند 33 × 10⁶ خلايا / مل (في الحجم الكلي 300 ميكرولتر) في أنابيب FACS. لكل عنصر تحكم ، أضف جميع الأجسام المضادة باستثناء الجسم المضاد الذي يحمل الاسم نفسه ل FMO. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى Kit FMO ، اترك الجسم المضاد Kit. لكل جسم مضاد ، استخدم التخفيف والتركيز النهائي كما في الجدول 2.
    2. صبغ عناصر التحكم أحادية اللون عند 20 × 10⁶ خلايا / مل (في الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر) في أنابيب FACS ؛ لكل عنصر تحكم ، أضف جسما مضادا واحدا عند التركيز المدرج في الجدول 2.
    3. دوامة كل أنبوب تحكم لمدة 2-3 ثوان عند 3000 دورة في الدقيقة (دورات في الدقيقة) ، ثم احتضان عند 4 درجات مئوية ، هزاز لمدة 2.5 ساعة في الظلام ، محمي من الضوء. هز الأنابيب بمحور دوران مواز لطول الأنبوب ، بين زاوية 10 درجات و 60 درجة تقريبا من الأفقي ، بحيث لا تلمس المحتويات الغطاء.
    4. اغسل الخلايا باستخدام SB5: اصنع حجم تعليق الخلية إلى 4 مل باستخدام SB5. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
13. تعليق الخلية:
    1. أعد تعليق عناصر التحكم غير الملوثة وجميع عناصر التحكم أحادية اللون (باستثناء عنصر التحكم DAPI) في 300 ميكرولتر من SB5 وقم بالتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS جديد.
    2. اصنع محلول DAPI / SB5 عن طريق تخفيف مخزون DAPI (1 مجم / مل في 100٪ إيثانول) عند 1: 10000 في SB5.
    3. إعادة تعليق FMOs في 1.8 مل من DAPI / SB5 والتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS جديد
    4. أعد تعليق التحكم في اللون الأحادي DAPI في 300 ميكرولتر من DAPI / SB5 وقم بالتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS جديد سعة 4 مل.
14. تحضير العينة: إذا كانت الخلايا قيد التحضير لتحليل قياس التدفق الخلوي ، فانتقل إلى الخطوة 1.14. في حالة إعداد الخلايا للفرز ، انتقل إلى الخطوة 2.1.
15. صبغ عينات التحليل الخلوي للتدفق عند 33 × 10 6 خلية / مل في حجم إجمالي قدره 300 ميكرولتر (10 × 10⁶ خلايا) في أنابيب FACS:
    1. تحضير مزيج سيد الأجسام المضادة. حدد حجم المزيج الرئيسي بعدد العينات ، مع 300 ميكرولتر لكل عينة. اصنع المزيج الرئيسي عن طريق تخفيف جميع الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 2 عند التخفيف المشار إليه في SB5. يعمل Rabbit IgG في المزيج الرئيسي ككتلة Fc.
    2. دوامة كل أنبوب لمدة 2-3 ثوان عند 3000 دورة في الدقيقة ، ثم احتضان عند 4 درجات مئوية ، هزاز لمدة 2.5 ساعة في الظلام ، محمية من الضوء.
    3. اغسل الخلايا باستخدام SB5: اصنع حجم تعليق الخلية إلى 4 مل باستخدام SB5. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
    4. إعادة تعليق العينات لتحليل التدفق الخلوي في 1.8 مل من DAPI / SB5 كما هو معد في الخطوة 1.12.5.2 والتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS.
    5. تحليل العينات على مقياس خلوي مع 10 قنوات لاستيعاب اتحادات الأجسام المضادة في الجدول 2 وصبغة الجدوى DAPI. يتم توفير مثال لإعداد القناة في الجدول 1. من الممكن أيضا استخدام تسع قنوات فقط ؛ انظر وسيلة إيضاح الجدول 2 .
    6. أثناء تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي ، استخدم مناهج التعويض الطيفي القياسية بمساعدة عناصر التحكم أحادية اللون وعناصر التحكم في FMO كما هو مفصل في الخطوة 2.4.

