Method Article

كريسبر / كاس 9 بوساطة استهداف الجينات عالية الكفاءة في الخلايا الجذعية الجنينية لتطوير نماذج الفئران التلاعب بالجينات

DOI:

10.3791/64385

⸱

August 24th, 2022

 ,  , 
1Laboratory of Reproductive Systems Biology, Center for Experimental Medicine and Systems Biology, The Institute of Medical Science, The University of Tokyo, 2Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا لتطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيا باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية ، خاصة بالنسبة لضربات الحمض النووي الكبيرة (KI). تم ضبط هذا البروتوكول باستخدام تحرير جينوم CRISPR / Cas9 ، مما أدى إلى تحسين كفاءة KI بشكل كبير مقارنة بطريقة استهداف الحمض النووي الخطي التقليدية بوساطة إعادة التركيب المتماثل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أتاح نظام كريسبر / كاس 9 تطوير الفئران المعدلة وراثيا عن طريق التحرير المباشر للجينوم باستخدام الزيجوت المخصب. ومع ذلك ، على الرغم من أن الكفاءة في تطوير الفئران بالضربة القاضية الجينية عن طريق إحداث طفرة إندل صغيرة ستكون كافية بما فيه الكفاية ، فإن كفاءة تحرير جينوم الجنين لصنع ضربة قاضية كبيرة الحجم للحمض النووي (KI) لا تزال منخفضة. لذلك ، على عكس طريقة KI المباشرة في الأجنة ، لا يزال استهداف الجينات باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) متبوعا بحقن الأجنة لتطوير الفئران الوهمية يتمتع بالعديد من المزايا (على سبيل المثال ، استهداف الإنتاجية العالية في المختبر ، والتلاعب متعدد الأليل ، ويمكن إجراء معالجة الجينات Cre و flox في فترة قصيرة). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام السلالات ذات الأجنة التي يصعب التعامل معها في المختبر ، مثل BALB / c ، لاستهداف ESC. يصف هذا البروتوكول الطريقة المثلى ل KI كبير الحجم (عدة كيلوبايت) في ESCs من خلال تطبيق تحرير الجينوم بوساطة CRISPR / Cas9 متبوعا بإنتاج الفئران الوهمية لتطوير نماذج فأر يتم التلاعب بها بالجينات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن إنتاج الفئران المعدلة وراثيا وتحليل نمطها الظاهري يمكننا من فهم وظائف جينية محددة بالتفصيل ، في الجسم الحي. تم الكشف عن العديد من النتائج المهمة باستخدام نماذج حيوانية معدلة جينيا في مجال علوم الحياة. علاوة على ذلك ، منذ تقرير تقنية تحرير الجينوم باستخدام CRISPR / Cas91 ، انتشرت الأبحاث باستخدام الفئران المعدلة وراثيا بسرعة إلى العديد من المختبرات 2,3. حقق تحرير الجينوم لزيجوت الفئران بواسطة CRISPR / Cas9 كفاءة مقبولة لتطوير تعديل قصير للحمض النووي ، مثل خروج المغلوب الجيني الموجه نحو الطفرة 4 ، أو استبدال النوكليوتيداتالمفردة ، أو إدخال علامة الببتيد القصيرة باستخدام oligonucleotides مفردة الشريط (ssODNs) كمتبرعين غير مباشرين (KI)5. من ناحية أخرى ، يظل KI لشظايا الحمض النووي الكبيرة إلى زيجوت عن طريق تحرير الجينوم بكفاءة منخفضة مقارنة بتعديل الحمض النووي قصير الحجم 6,7. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب استخدام سلالات الفئران مثل BALB / c ، وهي سلالة مهمة لمجالات بحثية محددة مثل علم المناعة ، لتحرير الجينوم القائم على الزيجوت لأن أجنة ما قبل الزرع عرضة للتلاعب في المختبر.

هناك طريقة أخرى لتطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيا وهي استخدام تقنية استهداف الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) متبوعة بحقن ESC في الجنين قبل الزرع لإنتاج الوهم8،9،10 ، والذي لا يزال يستخدم بشكل روتيني كطريقة تقليدية. على الرغم من أن معدل الاستحواذ للحصول على استنساخ KI-ESC الدقيق ليس مرتفعا جدا في طرق استهداف ESC التقليدية ، إلا أن استهداف ESC يوفر بعض المزايا مقارنة بتحرير جينوم الزيجوت ، خاصة بالنسبة ل DNA KI الطويل. على سبيل المثال ، كفاءة KI لشظايا الحمض النووي الطويلة (> عدة كيلوبايت) في جينوم الزيجوت أقل وضوحا 6,7 ، وهناك حاجة إلى العديد من الزيجوت لتطوير حتى سطر واحد من فأر KI ، وهو أمر غير مرغوب فيه في المنظور الحالي للتجارب على الحيوانات. على عكس تحرير جينوم الزيجوت ، فإن استهداف الحمض النووي الطويل ل ESCs متبوعا بإنتاج الوهم يحتاج إلى أجنة أقل بكثير من تحرير جينوم الزيجوت. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن أجنة ما قبل الزرع من BALB / c عرضة للتلاعب في المختبر ، يمكن الحفاظ على ESCs الخاصة بها والتعامل معها في المختبر 11 مثل ESCs الخلفية 129 أو F1 المختصة الأخرى ، وبالتالي ، تنطبق على إنتاج الوهم. ومع ذلك ، على الرغم من أن ناقل الاستهداف يحتوي على أذرع متماثلة 5 'و 3' وأشرطة جينية مقاومة للأدوية للاختيار الإيجابي أو السلبي ، فإن كفاءة KI التقليدية ل ESCs غير كافية بشكل عام ، بسبب التردد العالي للتكامل الجينومي العشوائي 8,10 ، وبالتالي ، يلزم اتباع طريقة محسنة ذات كفاءة استهداف ESC دقيقة. في الآونة الأخيرة ، أبلغنا عن طريقة ESC KI مضبوطة باستخدام تحرير الجينوم المستند إلى CRISPR / Cas9 لتحقيق كفاءة KI أعلى من طرق الاستهداف التقليدية11. تعتمد الطريقة التي نصفها هنا على هذا الإجراء الذي يمكن الحمض النووي الطويل (> عدة إلى 10 كيلو بايت) KI إلى ESCs بكفاءة مقبولة للأعمال الروتينية دون اختيار الدواء ؛ وبالتالي ، فإن إجراء بناء المتجه سيكون أسهل بكثير ويحتاج إلى فترة أقصر ، أو ستصبح فترة زراعة الخلايا أقصر بكثير.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة طوكيو (رقم الموافقة PA17-63) وجامعة أوساكا (رقم الموافقة Biken-AP-H30-01) وتم إجراؤها وفقا لإرشاداتها بالإضافة إلى إرشادات REACH (https://arriveguidelines.org).

