إنشاء مكتبة عرض الببتيد AAV والتحقق اللاحق من خلال الترميز الشريطي للمرشحين ذوي الخصائص الجديدة لإنشاء الجيل التالي من AAVs.
مقالة منهجية
إنشاء مكتبة عرض الببتيد AAV والتحقق اللاحق من خلال الترميز الشريطي للمرشحين ذوي الخصائص الجديدة لإنشاء الجيل التالي من AAVs.
تعد نواقل توصيل الجينات المشتقة من الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) واحدة من أكثر الأدوات الواعدة لعلاج الأمراض الوراثية ، ويتضح ذلك من خلال تشجيع البيانات السريرية والموافقة على العديد من العلاجات الجينية AAV. هناك سببان رئيسيان لنجاح نواقل AAV هما (i) العزل المسبق لمختلف الأنماط المصلية الفيروسية التي تحدث بشكل طبيعي مع خصائص مميزة ، و (ii) الإنشاء اللاحق لتقنيات قوية لهندستها الجزيئية وإعادة توظيفها في إنتاجية عالية. ومما يعزز إمكانات هذه التقنيات مؤخرا استراتيجيات تم تنفيذها لترميز قفيصات AAV مختارة على مستوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، مما يسمح بتقسيمها الطبقي الشامل والمتوازي في الجسم الحي في جميع الأعضاء الرئيسية وأنواع الخلايا في واحد. هنا ، نقدم خط أنابيب أساسي يشمل هذه المجموعة من السبل التكميلية ، باستخدام عرض الببتيد AAV لتمثيل الترسانة المتنوعة لتقنيات هندسة القفيصة المتاحة. وفقا لذلك ، نصف أولا الخطوات المحورية لإنشاء مكتبة عرض الببتيد AAV للاختيار في الجسم الحي للمرشحين ذوي الخصائص المطلوبة ، متبوعا بعرض توضيحي لكيفية ترميز متغيرات القفيصة الأكثر إثارة للاهتمام للفحص الثانوي في الجسم الحي . بعد ذلك ، نمثل منهجية إنشاء مكتبات لتسلسل الجيل التالي (NGS) ، بما في ذلك تضخيم الباركود وربط المحول ، قبل أن نختتم بنظرة عامة على الخطوات الأكثر أهمية أثناء تحليل بيانات NGS. نظرا لأن البروتوكولات المذكورة هنا متعددة الاستخدامات وقابلة للتكيف ، يمكن للباحثين تسخيرها بسهولة لإثراء متغيرات قفيصة AAV المثلى في نموذج المرض المفضل لديهم ولتطبيقات العلاج الجيني.
العلاج بنقل الجينات هو إدخال مادة وراثية في الخلايا لإصلاح المادة الوراثية الخلوية أو استبدالها أو تغييرها للوقاية من المرض أو علاجه أو علاجه أو تحسينه. يعتمد نقل الجينات ، سواء في الجسم الحي أو خارج الجسم الحي ، على أنظمة توصيل مختلفة ، غير فيروسية وفيروسية. تطورت الفيروسات بشكل طبيعي لتحويل خلاياها المستهدفة بكفاءة ويمكن استخدامها كناقلات توصيل. من بين الأنواع المختلفة من النواقل الفيروسية المستخدمة في العلاج الجيني ، تم استخدام الفيروسات المرتبطة بالغدي بشكل متزايد ، نظرا لافتقارها إلى الإمراضية والسلامة وانخفاض المناعة ، والأهم من ذلك قدرتها على الحفاظ على التعبير طويل الأجل وغير المتكامل1،2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. AAV2 عشوائي 7-مير عرض الببتيد إعداد مكتبة
ملاحظة: لإعداد مكتبة عرض الببتيد العشوائي AAV2 ، قم بتجميع قليل النيوكليوتيدات المتدهورة كحمض نووي أحادي الشريط ، وقم بتحويله إلى حمض نووي مزدوج تقطعت به السبل ، وهضمه ، وربطه بالبلازميد المستقبلة ، والكهرباء الكهربائية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إنشاء مكتبة عرض الببتيد AAV2. كخطوة أولى نحو اختيار AAVs الهندسية ، يتم وصف إنشاء مكتبة البلازميد. يتم إنتاج إدراج الببتيد باستخدام الاشعال المتحللة. إن تقليل اتحاد الكودونات في تلك من 64 إلى 20 له مزايا القضاء على كودونات التوقف وتسهيل تحليل NGS ، عن طريق تقليل تنوع المكتبة على الحمض النووي ولكن ليس مستوى البروتين. يتم شراء ملحق قليل النوكليوتيد كحمض نووي أحادي الشريط (الشكل 1) ، والذي يتم تحويله إلى حمض نووي مزدوج الشريط باستخدام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم التح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
في هذا البروتوكول ، يتم تحديد الخطوات اللازمة لعرض الببتيد هندسة قفيصة AAV ولفحص مكتبة AAV المشفرة بالباركود ، وكذلك للتحليل المعلوماتي الحيوي لتكوين المكتبة وأداء القفيصة. يركز هذا البروتوكول على الخطوات التي تسهل التحليل المعلوماتي الحيوي لهذه الأنواع من المكتبات ، لأن معظم مختبرات علم الفيروسات متخلفة في مهارات البرمجة لتتناسب مع كفاءتها في تقنيات البيولوجيا الجزيئية. تم وصف كلا النوعين من المكتبات على نطاق واسع في الأدبيات ، كما هو موضح في المقدمة ، ويمكن استنساخها بسهولة نسبية.