2. تعديلات البروتوكول للفرز الخلوي للتدفق

1. إعداد لين^-
   1. قم بتجميع جميع الخلايا المستخرجة من نفس الأنسجة (إما BM أو الطحال) من 10 فئران في أنبوب سعة 50 مل. أعد تعليق كل عينة مجمعة عن طريق السحب باستخدام P1000 بطرف فتحة كبير.
   2. قم بتدوير الخلايا عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الطافية.
   3. قم بإعداد عناصر تحكم أحادية اللون و FMO كما هو موضح في القسم 1 باستخدام خلايا غير مخصبة.
   4. إثراء ^{خلايا Lin} للفرز باستخدام إثراء الخرزة المغناطيسية لخلايا Lin^:
   5. أعد تعليق الخلايا بمعدل 1 × 10⁸ خلايا / مل باستخدام SB5 وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. أضف مصل الفئران الطبيعي والأجسام المضادة للبيوتينيل المدرجة في الجدول 4 واحتضنها مع هزاز عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
   6. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 15 مل من SB5 البارد.
   7. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا عند 1 × 10⁸ خلايا / مل في SB5 البارد واحتفظ بها على الجليد.
   8. دوامة الخرز النانوي المغناطيسي عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 ثوان. خذ 1 مل من الحبيبات النانوية المغناطيسية لكل 10 مل من الخلايا.
   9. اغسل الخرز النانوي في أنبوب 5 مل FACS. اصنع الحجم إلى 4 مل باستخدام SB5 ، وقم بالدوران عند 900 × جم ، و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
   10. أعد تعليق الحبيبات النانوية في 500 ميكرولتر من SB5 واخلطها مع الخلايا المعدة في الخطوة 2.1.7. احتضان عند 4 درجات مئوية مع هزاز لمدة 15 دقيقة.
   11. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا عند 1 × 10⁸ خلايا / مل باستخدام SB5.
   12. ضع الأنبوب على مغناطيس عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
   13. صب بعناية الطاف في أنبوب جديد 15 مل.
   14. ضع الأنبوب الذي يحتوي على المادة الطافية من الخطوة 2.1.13 على مغناطيس عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. صب بعناية الطاف في أنبوب جديد 15 مل.
   15. قم بتدوير الخلايا من المادة الطافية في الخطوة 2.1.14 عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
   16. أعد تعليق الخلايا المخصبة ^ب Lin في 1 مل من SB5.
   17. تمييع 10 ميكرولتر من الخلايا في 1: 100 في SB5. امزج 10 ميكرولتر من الخلايا المخففة مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق واعتمد على مقياس الدم و / أو عداد الخلايا.
   18. استنادا إلى عدد الخلايا في الخطوة 2.1.17 ، أعد تعليق الخلايا المخصبة ب Lin-^-33 × 10⁶ خلايا / مل.
2. تلطيخ الخلايا المخصبة:
   1. صبغ عينات الخلايا المخصبة عند 33 × 10⁶ خلايا / مل في أنابيب FACS عن طريق إضافة جميع الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 2. دوامة كل أنبوب لمدة 2-3 ثوان عند 3000 دورة في الدقيقة ، ثم احتضان عند 4 درجات مئوية ، هزاز لمدة 2.5 ساعة في الظلام ، محمية من الضوء.
   2. اغسل الخلايا باستخدام SB5: قم بتكوين حجم أنابيب FACS إلى 4 مل باستخدام SB5. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية.
   3. أعد تعليق العينات لتحليل التدفق الخلوي في 4-6 مل من DAPI / SB5 كما هو معد في الخطوة 1.12.5.2 وقم بالتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS جديد سعة 4 مل.
3. فرز العينات:
   1. قم بفرز العينات باستخدام فوهة كبيرة وضغط منخفض لزيادة إنتاجية CFU-e إلى أقصى حد نظرا لأن خلايا CFU-e تتلف بسهولة تحت ضغط مرتفع. بالنسبة لمقياس التدفق الخلوي المستخدم في هذه الدراسة ، استخدم 14 رطلا لكل بوصة مربعة وفوهة 100 ميكرومتر أو 12 رطلا لكل بوصة مربعة مع فوهة 130 ميكرومتر. قم بإعداد بوابات الفرز كما هو موضح في الخطوة 2.4 أدناه.
   2. تحضير المخزن المؤقت للجمع: أضف 20٪ مصل بقري جنيني إلى برنامج تلفزيوني.
   3. للتحقق من نقاء السكان الذين تم فرزهم، أعد تشغيل حصة صغيرة من كل مجموعة تم فرزها في مخزن مؤقت يحتوي على DAPI، كما هو موضح في الخطوة 1.12.5.2.
      ملاحظة: عادة ، ينتج BM من إجمالي 10 فئران (حوالي 1 × 10⁹ خلايا) ما لا يقل عن 50000-100000 خلية لكل من مجموعات P1-hi و P1-low و P2 مع قابلية بقاء تبلغ حوالي 70٪.
4. استخدم استراتيجية البوابة الموضحة في الشكل 3 للتحليل أو إعداد بوابات الفرز.
   1. استخدم معلمة التشتت الأمامي (FSC) لإزالة الحطام بناء على الحجم. استخدم الرسم البياني لارتفاع FSC مقابل الرسم البياني لمنطقة FSC لاستبعاد مجاميع الخلايا وتحديد الخلايا المفردة ؛ كرر ذلك مع الرسم البياني للتشتت الجانبي (SSC) مقابل الرسم البياني لمنطقة SSC.
   2. استبعد الخلايا الميتة عن طريق إخراج الخلايا الإيجابية لصبغة الحمض النووي DAPI ، والتي تكون الخلايا القابلة للحياة غير منفذة لها.
   3. حدد خلايا Lin-Ter119-Kit ⁺ ، ومن هذه الخلايا ، حدد مجموعة فرعية تعبر عن CD55.
   4. قسم خلايا Lin- Ter119-Kit + CD55 ⁺ إلى مجموعتين رئيسيتين ، P6 و P7 ، بناء على التعبير عن CD49f و CD105.
   5. استنادا إلى التعبير عن CD150 و CD41 ، قم بتقسيم P6 إلى P3 (أسلاف الخلايا القاعدية أو الخلايا البدينة) ، و P4 (أسلاف الخلايا الضخمة النواة) ، و P5 (EBMP و MPP المتحيز للإريثرويد).
   6. استنادا إلى التعبير عن CD150 و CD71 ، قم بتقسيم P7 إلى P2 (BFU-e) ، وأوائل CFU-e (P1-low) ، وأواخر CFU-e (P1-hi).