1. استهداف بناء ناقلات

  1. تضخيم كاسيت KI (CreERT هنا ، قالب الحمض النووي ل PCR هو في الأصل من شركة تخليق الجينات التجارية) وجزء تقريبي 1 كيلو بايت من أذرع التماثل 5'- أو 3'-homology بواسطة PCR. لاستنساخ الحمض النووي (الخطوة 1.3) ، أضف تسلسلات تداخل 15 مير في نهاية 5 'من كل PCR التمهيدي. تنقية شظايا الحمض النووي PCR عن طريق الكهربائي هلام الأغاروز ، تليها استخراج جزء من الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي.
  2. خطي البلازميد الأساسي (على سبيل المثال ، pUC19 أو pBS) باستخدام إنزيم (إنزيمات) تقييد مناسب يهضم بشكل فريد في مكان ما في موقع الاستنساخ المتعدد للاستنساخ. بعد ذلك ، قم بتنقية البلازميد المهضوم باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي.
  3. استنساخ كل جزء PCR (على سبيل المثال ، ذراع التماثل 5'، ذراع التماثل 3') وتسلسل KI في وقت واحد في البلازميد المهضوم باستخدام مجموعة استنساخ الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. قم بتحويل الخلايا المختصة باستخدام البلازميد المركب (الخطوة 1.3) عن طريق التسخين عند 42 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة في حمام مائي ، ثم بذرها على طبق LB يحتوي على التركيز المناسب للمضادات الحيوية مثل الأمبيسلين أو الكانامايسين. قم بثقافتهم بين عشية وضحاها لاختيارات استنساخ المقاومة.
  5. التقط عدة مستعمرات فردية (من أربعة إلى ثمانية) باستخدام أطراف ماصة 200 ميكرولتر وانقل الأطراف إلى 3 مل من LB السائل الذي يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (100 ميكروغرام / مل أمبيسلين أو 20 ميكرولتر / مل كاناميسين) واستزرع طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الهز.
  6. قم بتنقية البلازميد في اليوم التالي باستخدام مجموعة تنقية البلازميد التجارية الخالية من السموم الداخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتأكيد التسلسل المستنسخ في البلازميد بواسطة تسلسل سانجر. اضبط تركيز البلازميد عند 1 ميكروغرام من الحمض النووي / ميكرولتر باستخدام الماء الخالي من النيوكلياز. استخدم البلازميد كناقل لاستهداف الجينات.

2. تحضير الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEF) كخلايا مغذية ل ESC

  1. التضحية بإناث الفئران الحامل ICR البالغة من العمر 8-10 أسابيع (14.5 يوما بعد الجماع) عن طريق خلع عنق الرحم. امسح البطن جيدا باستخدام 70٪ (v / v) من الإيثانول للتعقيم ، وقطع البطن باستخدام مقص وملقط مداري ، واستعادة الرحم المحتوي على الجنين.
  2. ضع الرحم في طبق 100 مم يحتوي على 10 مل من مصل الأبقار الفوسفاتية (PBS) يحتوي على 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. إزالة المشيمة والأنسجة خارج الجنين من الأجنة باستخدام المقص المداري والملقط. فرم الأجنة باستخدام مقص مداري ونقل محلول PBS الذي يحتوي على خلايا الجنين المفروم إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  3. جهاز طرد مركزي عند 280 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط. أضف 10 مل من محلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ (وزن / حجم) ، واخلطه جيدا عن طريق السحب ، ثم احتضنه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي لهضم التربسين.
  4. أضف 20 مل من وسط MEF (يحتوي DMEM على 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين) لإيقاف التفاعل الأنزيمي ، واخلطه جيدا عن طريق الانقلاب اللطيف ، وأجهزة الطرد المركزي عند 280 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط ، وأضف 10 مل من وسط MEF ، واخلطها جيدا عن طريق السحب.
  5. بذر معلق الخلية في عدة أطباق جديدة 100 مم (قم بإعداد نفس عدد الأطباق مثل عدد الأجنة مع 10 مل من وسط MEF لطبق واحد 100 مم). قم بتغيير الوسط بعد 4 إلى 5 ساعات من البذر لإزالة الخلايا غير المرتبطة واترك MEF المرفق ينمو. تمرير الخلايا عندما تصل إلى ~ 80٪ التقاء باستخدام التربسين.
  6. ضع أطباق الاستزراع التي تحتوي على MEF المتكاثر في وسط MEF ، بعد حوالي 12-15 يوما من البذر ، في جهاز تشعيع بالأشعة السينية. فضح MEF بأشعة سينية 50 Gy (إجمالا) لإيقاف دورة الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  7. قم بالتريبسين MEF المشعع بإضافة 2 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA لطبق واحد 100 مم لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، ثم أضف 4 مل من وسط MEF لإيقاف هضم التربسين وجمع معلق الخلية في أنبوب جديد سعة 50 مل.
  8. اغسل MEF بوسط MEF جديد عن طريق الطرد المركزي عند 280 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واحسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا مع تلطيخ التريبان الأزرق ، وقم بتجميدها عند 1.6 × 106 خلايا / أنبوب في وسط تجميد الخلية. تخزين حتى الاستخدام ؛ يمكن تخزين الخلايا بثبات في النيتروجين السائل لعدة سنوات.

