تحديد وعزل وحدة تشكيل الانفجار ووحدة تشكيل المستعمرات أسلاف الإريثرويد من أنسجة الفأر عن طريق قياس التدفق الخلوي

Aishwarya Swaminathan; Yung Hwang; Ashley Winward; Merav Socolovsky

doi:10.3791/64373

مقالة منهجية

تحديد وعزل وحدة تشكيل الانفجار ووحدة تشكيل المستعمرات أسلاف الإريثرويد من أنسجة الفأر عن طريق قياس التدفق الخلوي

3.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64373

⸱

نوفمبر 4, 2022

Aishwarya Swaminathan¹ , Yung Hwang¹ , Ashley Winward¹ , Merav Socolovsky¹

¹Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMASS Chan Medical School

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف طريقة جديدة لقياس التدفق الخلوي للعزل المحتمل لوحدة تشكيل الانفجار المبكر erythroid (BFU-e) ووحدة تشكيل المستعمرة erythroid (CFU-e) مباشرة من نخاع عظم الفأر الطازج والطحال. هذا البروتوكول ، الذي تم تطويره بناء على بيانات النسخ أحادية الخلية ، هو الأول الذي يعزل جميع أسلاف الإريثرويد في الأنسجة بنقاوة عالية.

الملخص

تم تعريف أسلاف الإريثرويد المبكرة في الأصل من خلال قدرتها على تكوين مستعمرة في المختبر وتصنيفها إلى "وحدات" لتشكيل الانفجار وتشكيل المستعمرات المعروفة باسم BFU-e و CFU-e. حتى وقت قريب ، لم تكن طرق العزل المباشر والكامل والمحتمل لأسلاف BFU-e و CFU-e النقية من نخاع عظم الفأر البالغ المعزول حديثا متاحة. لمعالجة هذه الفجوة ، تم تحليل مجموعة بيانات RNA-seq أحادية الخلية (scRNAseq) لنخاع عظم الفأر للتعبير عن الجينات المشفرة لعلامات سطح الخلية. تم دمج هذا التحليل مع فحوصات مصير الخلية ، مما يسمح بتطوير نهج جديد لقياس التدفق الخلوي يحدد ويسمح بعزل مجموعات فرعية كاملة ونقية من أسلاف BFU-e و CFU-e في نخاع عظم الفأر أو الطحال. يحدد هذا النهج أيضا مجموعات فرعية سلفية أخرى ، بما في ذلك مجموعات فرعية مخصبة للخلية القاعدية / البدينة وإمكانات الخلايا الضخمة النواة. تتكون الطريقة من وضع علامات على نخاع العظم الطازج أو خلايا الطحال بأجسام مضادة موجهة إلى Kit و CD55. ثم تنقسم الأسلاف التي تعبر عن هاتين العلامتين إلى خمس مجموعات سكانية رئيسية. تحتوي المجموعة 1 (P1 أو CFU-e ، Kit + CD55 ⁺ CD49f med / low CD105 med / high CD71 med^/high) على جميع أسلاف CFU-e ويمكن تقسيمها أيضا إلى P1-low (CD71^medCD150 high) و P1-hi (CD71 ^high CD150^low) ، المقابلة ل CFU-e المبكر والمتأخر ، على التوالي ؛ السكان 2 (P2 أو BFU-e ، Kit + CD55 ⁺ CD49f med / low CD105 ^{med / high} CD71^منخفضCD150^مرتفع) يحتوي على جميع أسلاف BFU-e ؛ السكان P3 (P3 ، Kit + CD55 ⁺ CD49f med / high CD105 med /^lowCD150 منخفض CD41^منخفض) مخصب لأسلاف الخلايا القاعدية^/الخلايا البدينة. يتم إثراء السكان 4 (P4 ، Kit + CD55 + CD49f med / high CD105^{med / low}CD150^HighCD41⁺) للأسلاف الضخمة النواة. والسكان 5 (P5 ، Kit + CD55 ⁺ CD49f med / high CD105 med /^lowCD150^HighCD41^-) يحتوي على أسلاف مع إريثرويد ، خلية قاعدية / بدينة ، وإمكانات خلايا النواة الضخمة (EBMP) وأسلاف متعددة الإمكانات متحيزة لخلايا الدم الحمراء / ضخمة النواة^/متحيزة ل القاعدية (MPPs). يسمح هذا النهج الجديد بدقة أكبر عند تحليل الكريات الحمر وغيرها من الأسلاف المكونة للدم ويسمح أيضا بالرجوع إلى معلومات النسخ لكل مجموعة محددة خلويا.

المقدمة

يمكن تقسيم تكون الكريات الحمر إلى مرحلتين رئيسيتين: تكون الكريات الحمر المبكر والتمايز النهائي للإريثرويد (الشكل 1) ¹^،²^،³. في الكريات الحمر المبكرة ، تلتزم الخلايا الجذعية المكونة للدم بسلالة الكريات الحمر وتؤدي إلى ظهور أسلاف الإريثرويد المبكرة ، والتي تم تحديدها لأول مرة في 1970s بناء على إمكاناتها في تكوين مستعمرة في وسط شبه صلب⁴،⁵،⁶،⁷،⁸^،⁹ . على نط....