يصف البروتوكول نهج قياس التدفق الخلوي لتحديد BFU-es و CFU-es في خلايا نخاع العظم والطحال التي تم حصادها حديثا. يبدأ بحصاد BM الطازج والطحال من الفئران ووضع الأنسجة على الجليد على الفور. يتم إجراء جميع الإجراءات في البرد للحفاظ على صلاحية الخلية. يتم تصنيف الخلايا بكوكتيل الأجسام المضادة "النسب" الذي يسمح باستبعاد جميع الخلايا التي تعبر عن علامات سلالات الدم المتمايزة (كوكتيل FITC- Lin ، الجدول 3 ، في حالة تحليل التدفق الخلوي ؛ أو إثراء الخرزة المغناطيسية ، الجدول 4 ، للخلايا سالبة النسب). يتم تصنيف الخلايا أيضا بأجسام مضادة ضد علامات تسمح لنا بتمييز عدد من مجموعات السلف المبكرة داخل جزء الخلية سالبة النسب. يتبع وضع العلامات إما فرز أو تحليل التدفق الخلوي. يشبه نهج الفرز الخلوي للتدفق نهج التحليل الخلوي للتدفق ولكنه يسبقه إثراء حبة مغناطيسية لجزء خلية Lin لتقليل وقت وتكلفة فرز أعداد كبيرة من الخلايا. عند فرز السلف ، يتم تجميع BM من فئران متعددة ، يعتمد الرقم على تطبيق المصب. عادة ، ينتج BM من إجمالي 10 فئران (حوالي 1 × 109 خلايا) ما لا يقل عن 50000-100000 خلية لكل من مجموعات P1-hi و P1-low و P2 مع صلاحية تبلغ حوالي 70٪.

الفرق الرئيسي بين السكان المشتقين من الطحال و BM الذين حددهم هذا البروتوكول هو التردد الأقل بكثير لسكان P6 ومجموعاتهم الفرعية ، P4 / P5 / P3 ، في الخلايا المشتقة من الطحال.

كمثال على تحليل التدفق الخلوي ، تم فحص تأثير إعطاء Epo في الفئران. يرتبط Epo بمستقبل Epo (EpoR) وينشطه ، وهو أمر ضروري لكل من الكريات الحمر القاعدية والمتسارعة في ظل ظروف الإجهاد مثل نقص الأكسجة. يحفز نقص الأكسجة زيادة مستويات Epo في الدم 28,18 ، مما يعزز بدوره توسيع CFU-e 1,29 وسلائف الإريثرويد.

تم حقن Epo (0.25 وحدة / جم من وزن الجسم) أو حجم متساو من السيارة (محلول ملحي) تحت الجلد في الفئران مرة واحدة كل 24 ساعة لمدة 3 أيام. تم حصاد BM والطحال في 72 ساعة. أدى تحفيز Epo إلى توسع مجموعات CFU-e المبكرة والمتأخرة (P1-low و P1-hi) في كل من BM والطحال (الشكل 4 والشكل 5).

الشكل 1: مرحلتان رئيسيتان من تكون الكريات الحمر النهائي. يمكن تقسيم الكريات الحمر إلى مرحلة مبكرة ، حيث يتم تعريف السلف بناء على إمكاناتهم في تكوين مستعمرة ، ومرحلة لاحقة تعرف باسم التمايز الطرفي الإريثرويد (ETD) ، حيث يتم تعريف مرحلة الكريات الحمر بناء على المورفولوجيا. سمحت تقنيات قياس التدفق الخلوي بالعزل المحتمل لمراحل الأرومة الحمراء المحددة تنمويا باستخدام FSC و Ter119 و CD71. على النقيض من ذلك ، لم تكن هناك طريقة مكافئة لعزل أسلاف BFU-e و CFU-e مباشرة من الأنسجة ذات النقاء العالي. لاحظ أنه يتم عرض جزء صغير فقط من مستعمرة BFU-e. ينطبق شريط المقياس على كل من مستعمرات CFU-e و BFU-e. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: استراتيجية جديدة لقياس التدفق الخلوي لعزل CFU-e و BFU-e مباشرة من الأنسجة. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لتحديد خمس مجموعات جديدة لقياس التدفق الخلوي، من P1 إلى P5، بناء على تحليل بيانات scRNAseq. (أ) إسقاط الرسم البياني الموجه بالقوة ("مخطط الربيع") لنسخ نخاع العظم أحادية الخلية الطازجة Balb / C. تشير الألوان إلى إمكانات مصير الخلية المتوقعة بناء على معلومات النسخ وخوارزمية تحليل التوازن السكاني (PBA)1. يشار إلى مناطق المؤامرة التي تتوافق مع كل من مجموعات قياس التدفق الخلوي P1 إلى P5. المناطق المحددة هي تقريب مرسوم باليد للبيانات الأصلية ، والتي يمكن العثور عليها في Tusi et al.1. تم تأكيد المراسلات من خلال إجراء scRNAseq لكل من المجموعات السكانية P1 إلى P5 التي تم فرزها1. E = احمرار ؛ Ba = أسلاف الخلايا القاعدية أو الخلايا البدينة ؛ ميج = السلف ضخامة النواة. Ly = السلف اللمفاوي. D = السلف التغصني ؛ M = السلف وحيدة الخلية ؛ G = السلف المحبب. (ب) مقايسات تكوين المستعمرات ، أعيد رسمها من Tusi et al.1. تم فرز مجموعات P1 إلى P5 وخلايا CD55 + كما هو موضح في هذا البروتوكول ، وتم طلاء كل مجموعة سكانية لفحوصات تكوين المستعمرة ذات الصلة. تم تسجيل مستعمرات الإريثرويد في الأيام المشار إليها. UF = أحادي البؤرة ؛ MF = متعدد البؤر ؛ CFU-MK = وحدة تشكيل مستعمرة ضخمة النواة ؛ CFU-GM = وحدة تشكيل مستعمرة المحببة / وحيدة الخلية ؛ CFU-GEMM = وحدة تشكيل مستعمرة المحببة ، الكريات الحمر ، وحيدة الخلية ، ضخمة النواة. ج: علامات سطح الخلية التي تحدد كل مجموعة من المجموعات السكانية الخمسة، بالإضافة إلى إمكانات مصيرها. إمكانات مصير الخلية هي نتيجة لمعلومات النسخ ومقايسات مصير الخلية ، كل من تكوين المستعمرة ومقايسات مصير الخليةالواحدة 1,27. وتجدر الإشارة إلى أن السكان P1 تم تقسيمهم بناء على تعبير علامة CD71 إلى P1-hi و P1-low1. استنادا إلى بيانات من Tusi et al.1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: استراتيجية بوابات التدفق الخلوي. استراتيجية البوابة الكاملة للسكان من P1 إلى P5. نخاع العظم الذي تم حصاده حديثا (BM) أو الطحال (SP) من فأر Balb / C المحقون تحت الجلد ب 100 ميكرولتر من محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ يتم إغلاقه أولا للسكان الرئيسيين ، والتخلص من الحطام. يتبع ذلك تحديد المفردات ، والتخلص من الخلايا الميتة ، والبوابات على الخلايا التي تكون سلبية Ter119 ، وسالبة النسب ، ومجموعة الأدوات السريعة. يتبع التقسيم الفرعي الإضافي ل Ter119-Lin-Kit + CD55 + إلى P6 و P7 التقسيم الفرعي النهائي إلى مجموعات من P1 إلى P5 (انظر أيضا الشكل 2). تسمح قناة Ter119 بتحليل الأرومات الحمراء على نفس العينة (باستخدام نهج Ter119 / CD7112). ومع ذلك ، فإن قناة Ter119 المنفصلة ليست ضرورية لهذا البروتوكول ، ويمكن حذف الجسم المضاد Ter119 من المزيج الرئيسي وتضمينه كجزء من كوكتيل Lin-FITC بدلا من ذلك. لا تظهر خطوة الاستبعاد للخلايا الموجبة Ter119 في استراتيجية البوابة هذه. الأرقام هي النسب المئوية لكل بوابة داخل الرسم البياني الموضح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تحليل أسلاف الإريثرويد المبكر لنخاع العظم والطحال بعد تحفيز Epo. مؤامرات قياس التدفق الخلوي التمثيلية لنخاع العظم الذي تم حصاده حديثا (BM) أو الطحال (SP). تم حقن الفئران Balb / C تحت الجلد إما بوزن جسم 0.25 وحدة / جم من Epo أو بحجم مكافئ من المحلول الملحي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: استجابة أسلاف BM والطحال ل Epo في الجسم الحي. إحصاءات موجزة تبين التغيرات في عدد الخلايا المطلق في المجموعات السكانية من P1 إلى P5 بعد حقن Epo في خلايا نخاع العظم (A) التي تم حصادها حديثا و (B) خلايا الطحال؛ *ع = 0.02. التجربة كما هو موضح في الشكل 4. ن = 4 فئران في كل مجموعة. لحساب عدد الخلايا المطلق ، تم ضرب تردد الخلايا في كل مجموعة سكانية إما في BM أو الطحال (من الشكل 4) في العدد الإجمالي لخلايا BM أو الطحال التي تم حصادها من كل فأر وقسمها على وزن الفأر بالجرام. وتجدر الإشارة إلى أن CFU-e المبكر فقط في BM وصل إلى دلالة إحصائية (p = 0.02) ، ومن المحتمل أن يكون مزيجا من جرعة Epo منخفضة نسبيا وعدد صغير من الفئران في كل مجموعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: مثال على تخطيط القناة في مقياس خلوي LSRII. لوحة الأجسام المضادة المستخدمة في البروتوكول الموصوف وترتيبها في مقياس التدفق الخلوي LSRII لجمع البيانات.

الجدول 2: مكونات مزيج الجسم المضاد الرئيسي. تكوين مزيج سيد الأجسام المضادة. تسمح قناة Ter119 بتحليل الأرومات الحمراء على نفس العينة (باستخدام نهج Ter119 / CD7112). ومع ذلك ، فإن قناة Ter119 المنفصلة ليست ضرورية لهذا البروتوكول ، ويمكن حذف الجسم المضاد Ter119 من المزيج الرئيسي وتضمينه كجزء من كوكتيل Lin-FITC بدلا من ذلك.

الجدول 3: مكونات كوكتيل لين. تكوين كوكتيل لين المستخدم كجزء من المزيج الرئيسي للأجسام المضادة (انظر تفاصيل المزيج الرئيسي في الجدول 2).

الجدول 4: الأجسام المضادة لتخصيب الخرزة المغناطيسية. تستخدم الأجسام المضادة لإثراء جزء Lin- من BM أو الطحال قبل فرز الخلايا.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.