كخطوة أولى.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
D.G. هو أحد مؤسسي شركة AaviGen GmbH. D.G. و K.R. مخترعون في طلب براءة اختراع معلق يتعلق بتوليد متغيرات قفيصة AAV المتهربة من المناعة. بقية المؤلفين ليس لديهم ما يكشفون عنه.
تقدر D.G. تقديرا كبيرا الدعم المقدم من مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) من خلال مراكز البحوث التعاونية DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) و TRR179 (Projektnummer 272983813) ، وكذلك من قبل المركز الألماني لأبحاث العدوى (DZIF، BMBF; TTU-فيروس نقص المناعة البشرية 04.819).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| التمهيدي للتضخيم | ELLA Biotech (ميونيخ ، ألمانيا) | - | توليف الخيط الثاني لإدراج قليل النوكليوتيدات |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 5067-1504 | التحقق من صحة جزء الحمض |
| النووي Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | G2938C | التحقق من صحة جزء الحمض النووي |
| AllPrep DNA / RNA Mini المجموعة | Qiagen (Venlo ، هولندا) | 80204 | استخراج الحمض النووي / الحمض النووي |
| الريبي Agilent DNA 1000 Recodes | Agilent Technologies (سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 5067-1504 | إعداد مكتبة NGS |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | G2938C | إعداد مكتبة |
| NGS BC-seq fw: | IDT (سان جوس ، كاليفورنيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC ؛ | إعداد مكتبة NGS |
| BC-seq rv: | IDT (سان جوس ، كاليفورنيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | إعداد مكتبة NGS |
| & بيتا ؛ -Mercaptoethanol | Millipore Sigma (برلنغتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 44-420-3250ML | DNA / RNA استخراج |
| BglI | New England Biolabs (إبسويتش ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | R0143 | هضم إدراج مزدوج الشريطة |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1851196 | dd-PCR cycler |
| dNTPS & nbsp ؛ | نيو إنجلاند بيولابز (إبسويتش ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | N0447S | NGS إعداد |
| مكتبة ddPCR Supermix للمجسات (بدون dUTP) | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Droplet Generation Oil للمجسات | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1863005 | DD-PCR زيت توليد قطرات |
| DG8 خراطيش لمولد قطرات QX100 / QX200 | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1864008 | DD-PCR خرطوشة توليد قطرات |
| DG8 حامل خرطوشة | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1863051 | حامل خرطوشة dd-PCR |
| مولد قطرات DG8 طوقا | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1863009 | غطاء dd-PCR لخرطوشة |
| لوحات ddPCR 96 جيدا ، شبه التنورة | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 12001925 | DD-PCR 96-well لوحة |
| E.cloni 10G SUPREME الكهربائية خلايا | لوسيجن (ميدلتون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 60081-1 | الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية |
| كوفيت التثقيب الكهربائي ، 1 مم | Biozym Scientific (أولدندورف ، ألمانيا) | 748050 | التثقيب الكهربائي |
| GAPDH التمهيدي / مزيج المسبار | Thermo Fischer Scientific (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR التمهيدي |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1652660 | |
| النسخ العكسي عالية السعة (cDNA) عالية السعة | للأنظمة الحيوية التطبيقية (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 4368814 | النسخ العكسي (cDNA |
| ITR_fw | IDT (سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | DD-PCR التمهيدي |
| ITR_rv | IDT (سان جوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | DD-PCR التمهيدي |
| ITR_probe | IDT (سان جوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | HEX-CACTCCCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) مسبار | dd-PCR |
| Illumina NextSeq 500 نظام | Illumina Inc (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | SY-415-1001 | NGS تسلسل |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) * | Roche AG (بازل ، سويسرا) | KK2600 07958919001 | NGS عينة تحضير |
| MagnaBot 96 جهاز الفصل المغناطيسي | Promega GmbH (ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية) | V8151 | تحضير العينة لمكتبة |