3. إعداد خليط Cas9-RNP-DNA

  1. قم بإذابة tracrRNA و crisprRNA في محلول التخفيف (كل تركيز RNA عند 200 ميكرومتر) عن طريق سحب العينات. امزج محلول tracrRNA ومحلول crisprRNA ومخزن التخفيف (نسبة الحجم عند 2: 2: 5) عن طريق النقر اللطيف وتلدين كل RNA باستخدام دورة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق متبوعة بدورات تنحي 1 درجة مئوية / دقيقة حتى تصل درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تم تصميم تسلسل gRNA باستخدام كريسبر، http://crispor.tefor.net.
  2. احتضان الحمض النووي الريبي الملدن ، 10 ميكروغرام / ميكرولتر من نواة Cas9 ، ومخزن التثقيب الكهربائي المخلوط بنسبة حجم 5: 3: 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتشكيل مركب Cas9-RNP. في العمل الروتيني ، امزج واحتضان 1.25 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الملدن ، و 0.75 ميكرولتر من نوكلياز Cas9 ، و 0.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي لتحرير جينوم موضع واحد.
  3. امزج المواد التالية في أنبوب سعة 1.5 مل: 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي ، و 1 ميكرولتر من مركب Cas9-RNP (الخطوة 3.2) ، و 1 ميكرولتر من ناقل الاستهداف الدائري (1 ميكروغرام / ميكرولتر ، الخطوة 1.6). الكمية الإجمالية لخليط Cas9-RNP-DNA هي 12 ميكرولتر. احتفظ بخليط Cas9-RNP-DNA على الجليد حتى التثقيب الكهربائي.
    ملاحظة: لمنع إعادة انشقاق gRNA بعد KI ، صمم gRNA في موضع يتم فيه تقسيم تسلسل التعرف على gRNA عن طريق تكامل مانح KI. إذا تعذر تصميم gRNA في مثل هذا الموقع ، يتم تضمين العديد من طفرات النوكليوتيدات الصامتة ، والتي لا يتغير بها تسلسل الأحماض الأمينية ، في بلازميد مانح KI.

4. الاستهداف الجيني ل ESCs

  1. لتحضير أطباق زراعة الخلايا المغلفة بالجيلاتين ، أضف محلول الجيلاتين 0.1٪ (وزن / حجم) عند 2 مل لطبق 60 مم ، و 500 ميكرولتر للوحة 24 بئرا ، و 100 ميكرولتر للوحة 96 بئرا ، واحتضان لمدة 2 ساعة في حاضنة رطبة. قم بإزالة محلول الجيلاتين ، واغسله مرتين بنفس الكمية من PBS ، واحفظه في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
  2. قم بإذابة مخزون MEF المجمد المعطل انقساميا (الخطوة 2.2) باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، وضع MEF على طبق 60 مم مغطى بالجيلاتين (أنبوب مخزون مجمد من MEF يحتوي على 1.6 × 106 خلايا لطبقين 60 مم ، الخطوة 2.2) قبل يوم واحد من بذر ESC.
  3. قم بإذابة أنبوب مخزون ESC مجمد (مخزن في 2 × 10 5 ESCs / أنبوب ؛ تم إجراء عد الخلايا باستخدام عداد خلية) باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، وضع 1 × 105 ESCs على طبق 60 مم يحتوي على MEF المصنف مسبقا (الخطوة 4.1).
  4. الاستزراع في وسط استزراع ESC سعة 4 مل (ESCM ، وسط معدل قائم على DMEM مع 15٪ (v / v) مصل بقري جنيني ، 2 mM L- جلوتامين ركيزة ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 0.1 مللي مول 2-ميركابتوإيثانول ، عامل مثبط لسرطان الدم ، و t2i (0.2 ميكرومتر PD0325901 و 3 ميكرومتر CHIR99021) الذي يحافظ على تعدد قدرة ESC11) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى يصل ESC إلى 50٪ إلى 70٪ التقاء.
    ملاحظة: نستخدم ثلاثة أسطر مختلفة من ESC: JM8. A3 من B6N ، V6.5 من B6-129 F1 ، و BALB / c ESC المطور داخليا. تستخدم نفس بروتوكولات KI في هذه المخطوطة لجميع خطوط ESC.
  5. اغسل ESC المزروع ب 4 مل من PBS ، ثم عالج ب 800 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية للهضم. أضف 1 مل من ESCM لتعطيل التربسين وفصل ESCs إلى خلايا مفردة عن طريق سحب العينات.
  6. قم بالطرد المركزي للمحلول المحتوي على ESC لمدة 5 دقائق عند 280 × جم ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق ESCs في 1 مل جديد من ESCM ، واحسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا مع تلطيخ التريبان الأزرق. انقل 1 × 10 5 ESCs إلى أنبوب جديد سعة1.5 مل واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم ، 4 درجات مئوية.
  7. أعد تعليق حبيبات ESC في 12 ميكرولتر من خليط Cas9-RNP-DNA (الخطوة 3.3) واخلطها جيدا عن طريق السحب اللطيف لتجنب الفقاعات. خدمة ESC المعاد تعليقه للتثقيب الكهربائي. يستخدم نظام التثقيب الكهربائي نبضة واحدة عند 1400 فولت و 30 مللي ثانية لنقل Cas9-RNP-DNA (الشكل 1).
  8. قم بزراعة ESCs المثقوبة بالكهرباء في طبق 60 مم يحتوي على 4 مل من ESCM مع MEF المعطل إموتويا (القسم 4.2). تغيير الوسيط كل يوم.
  9. اغسل ESCs ب 4 مل من PBS بعد 3 إلى 5 أيام من التثقيب الكهربائي ، ثم عالج ب 800 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين-EDTA واستزرع عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في حاضنة رطبة للهضم. أضف 2 مل من ESCM لإيقاف هضم التربسين والطرد المركزي لخليط الخلية عند 280 × جم لمدة 5 دقائق.
  10. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق ESCs في 1 مل من ESCM الطازج ، واحسب تركيز الخلية باستخدام عداد خلية مع تلطيخ تريبان الأزرق. قم بتمرير ESCs بمعدل 1 × 103 ESCs لكل طبق 60 مم يحتوي على ESCM ووحدة التغذية MEF. قم بتغيير الوسيط كل يوم حتى تلتقط المستعمرة.
    ملاحظة: كان سبب تمرير ESC مرة واحدة قبل الالتقاط هو أن تحرير الجينوم قد يستمر في الحدوث بعد انقسام ESC ، وبالتالي فإن المستعمرة الأولى ليست دائما هي المستنسخة في كثير من الحالات. لذلك ، فإن الممر الأول من ESC قبل التقاط المستعمرة هو خطوة أساسية لالتقاط الحيوانات المستنسخة الفردية.

5. التنميط الجيني PCR ل ESCs المستهدفة

  1. نضح ESCM من طبق ثقافة ESC بعد 5 إلى 7 أيام من المقطع الأول (الخطوة 4.9) وأضف 4 مل من PBS. التقط مستعمرات ESC مفردة مع 5 ميكرولتر من PBS باستخدام ماصة 20 ميكرولتر تحت مجهر مجسم (تكبير 30x إلى 40x). ضع المستعمرات الفردية في بئر من صفيحة مستديرة القاع مكونة من 96 بئرا تحتوي على 15 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪.
  2. احتفظ بلوحة 96 بئرا على الجليد حتى يتم التقاط 48 مستعمرة فردية. احتضان لوحة 96 بئر لمدة 5 دقائق في حاضنة 37 درجة مئوية رطبة 5٪ CO2 ، ثم أضف 80 ميكرولتر من ESCM لوقف هضم التربسين وفصل مستعمرات ESC إلى خلايا مفردة عن طريق سحب العينات.
    ملاحظة: نظرا لأن كفاءة KI لهذه الطريقة عادة ما تكون 10٪ -50٪ ، فإننا نلتقط بشكل روتيني 48 نسخة ونجري التنميط الجيني أولا باستخدام 24 منها. إذا تعذر الحصول على العديد من استنساخ KI في هذه المرحلة ، فإننا نقوم بفحص KI باستخدام المستنسخات ال 24 المتبقية.
  3. انقل 40 ميكرولتر من تعليق ESC (الخطوة 5) إلى لوحة 96 بئرا خالية من الجيلاتين وخالية من الجيلاتين تحتوي على 50 ميكرولتر من ESCM لكل بئر للتنميط الجيني PCR. انقل ال 60 ميكرولتر المتبقية من معلق ESC إلى بئر في لوحة 24 بئرا مغلفة بالجيلاتين ، والتي تحتوي على 500 ميكرولتر من ESCM ووحدة التغذية MEF ، لصنع مخزون ESC المجمد.
  4. قم بتخزين استنساخ ESC الفردي المستزرع في لوحة 24 بئرا (الخطوة 5.3) حتى تصل إلى 60٪ إلى 80٪ من التقاء. استرجع استنساخ ESC الفردي عن طريق التربسين كما هو مذكور أعلاه ، واجمع الخلايا في أنبوب جديد سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي بسرعة 280 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من وسط تجميد الخلايا ، وقم بتجميدها باستخدام الفريزر العميق -80 درجة مئوية.
  5. بالنسبة للتنميط الجيني لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم استنساخ ESC المستنبتة في اللوحة الخالية من التغذية المكونة من 96 بئرا (الخطوة 5.3) حتى يصل ESC إلى أكثر من 90٪ من التقاء. قم بإزالة ESCM من كل بئر عن طريق الشفط واغسله مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من PBS.
  6. قم بشفط PBS وأضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل الذي يحتوي على بروتيناز K ، واخلطه جيدا ، وانقل محلول ESC إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. سخني محللة ESC عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل باستخدام غرفة حرارية. استخراج وتنقية الحمض النووي الجينومي باستخدام طريقة تنقية الحمض النووي الفينول كلوروفورم التقليدية تليها ترسيب الإيثانول.
  7. إذابة الحمض النووي المترسب في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase وتحديد نقاء وتركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الجينومي باستخدام مجموعات أولية خاصة بالموقع لتضخيم المنطقة المستهدفة. بعد ذلك ، تحقق من التسلسل واختر نسخ ESC بتسلسلات KI المطلوبة.

6. تحضير الجنين المكون من ثماني خلايا والحقن المجهري ل ESCs

  1. حقن 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحوامل (PMSG) داخل الصفاق في إناث ICR البالغة. بعد 48 ساعة ، حقن 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية (hCG) في نفس الإناث ، ثم تزاوج الإناث المعالجة بالهرمونات مع ذكور ICR. تحقق من السدادة الجماعية في المهبل في اليوم التالي (اليوم الجنيني 0.5 ، ED0.5).
    ملاحظة: لتقييم الخيمرية حسب نسب لون المعطف ، استخدم الكيسة الأريمية من سلالة ICR كمتلقي ل ESC الذي يحتوي على خلفية ملونة باللون الأسود أو agouti ، أو الكيسة الأريمية من سلالة C57BL / 6 كمتلقي ل ESC الذي يحتوي على خلفية ألبينو.
  2. اجمع قناة البيض عند ED1.5 وضعها في قطرات HEPES المتوسطة المخزنة (FHM). استرجع الأجنة المكونة من خليتين أو أربع خلايا عن طريق شطف قناة البيض باستخدام FHM باستخدام إبرة التنظيف التي يتم إدخالها في infundibulum.
  3. اغسل الأجنة المجمعة عن طريق نقلها إلى عدة قطرات FHM جديدة باستخدام ماصة الفم. تتساقط الأجنة في 50 ميكرولتر من KSOM على طبق زراعة خلايا 35 مم مغطى بالزيت المعدني عند 37 درجة مئوية ، حاضنة 5٪ CO2 لمدة يوم واحد حتى يتم الوصول إلى مرحلة الخلايا الثماني أو التوتية (ED2.5).
  4. إذا لم يتم استخدام الأجنة في يوم الجمع التالي ، فقم بتجميدها عن طريق التزجيج وفقا لبروتوكول CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) ، وقم بتخزينها في النيتروجين السائل حتى الاستخدام.
  5. تحضير ماصات زجاجية لحمل الأجنة (قطر خارجي 80-100 ميكرومتر) وحقن ESC (قطر حوالي 13 ميكرومتر) باستخدام مجتذب وميكروفورج.
  6. قم بدمج ماصة قابضة تحتوي على FHM في حامل شعري متصل بحاقن دقيق ويتم إعداده على الجانب الأيسر من المعالج الدقيق. قم بتوصيل ماصة الحقن بحاقن دقيق آخر وقم بإعداده على الجانب الأيمن. قم بمحاذاة الماصتين بشكل مستقيم في مجال رؤية المجهر.
  7. قم بتوزيع 5 قطرات ميكرولتر من 12٪ (وزن / حجم) بولي فينيل بيروليدون (PVP) في وسط FHM و 5 ميكرولتر قطرات من FHM على نفس غطاء طبق 60 مم جنبا إلى جنب وقم بتغطية القطرات بالزيت المعدني. نقل الأجنة في قطرة FHM 5 ميكرولتر وإضافة 1-5 ميكرولتر من معلق ESC إلى قطرة FHM التي تحتوي على أجنة.
    ملاحظة: اترك تعليق ESC و MEF لمدة 30 دقيقة في ESM سعة 4 مل على طبق استزراع 60 مم قبل تحضير السقوط. نظرا لأن MEFs تلتصق بالقاع بشكل أسرع من ESCs ، فإن هذه الحضانة التي تستغرق 30 دقيقة تسمح بتركيز الخلايا الجذعية الجنينية غير المرتبطة في المادة الطافية.
  8. اغسل داخل ماصة الحقن باستخدام PVP ، ثم انتقل إلى القطرة التي تحتوي على الأجنة و ESCs.
  9. التقط ثلاث ثنائيات ECS فردية أنهت للتو انقسام الخلايا (ست خلايا) في ماصة الحقن. امسك جنينا مكونا من ثماني خلايا أو مرحلة التوتية ، والذي أكمل الضغط ، مع ماصة التثبيت عن طريق الشفط. اصنع ثقبا في المنطقة الشفافة بنبضة كهرضغطية (الشدة: 3 ؛ السرعة: 3). طرد ESC ذو الخلايا الست داخل المنطقة pellucida واسحب الماصة من الأجنة.
  10. اغسل الأجنة المحقونة ب ESC بعدة قطرات KSOM بلطف باستخدام ماصة الفم واحتضانها في قطرة KSOM جديدة 50 ميكرولتر مغطاة بالزيت المعدني عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 حتى تتطور الأجنة إلى مرحلة الكيسة الأريمية.
  11. نقل 10 أكياس أريمية محقونة ب ESC إلى كل قرن رحمي من إناث الفئران الكاذبة (2.5 يوم بعد الجماع ، 20 كيس أريمي لكل رأس).
  12. بعد ولادة الأم البديلة ، حدد ما لا يقل عن اثنين من الوهم الذكور مع أعلى نسبة خيمرية (70 ٪ أو أعلى كما يؤكده لون المعطف) ، ثم تزاوج مع الإناث سلالة مناسبة للحصول على F1 KI متغاير الزيجوت.
  13. قم بتربية فئران KI الفردية مع الشركاء المناسبين للحصول على الفئران ذات النمط (الأنماط) الجينية المرغوبة أو الخلفيات الجينية المناسبة للبحث.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد استهدفنا جينا (جينات) محددة في ESC متبوعا بإنتاج الوهم لتطوير إنتاج الفئران المتلاعب بالجينات وفقا لمخطوطتنا السابقة11. يتم تنفيذ التنميط الجيني ESC (الموصوف في القسم 4) بشكل روتيني بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات. تم تصميم البادئات على التسلسلات الجينومية خارج أذرع التماثل والتسلسلات المحددة في جزء الحمض النووي KI (الشكل 2 أ). في هذه الحالة ، لا يتم تضخيم أي أليل من النوع البري ، في حين يتم اكتشاف amplicon PCR بحجم معين فقط عندما يكون الحمض النووي الخارجي المستهدف هو KI في الموضع المستهدف. تظهر نتائج التنميط الجيني التمثيلي PCR في الشكل 2B. أظهرت تسعة من أصل 22 نسخة (40.9٪) نطاقا خاصا ب KI في هذه الحالة. ويبين الجدول 1 ثلاث نتائج استهداف تمثيلية، بما في ذلك النتيجة المبينة في الشكل 2. تشير هذه النتائج إلى أن الطريقة الموضحة هنا فعالة وقابلة للتكرار للجين KI دون أي اختيارات دوائية.

يتم التقاط ESC في ماصة حقن ، ثم يتم عمل ثقب في المنطقة pellucida باستخدام زائد كهرضغطية ، ويتم تحرير ESC بين الخلايا الجنينية (الشكل 3). من الناحية الفنية ، يشبه هذا البروتوكول لحقن ESC في جنين من ثماني خلايا أو مرحلة التمثال بروتوكول حقن ESC في الكيسة الأريمية المستخدمة عادة في العديد من مرافق الفئران. الفئران الخيمرية التمثيلية موضحة في الشكل 4. لتقييم لون المعطف للخيمرية ، تم استخدام الجنين من سلالة ICR (ألبينو ، شعر أبيض) كمتلقي ل B6 أو B6-129 F1 ESC ، وتم استخدام أجنة B6 كمتلقي ل BALB / c ESCs (الشكل 4).

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لدمج البلازميد الدائري بوساطة كريسبر / كاس9 للبروتين النووي الريبي (RNP) في الموضع المحدد لجينوم ESC. يقدم التثقيب الكهربائي بلازميد دائري كناقل استهداف في ESCs مع Cas9-RNP. الاختصارات: GOI = الجين محل الاهتمام ، HA = ذراع التماثل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تحليلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الجينومي لفحص KI لاستنساخ ESC المستهدف. (أ) تم تصميم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة ب KI على تسلسلات جينومية خارج أذرع التماثل (إلى الأمام) وفي التسلسلات المحددة في جزء الحمض النووي KI (عكسي). (ب) التنميط الجيني التمثيلي لنتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم استخدام جينوم من النوع البري كعنصر تحكم سلبي. الاختصارات: GOI = الجين محل الاهتمام ، HA = ذراع التماثل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: صور تمثيلية لحقن الأجنة في ثماني مراحل. (أ) بالنسبة للحقن المجهري، يتم التقاط ثلاثة أضعاف من الخلايا الجذعية الجنينية (ست خلايا، رؤوس سهام). (ب) يحدث ثقب في المنطقة الشفافة بنبضة كهرضغطية، وتطرد الخلايا الجذعية الجنكهروبية بين كل بلاستومير. شريط المقياس الموضح هو 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: صور تمثيلية للفئران الوهمية . (أ ، ب) ESC مشتق من C57BL / 6N (JM8. A3 ، شعر أغوتي. أ) أو B6-129 F1 (شعر Agouti ؛ ب) يتم حقنها في أجنة ICR (ألبينو ، شعر أبيض) ، تليها نقل الأجنة إلى بدائل الأم. (ج) يتم حقن ESC المشتق من BALB / c (ألبينو ، شعر أبيض) في أجنة C57BL / 6J (الشعر الأسود) ، يليه نقل الأجنة إلى بدائل الأم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

معرف المشروعالمشيميةطول 5'HA (bp)طول 3'HA (bp)حجم الإدراج (bp)عدد الحيوانات المستنسخة التي تم تحليلهاعدد استنساخ KIالكفاءة (٪)ملاحظات
R26-CC*سي آر 6965100653212328.7%-
R4-03*سي آر 81000997307022627.3%-
ف٤-٠١*سي آر 1510001000256922940.9%كما هو موضح في الشكل 2

الجدول 1: كفاءات KI في ثلاثة مواقع جينومية مستقلة في ESC. * لم يتم نشر هذه المشاريع حتى الآن. سيتم الكشف عن اسم هذه الجينات في مخطوطات مستقلة في المستقبل.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام الاستهداف الجيني ل ESCs متبوعا بإنتاج الوهم تقليديا لتطوير الفئران التي يتم التلاعب بها بالجينات. ومع ذلك ، لا تزال كفاءة الضربة القاضية للجينات منخفضة على الرغم من أن ناقل الاستهداف يحتوي على أذرع تماثلية طويلة (> عدة كيلوبايت في المعتاد) مع أشرطة جينية إيجابية أو سلبية لاختيار الدواء. قدم بروتوكولنا طريقة ESC KI مضبوطة للحمض النووي الخارجي الطويل باستخدام بلازميد دائري بدون أي أشرطة اختيار الدواء كناقل استهداف مصحوب بتحرير الجينوم بوساطة Cas9-RNP بكفاءة مقبولة للأعمال الروتينية. وبالتالي ، يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في تقليل مقدار الوقت المستغرق في إنتاج الفئران الخيمرية المعدلة وراثيا بشكل كبير مقارنة باستهداف ESC التقليدي.

في هذا البروتوكول ، استخدمنا CRISPR / Cas9-RNP للحث على فواصل مزدوجة الشريط خاصة بالموقع في الجينوم ، وتم استخدام بلازميد دائري كناقل استهداف بدلا من ناقل خطي. تستخدم البلازميدات الخطية تقليديا كناقل مستهدف للجين KI بسبب كفاءتها المتزايدة في التكامل الجيني8،9،10. ومع ذلك ، فإن العديد من عمليات التكامل الجينومي غير محددة على الرغم من أن المتجه يحتوي على أذرع متماثلة9. من ناحية أخرى ، نادرا ما تستخدم البلازميدات الدائرية كناقلات مستهدفة بسبب ميزتها التي يصعب دمجها في جينوم ESCs12 أو الخلايا الليفية13. وبالتالي ، سيكون من الممكن أن يؤدي تطبيق بلازميد دائري كمتجه استهداف مصحوب بتحرير الجينوم بوساطة كريسبر / كاس9 إلى تقليل التكامل العشوائي غير المحدد ولكنه يزيد من التكامل الخاص بالموقع في جينوم ESC. سيكون من الجدير بالذكر أن كفاءة الحث لكسر الشريط المزدوج بواسطة CRISPR / Cas9 مهمة جدا14 ، وبالتالي سيكون من الضروري استخدام gRNA الذي يؤدي إلى كسر حبلا مزدوج بكفاءة عالية. يجب النظر في إعادة تصميم gRNA عندما تكون كفاءة KI منخفضة للغاية. في الحالة الموضحة في الشكل 2 ، أظهرت 40.9٪ من استنساخ ESC نطاقا خاصا ب KI. في الواقع ، بصفتنا المختبر الأساسي للمعهد ، نقوم بشكل روتيني بإجراء استهداف الجينات باستخدام ESCs بالطريقة الموضحة هنا وحققنا كفاءات KI بنسبة 10٪ -50٪ لتسلسلات 1-2 كيلو بايت مثل Cre أو CreERT أو مراسلات الفلورسنت ، على الرغم من وجود بعض الاختلافات اعتمادا على موضع الجين. أطول تسلسل DNA لدينا بنجاح KI باستخدام هذه الطريقة هو حوالي 11.2 كيلو بايت في موضع Rosa26 ، وكانت الكفاءة 12.2٪ (خمس مستعمرات KI من أصل 41 مستعمرة تم تحليلها).

وتجدر الإشارة أيضا إلى أن هذا البروتوكول يستخدم أجنة من ثماني خلايا أو مرحلة التوتية كمتلقين للحقن المجهري ESC ولكن ليس أجنة مرحلة الكيسة الأريمية. على الرغم من أننا لم نجري تجارب مقارنة في هذه الورقة ، فقد أظهرت العديد من التقارير أن حقن ESCs في أجنة من ثماني خلايا أو مرحلة التوتية يحسن بشكل كبير من كفاءة مساهمة ESC في النسل الخيمري مقارنة بحقن ESC في الكيسات الأريمية15،16،17،18 . في الواقع ، أدت حقن ESC لخطوط ESC المختلفة ، بما في ذلك C57BL / 6 و B6-129 F1 و BALB / c ، بشكل عام إلى تطور وهم بلون معطف عالي في بعض النسل ، وليس كله (انظر الشكل 4). الحد من هذه الطريقة هو أن ESCs التي يتم حقنها في الجنين قبل الزرع لا يمكن أن تسهم دائما في الخلايا الجرثومية في الوهم19,20. يعتمد انتقال الخط الجرثومي ل ESCs على جودة كل استنساخ ESC19. لذلك ، سيكون من المفيد تطوير خطوط استنساخ ESC متعددة كنسخة احتياطية لإنتاج الماوس الخيمري المستقر. في الختام ، تستخدم البروتوكولات المعروضة هنا ناقلات استهداف بسيطة تشمل فقط كل ذراع تماثل وجين مهم ل KI بدون أي كاسيت مقاوم للأدوية. لذلك ، سيكون بناء المتجه أسهل بكثير ، ويمكن تقصير فترة الاستزراع مقارنة بتقنية استهداف ESC التقليدية. وهذا من شأنه أن يساعد في إنتاج أنواع مختلفة من الفئران المعدلة وراثيا بسرعة وتسهيل للتحليل المستقبلي في علوم الحياة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ساكي نيشيوكا من جامعة أوساكا ، أبحاث وتطوير التكنولوجيا الحيوية (منظمة غير ربحية) ، وميو كيكوتشي وريكو ساكاموتو في معهد العلوم الطبية ، جامعة طوكيو ، على مساعدتهم الفنية الممتازة. تم دعم هذا العمل من قبل: منح وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) / الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) KAKENHI إلى MI (JP19H05750 ، JP21H05033) ، و MO (20H03162) ؛ البحث الأساسي للعلوم والتكنولوجيا التطورية (CREST) ، منحة وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية (JST) إلى MI (JPMJCR21N1) ؛ معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية إلى MI (R01HD088412) ؛ مؤسسة بيل وميليندا غيتس إلى MI (منحة استكشافات التحديات الكبرى INV-001902) ؛ ومنحة لمشروع البحث المشترك لمعهد أبحاث الأمراض الميكروبية ، جامعة أوساكا إلى MI ، و MO.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BALB / c ESC-تم تطوير ESC من سلالة BALB / c
BambankerNippon GeneticsCS-02-001وسط تجميد الخلايا. القسم 2.6 وأماكن أخرى
Cas9 Nuclease V3IDT1081059القسم 3.2 وأماكن أخرى.
CHIR99021FUJIFILM Wako038-23101القسم 4.3
جزء جين CreERTGeneWizالقسم 1.1.
كريسبر-كاس9 crisprRNAIDTcrisprRNA. القسم 3.1 وأماكن أخرى.
CRISPR-Cas9 tracrRNAIDT1072534tracrRNA. القسم 3.1 وأماكن أخرى.
DMEMNacalai08458-45MEF متوسط. القسم 2.3 وفي أماكن أخرى
المخزن المؤقت المزدوجIDT1072534المخزن المؤقت لتخفيف الحمض النووي الريبي. القسم 3.1 وأماكن أخرى.
طقم استخراج FastGene Gel / PCRNippon GeneticsFG-91302القسم 1.1 و 1.2.
GlutaMaxThermo Fisher35-050-061L-glutatime الركيزة
hCGASKA قسم صحة6.1.
طقم استنساخ In-Fusion HDClontech639648مجموعة استنساخ الحمض النووي. القسم 1.3 وأماكن أخرى
JM8. تم تطوير A3 ESCEuMMCR-ESCمن سلالة C57BL / 6N
Knock-out DMEMThermo Fisher10829018القسم 4.3 وأماكن أخرى ، وسيط تجاري معدل قائم على DMEM.
KSOMMerckMR-121-Dالقسم 6.3 و 6.9.
عامل مثبط لسرطان الدمFUJIFILM Wako125-05603القسم 4.3. لا يتم توفير أي بيانات عن تركيز الوحدة من قبل المزود. استخدم التخفيف بمقدار 1,000 ضعف في هذا البروتوكول.
نظام التثقيب الكهربائي النيونThermo FisherMPK5000القسم 3.2 ، 4.5 وأماكن أخرى. يحتوي النظام على مخزن مؤقت للتثقيب الكهربائي كما هو مستخدم أيضا في القسم 3.2.
NucleoSpin البلازميد من الدرجة تعداءTakaraU0490Bالقسم 1.6.
PD0325901FUJIFILM Wako162-25291القسم 4.3
PMSGASKA قسم صحة6.1.
عازلة تحلل الذيلNacalai06169-95القسم 5.5.
Trypsin-EDTANacalai32777-15القسم 2.2 وأماكن أخرى
V6.5 ESC-B6J-129 F1
HitachiMBR-1618R-BEالقسم 2.6.
ESC تم تطويره من جهاز تشعيع الأشعة السينية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  3. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  4. Oji, A., et al. CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice. Scientific Reports. 6, 31666(2016).
  5. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755(2015).
  6. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nature Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  7. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  8. Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336 (6197), 348-352 (1988).
  9. Johnson, R. S., et al. Targeting of nonexpressed genes in embryonic stem cells via homologous recombination. Science. 245 (4923), 1234-1236 (1989).
  10. Hasty, P., Ramires-Solis, R., Krumlauf, R., Bradley, A. Introduction of a subtle mutation into the Hox-2.6 locus in embryonic stem cells. Nature. 350 (6315), 243-246 (1991).
  11. Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. Gene targeting in mouse embryonic stem cells via CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) mediated genome editing. Genome Editing in Animals - Methods and Protocols 2nd edition. Hatada, I. , (2022).
  12. Yagi, M., et al. Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation. Nature. 548 (7666), 224-227 (2017).
  13. Gassmann, M., Donoho, G., Berg, P. Maintenance of an extrachromosomal plasmid vector in mouse embryonic stem cells. Proceedings of National Academy of Sciences. 92 (5), 1292-1296 (1995).
  14. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322 (5903), 949-953 (2008).
  15. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  16. Hu, M., et al. Efficient production of chimeric mice from embryonic stem cells injected into 4- to 8-cell and blastocyst embryos. Journal of Animal Science and Biotechnology. 4 (1), 1-7 (2013).
  17. Guo, J., et al. Contribution of Mouse Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Chimeras through Injection and Coculture of Embryos. Stem Cells International. 2014, 409021(2014).
  18. Bodai, Z., Bishop, A. L., Gantz, V. M., Komor, A. C. Targeting double-strand break indel byproducts with secondary guide RNAs improves Cas9 HDR-mediated genome editing efficiencies. Nature Communications. 13 (1), 2351(2022).
  19. Kobayashi, T., Goto, T., Oikawa, M., Sanbo, M., Yoshida, F., Terada, R., Niizeki, N., Kajitani, N., Kazuki, K., Kazuki, Y., Hochi, S., Nakauchi, H., Surani, A., Hirabayashi, M. Blastocyst complementation using Prdm14-deficient rats enables efficient germline transmission and generation of functional mouse spermatids in rats. Nature Communications. 12 (1), 1328(2021).
  20. Miura, K., Matoba, S., Hirose, M., Ogura, A. Generation of chimeric mice with spermatozoa fully derived from embryonic stem cells using a triple-target CRISPR method for Nanos3. Biology of Reproduction. 104 (1), 223-233 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Cas9Gene TargetingEmbryonic Stem CellsGene Knock InMouse ModelsGenome EditingElectroporationPCR GenotypingChimera MiceCell Culture

Related Articles