| NGS مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000 | Thermo Fischer Scientific (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | ND-2000 | هضم إدراج مزدوج الشريطة |
| NGS_frw | سيجما ألدريتش (بيرلينجت ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC | NGS التمهيدي |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C NGS | التمهيدي |
| NextSeq 500/550 مجموعة عالية الإخراج (75 دورة) | Illumina Inc (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | FC-404-2005 | NGS تسلسل |
| مكتبة نظام مكتبة Ovation لمجموعة عينات منخفضة التعقيد ؛ | NuGEN Technologies، Inc. (سان كارلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 9092-256 | إعداد مكتبة NGS |
| PX1 Plate Sealer ؛ | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1814000 | dd-PCR لوحة السدادة |
| ثقب احباط ختم حراري | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1814040 | DD-PCR رقائق الختم |
| Phusion عالية الدقة DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | F530S | تخليق الخيط الثاني لإدراج قليل النوكليوتيد |
| PEI MAX - إعادة الإرسال الصف الخطي البولي إيثيلينيمين هيدروكلوريد (ميغاواط 40،000) | Polysciences، Inc. (وارينجتون ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 24765-1G | إعداد مكتبة AAV |
| تنقية ProNex Size-Selective Purification | Promega GmbH (ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية) | NG2002 | عينة تحضير لمكتبة NGS |
| Phusion Hot Start II Polymerase ؛ | ثيرمو فيشر العلمي (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | F549L | NGS |
| بروتيناز K | Roche AG (بازل ، سويسرا) | 5963117103 | استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي |
| pRep2Cap2_PIS | ناقل ITR-Rep2Cap2-ITR. موقع إدخال الببتيد داخل Cap2 ORF ، المصنوع / المعد في المختبر ؛ | ||
| مولد القطرات QX200 | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1864002 | مولد قطرات dd-PCR |
| QX200 قارئ قطرات | Bio-Rad (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 1864003 | تحليل قطرات dd-PCR |
| QIAquick Smoke Removal | Qiagen (Venlo ، هولندا) | 28306 | تخليق الخيط الثاني لتنقية إدراج قليل النوكليوتيدات |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo ، هولندا) | 28704 | تنقية ناقلات البلازميد |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo ، هولندا) | 12162 | مكتبة البلازميد تحضير الحمض النووي |
| Qiaquick PCR طقم تنقية | Qiagen (Venlo ، هولندا) | 28104 | تحضير العينة لمكتبة NGS |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) | Q32857 | إعداد مكتبة |
| NGS Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | Q32851 | إعداد مكتبة |
| NGS QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo ، هولندا) | 1044234 | TaqN qPCR |
| rep_fw | IDT (سان جوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR التمهيدي |
| rep_rv | IDT (سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | CAATCACGGCGCACATGT | DD-PCR التمهيدي |
| rep_probe | IDT (سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR مسبار |
| DNase Qiagen خال من RNase | (Venlo ، هولندا) | 79254 | استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي |
| SfiI | New England Biolabs (إبسويتش ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | R0123 | هضم النواقل |
| 5 مم ، حبات الصلب | Qiagen (فينلو ، هولندا) | 69989 | استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLA التكنولوجيا الحيوية (ميونيخ ، ألمانيا) | - | قليل النوكليوتيد المتدهور |
| T4 Ligase | New England Biolabs (إبسويتش ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | M0202L | ربط مكتبة البلازميد |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo ، هولندا) | 85600 | استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي |
| YFP_fw | IDT (سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | GAGCCACCATCTTCTTCAAG | DD-PCR التمهيدي |
| YFP_rv | IDT (سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR التمهيدي |
| YFP_probe | IDT (سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR مسبار |
| Zymo DNA Clean & المكثف -5 (المغطى) | أبحاث Zymo (إيرفين ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | D4013 | تنقية النواقل والربط |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن