تقنية عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لفحص الأدوية المثبطة للإنتغرين

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فحص عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لتحديد الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة التي تمنع تنشيط β2 integrin على العدلات البشرية.

Abstract

يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء طريقة لتحديد المضادات الجزيئية الصغيرة لتنشيط β2 integrin ، باستخدام الأجسام المضادة للإبلاغ عن التغيير المطابق وقياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية. يمكن أن تكون الطريقة أيضا بمثابة دليل لطرق الفحص الأخرى عالية الإنتاجية القائمة على الأجسام المضادة. β2 integrins هي جزيئات التصاق خاصة بالكريات البيض والتي تعتبر حاسمة في الاستجابات المناعية. تعتمد العدلات على تنشيط الإنتغرين للخروج من مجرى الدم ، ليس فقط لمكافحة العدوى ولكن أيضا للمشاركة في أمراض التهابية متعددة. يمثل التحكم في تنشيط β2 integrin نهجا قابلا للتطبيق لعلاج الأمراض الالتهابية المرتبطة بالعدلات. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام جسم مضاد وحيد النسيلة ، mAb24 ، والذي يرتبط على وجه التحديد بغطاء الرأس عالي التقارب ل β2 integrins ، لتحديد تنشيط β2 integrin على العدلات البشرية الأولية المعزولة. يستخدم N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) كحافز لتنشيط العدلات β2 integrins. تم استخدام مقياس خلوي عالي الإنتاجية قادر على تشغيل عينات صفيحة 384 بئرا تلقائيا في هذه الدراسة. يتم تقييم آثار 320 مادة كيميائية على تثبيط β2 integrin في غضون 3 ساعات. يمكن تحديد الجزيئات التي تستهدف مباشرة β2 integrins أو الجزيئات المستهدفة في مسار إشارات التنشيط من الداخل إلى الخارج الذي بدأه مستقبلات البروتين G من الداخل إلى الخارج من خلال هذا النهج.

Introduction

تتميز العديد من الأمراض الالتهابية بتسلل العدلات في موقع التورم أو الإصابة¹. للتسلل إلى هذه الأنسجة ، يجب أن تكمل العدلات سلسلة تجنيد العدلات ، والتي تنطوي على الاعتقال إلى البطانة ، والإسراف عبر جدار الوعاء الدموي ، والتجنيد في الأنسجة². تحتاج العدلات المتداولة إلى تنشيط β2 integrin لإكمال هذا الشلال ، خاصة لمرحلة الاعتقال. وبالتالي ، فإن الأدوية المثبطة للإنتغرين التي تقلل من التصاق العدلات ، والإسراف ، والتوظيف قد تعالج الأمراض الالتهابية بشكل فعال ^3,4.

تم استهداف β2 integrins للأمراض الالتهابية من قبل. تم تطوير Efalizumab ، وهو جسم مضاد وحيد النسيلة يستهدف مباشرة integrin αLβ2 ، لعلاج الصدفية⁵. ومع ذلك ، تم سحب efalizumab بسبب آثاره الجانبية القاتلة - اعتلال بيضاء الدماغ متعدد البؤر التدريجي الناتج عن إعادة تنشيط فيروس JC ^6,7. يجب أن تأخذ العلاجات الجديدة القائمة على الإنتيرين المضادة للالتهابات في الاعتبار الحفاظ على الوظائف المضادة للعدوى في كريات الدم البيضاء لتقليل الآثار الجانبية. قد تكون الآثار الجانبية لإفاليزوماب بسبب الدوران المطول للأجسام المضادة وحيدة النسيلة في مجرى الدم ، والتي يمكن أن تمنع وظائف المناعة على المدى^{الطويل 8}. أظهرت دراسة حديثة أن efalizumab يتوسط التشابك αLβ2 والاستيعاب غير المرغوب فيه ل α4 integrins ، مما يوفر تفسيرا بديلا للآثار الجانبية⁹. وبالتالي ، قد تتجنب مضادات الجزيئات الصغيرة قصيرة العمر هذه المشكلة.

يتم تقديم طريقة عالية الإنتاجية لفحص مضادات الميكروين β2 ذات الجزيئات الصغيرة باستخدام العدلات البشرية هنا. يتطلب تنشيط Β2 Integrin تغييرات توافقية في المجال الخارجي للإنتغرين للوصول إلى وزيادة تقاربه المرتبط برابطته. في نموذج شفرة التبديل المتعارف عليها ، يمتد المجال الخارجي للإنتغرين المغلق المنحني أولا إلى شكل مغلق ممتد ثم يفتح غطاء رأسه إلى تشكيل مفتوح ممتد نشط بالكامل¹⁰،¹¹،^12،13. هناك أيضا مسار بديل يبدأ من الانحناء المغلق إلى الانحناء المفتوح والممتد المفتوح ، في النهاية¹⁴،¹⁵،^16،17،^18،19. يرتبط الجسم المضاد الخاص بالتشكل mAb24 بخاتمة في المجال البشري الشبيه ب β2-I عندما يكون غطاء رأس المجال الخارجي مفتوحا²⁰،²¹،^22،23.

هنا ، يتم استخدام mAb24-APC لتحديد ما إذا كان يتم تنشيط β2 integrins. لتنشيط العدلات والانتغرين ، يتم استخدام N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) ، وهو ببتيد كيميائي قصير مشتق من البكتيريا يمكنه تنشيط العدلات β2 integrins²⁴ ، كحافز في هذا البروتوكول. عندما يرتبط fMLP ب Fpr1 على العدلات ، يتم تنشيط شلالات إشارات المصب التي تتضمن بروتينات G و phospholipase Cβ و phosphoinositide 3-kinase γ. تؤدي أحداث الإشارة هذه في النهاية إلى تنشيط integrin عبر مسار الإشارات من الداخل إلى الخارج^18,25. إلى جانب مضادات الجزيئات الصغيرة التي ترتبط مباشرة ب β2 integrins وتمنع التغيرات التوافقية لتنشيط integrin²⁶ ، سيتم أيضا اكتشاف المركبات التي يمكن أن تمنع المكونات في مسار إشارات التنشيط β2 integrin من الداخل إلى الخارج باستخدام هذه الطريقة. تتيح مقاييس التدفق الخلوي الآلية الفحص عالي الإنتاجية. قد لا يؤدي تحديد الخصوم الجدد إلى تعميق فهمنا لفسيولوجيا الأنتغرين فحسب ، بل يوفر أيضا نظرة ثاقبة متعدية للعلاج المضاد للالتهابات القائم على الأنتغرين.

Protocol

تم الحصول على عينات الدم الكامل الهيبارين من متبرعين أصحاء غير محددين بعد الحصول على موافقة مستنيرة ، على النحو الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية ل UConn Health ، وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي. وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الجهات المانحة. تم تطوير معايير الإدراج / الاستبعاد لهذه الدراسة بعناية لضمان ملاءمة المشاركين وتقليل المخاطر المحتملة. وتتراوح أعمار المشاركين المؤهلين بين 18 و 65 عاما، من أي عرق، ويجيدون اللغة الإنجليزية، وقادرون على تقديم موافقة مستنيرة. شمل المشاركون المستبعدون أولئك غير القادرين على تقديم موافقة مستنيرة لأنفسهم ، مثل أولئك الذين يحتاجون إلى ممثل مفوض قانونا ، والأفراد الذين تقل أعمارهم عن 18 عاما أو أكثر من 65 عاما ، والأفراد المسجونين ، والنساء الحوامل. بالإضافة إلى ذلك ، كان على المشاركين أن يكونوا خاليين من استخدام الأدوية المضادة للالتهابات والحالات الالتهابية. كانت العدوى الحالية أو الحالات الالتهابية المزمنة أو الحادة المستمرة أيضا معايير استبعاد. أخيرا ، كان الأفراد الذين لديهم تاريخ حالي أو حديث من عدوى COVID-19 غير مؤهلين للدراسة. تم تصميم هذه المعايير لضمان سلامة المشاركين وملاءمتهم مع تقليل العوامل المربكة المحتملة التي يمكن أن تؤثر على نتائج الدراسة.

1. إعداد الكواشف

1. وسط العدلات: قم بإعداد وسط العدلات بإضافة 2٪ من ألبومين المصل البشري إلى RPMI-1640 بدون الفينول الأحمر (انظر جدول المواد).
2. محلول fMLP: قم بإعداد محلول fMLP عن طريق تخفيفه 100 مرة من محلول تخزين 10 mM fMLP dimethyl sulfoxide (DMSO) (انظر جدول المواد) باستخدام RPMI 1640 بدون الفينول الأحمر ، مما ينتج عنه محلول fMLP 100 ميكرومتر.
3. محلول الأجسام المضادة: تمييع 120 ميكرولتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة المترافق mAb24 (mAb24-APC) (انظر جدول المواد) ، والذي يبلغ عن التشكل عالي التقارب ل β2 integrin ، في 10 مل من وسط العدلات ، مما يخلق محلول mAb24-APC 1.2 ميكروغرام / مل mAb24-APC.
4. المكتبة المركبة: قم بتخفيف المكتبة المركبة الأولية بتركيز 10 mM إلى 1 mM عن طريق إضافة 5 μL من مكتبة 10 mM (انظر جدول المواد) إلى 45 μL من DMSO في ألواح 384 بئر باستخدام معالج السائل. بعد ذلك ، قم بنقل 5 ميكرولتر لكل بئر من المكتبة المركبة 1 مللي متر إلى لوحة فارغة من 384 بئرا باستخدام معالج السائل.
5. كما هو موضح في الشكل 1 ، احتوت أربعة أعمدة ( 1 ، 2 ، 23 ، 24) على DMSO فقط ولكن لا تحتوي على مركبات ، تعمل كعناصر تحكم إيجابية وسلبية في الفحص. قم بتخفيف كل بئر بإضافة 45 ميكرولتر من RPMI-1640 بدون الفينول الأحمر ، مما ينتج عنه تركيز نهائي قدره 100 ميكرومتر لجميع المركبات.

2. عزل العدلات من دم الإنسان

1. باستخدام ماصة مصلية ، ضع بعناية طبقة 4 مل من الدم على 8 مل من وسط تدرج الكثافة المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل (الشكل 2 أ).
2. جهاز طرد مركزي الدم عند 550 × جم لمدة 30-50 دقيقة عند 20 درجة مئوية. إبطاء الدوار تدريجيا (عامل التباطؤ 1).
   ملاحظة: قد يختلف الفصل الناجح للعدلات (النطاق 2 في الشكل 2B) من خلايا الدم الحمراء بين المتبرعين. بالنسبة لمعظم الجهات المانحة ، يكفي الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض المانحين ، قد تكون هناك حاجة إلى 10-30 دقيقة إضافية من الطرد المركزي إذا لم ينجح الفصل (الشكل 2C).
3. قم بإزالة البلازما بعناية (السائل الأصفر في الأعلى) والخلايا أحادية النواة (الشريط الغائم العلوي ؛ شريط PBMC في الشكل 2B) باستخدام ماصة 1 مل.
4. اجمع العدلات من النطاق الغائم السفلي (شريط العدلات في الشكل 2 ب) وحوالي 3-4 مل تحت السائل الصافي في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). امزج تعليق العدلات برفق عن طريق قلبه 2-3 مرات.
5. قم بطرد مركزي التعليق عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الصب.
6. أعد تعليق الحبيبات برفق باستخدام 5 مل من PBS وطردها مركزيا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
7. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب ، وتخلص بعناية من أي مادة طافية متبقية حول فم الأنبوب وعلى جدار الأنبوب باستخدام الشفط الفراغي. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط العدلات.
8. عد أرقام الخلايا باستخدام مقياس الدم. عادة ، تم الحصول على 1 إلى 4 × 10⁷ العدلات من 8 مل من دم الإنسان.
   ملاحظة: قد يكون هناك تلوث لخلايا الدم الحمراء في تعليق العدلات. لا تؤثر خلايا الدم الحمراء بشكل كبير على معظم المقايسات ويمكن أن تمنع تنشيط / تحضير^{العدلات 27}. يجب تحليل خلايا الدم الحمراء قبل العد للحصول على تركيز دقيق للعدلات. أضف 10 ميكرولتر من معلق الخلية إلى 891 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات لمدة 10-30 ثانية لتحلل خلايا الدم الحمراء ، ثم أضف 99 ميكرولتر من 10× PBS لموازنة الضغط التناضحي ، ومنع تحلل العدلات.
9. اضبط كثافة الخلية على 6.25 × 10⁵ خلايا / مل عن طريق إضافة وسط العدلات.

3. تحضير لوحة 384 بئر

1. في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، ادمج 1 مل من محلول الأجسام المضادة (1.2 ميكروغرام / مل mAb24-APC) مع 0.2 مل من وسط العدلات لإنشاء محلول mAb24-APC 1 ميكروغرام / مل. ثم أضف 25 ميكرولتر من هذا الخليط إلى آبار التحكم السلبية في صفيحة 384 بئرا (الآبار الزرقاء في الشكل 1).
2. في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، امزج 9 مل من محلول الجسم المضاد مع 21.6 ميكرولتر من محلول fMLP (100 ميكرومتر) و 1.7784 مل من وسط العدلات لإنشاء محلول يحتوي على 1 ميكروغرام / مل mAb24-APC و 200 نانومتر fMLP. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من هذا الخليط إلى آبار التحكم والاختبار الإيجابية في صفيحة 384 بئرا (الآبار الحمراء والزرقاء في الشكل 1).
3. انقل 5 ميكرولتر من المحاليل المركبة 100 ميكرومتر من لوحة المكتبة المركبة إلى لوحة 384 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات.
4. أجهزة الطرد المركزي السائل لمدة 1 دقيقة في 500 × غرام ، في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: بالنسبة لألواح الطرد المركزي ، يلزم وجود دوار دلو متأرجح وجرافات لوحة.

4. علاج الخلايا

1. أضف 20 ميكرولتر من معلق العدلات إلى كل بئر باستخدام ماصة ذات 16 قناة (نطاق 5-50 ميكرولتر ، لكل عمود من لوحة 384 بئر). امزج بلطف 5-10 مرات باستخدام الماصة ، مع الحفاظ على فاصل زمني ثابت بين كل ماصة.
   ملاحظة: التركيزات النهائية في الآبار هي كما يلي: العدلات 2.5 × 10⁵ خلايا / مل (جميع الآبار) ؛ mAb24-APC 0.5 ميكروغرام / مل (جميع الآبار) ؛ fMLP 100 نانومتر (آبار التحكم والاختبار الإيجابية) ؛ المركبات 10 ميكرومتر (اختبار الآبار).
2. احتضن اللوحة على شاكر عند 300 دورة في الدقيقة ، في درجة حرارة الغرفة (RT) ، لمدة 10 دقائق.
3. قم بإصلاح الخلايا بإضافة 3 ميكرولتر من 16٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى كل بئر باستخدام ماصة ذات 16 قناة (تركيز PFA النهائي ~ 0.91٪). ثم احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: يوصى بالحفاظ على فاصل زمني ثابت بين الأعمدة المختلفة عند إضافة العدلات و PFA. هذا يضمن أن العدلات في كل بئر لها نفس وقت الحضانة مع fMLP و mAb24-APC.

5. قياس التدفق الخلوي

1. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد) ، وتأكد من تشغيل الكمبيوتر المتصل بالجهاز أيضا.
2. تأكد من ملء حاوية سائل الغمد ، وأن حاوية النفايات فارغة ومتصلة بشكل صحيح بالجهاز.
3. قم بتحميل لوحة 384 بئرا على محمل العينة الخاص بمقياس التدفق الخلوي. تأكد من محاذاة بئر A1 للوحة مع علامة A1 الموجودة على اللودر.
4. افتح البرنامج وأنشئ تجربة جديدة. حدد 384 جيدا واختر الفلوروفورات المطلوبة. بعد ذلك ، انقر فوق إعداد اللوحة ، واسحب لتحديد جميع الآبار ، ثم انقر فوق عينة. قم بتشغيل مفتاح "الإنتاجية العالية" ، وحدد مرتفع ضمن لوحة المعدل.
   1. في مربع مستوى الصوت، أدخل 50. حدد عينات في أعمدة ذات أرقام فردية ثم قم بتنشيط مفتاح "التحريض". أخيرا ، قم بتسمية العينات في اللوحة اليمنى.
5. انقر فوق مؤامرة وبوابة. ثم ، انقر فوق الزر "تطبيق" (سهمان على دائرة مملوءة باللون الأخضر) ، وبعد ذلك ، انقر فوق زر التشغيل (شكل مثلث). انتظر بضع ثوان لمراقبة بعض الخلايا من البئر الأول ، ثم انقر فوق زر الإيقاف المؤقت .
   1. اضبط الفولتية FSC و SSC لضمان التصور المناسب للخلايا على قطعة الأرض. انقر فوق اكتساب ، ثم انقر فوق زر التشغيل (شكل مثلث) لبدء الفحص.
6. سيقوم مقياس التدفق الخلوي بأخذ عينات بالتتابع ~ 50 ميكرولتر من 1000-3000 عدلة من كل بئر. سوف يستغرق الأمر حوالي 3 ساعات لإكمال اللوحة المكونة من 384 بئرا بالكامل.
7. بعد الانتهاء من جميع العينات ، قم بتصدير ملفات .fcs للخطوة التالية.

6. تحليل البيانات

1. افتح برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد). حدد المجلد الذي يحتوي على جميع ملفات .fcs واسحبه إلى نافذة البرنامج ، ثم حرره لاستيراد البيانات إلى البرنامج.
2. انقر نقرا مزدوجا فوق عينة واحدة ، بوابة العدلات المفردة بناء على FSC و SSC²⁸،²⁹،³⁰ في النافذة المنبثقة ^، كما هو موضح في الشكل 3. حدد الصفوف المسورة واسحبها إلى المجلد ، ثم حررها لتطبيق البوابات على جميع العينات الموجودة في هذا المجلد.
3. حساب وتصدير متوسط كثافة مضان APC (MFI) للعدلات من كل بئر باستخدام وظيفة محرر الجدول الخاصة بالبرنامج. انقر فوق إضافة عمود ضمن علامة التبويب تحرير . حدد الوسيط في علامة التبويب إحصائية ، واختر العدلات السكانية المسورة ، وحدد APC كمعلمة. انقر فوق الزر "موافق ".
4. ارجع إلى علامة التبويب "محرر الجدول" ، وحدد جميع العينات في علامة التبويب "تجميع" ، واضغط على زر إنشاء جدول . ستظهر نافذة جديدة تعرض الجدول الذي تم إنشاؤه. احفظه كملف نصي أو ملف CSV أو Excel.
5. افتح الجدول المصدر ، واحسب متوسط القيمة والانحراف المعياري ل APC MFI لعينات التحكم الإيجابية والسلبية (الشكل 4).
6. احسب عامل Z'-factor (Z') للوحة باستخدام المعادلة:
   Z' = 1 - 3 (σ p + σ n) / (μ_p - μ_n) ،
   حيث σ p و σ n هما الانحرافات المعيارية للضوابط الإيجابية والسلبية ، على التوالي ، و μ_p و μ_n هما وسائل الضوابط الإيجابية والسلبية ،^{على التوالي 31}.
   ملاحظة: يشير العامل Z إلى فصل توزيعات التحكم الموجبة والسالبة. Z 'من 0 تعني عدم وجود فصل ، بينما يشير Z' من 0.5 إلى فصل متساو. كما ذكرنا في دراسة سابقة³¹ ، يشير Z '> 0.5 إلى اختبار ممتاز للفحص المركب. A Z 'في نطاق 0.5 إلى 0 مقبول ، لكنه قد يحدد فقط النتائج القوية في الفحص ، الأمر الذي سيتطلب مزيدا من التحقق في المقايسات الثانوية.
7. اعتبر المركبات "ضربات" للفحص عندما يكون APC MFI للعدلات المعالجة بالمركبات أقل من ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري ل MFI للتحكم الإيجابي مطروحا من MFI للتحكم الإيجابي (P = 0.0013 ، ممثلة بالخط المنقط في الشكل 4).

Results

كشفت البيانات المأخوذة من فحص لوحة 384 بئرا تمثيليا (الشكل 4) أن الضوابط السلبية تحتوي على MFI من mAb24-APC من 3236 ± 110 ، بينما كان للضوابط الإيجابية MFI من mAb24-APC من 7588 ± 858. يبلغ عامل Z لهذه اللوحة حوالي 0.33 ، وهو ضمن نطاق مقبول³¹. ومع ذلك ، يتطلب Z مزيدا من التحقق في المقايسات الثانوية.

لتطبيع البيانات ، تم تغيير حجم جميع القيم لتعيين قيمة قصوى تبلغ 1 للمتوسط الموجب وقيمة دنيا تبلغ 0 للمتوسط السالب. سيخضع عامل Z للتحقق من الصحة بشكل أكثر صرامة في المقايسات الثانوية. تم تعيين الحد الأقصى لهذه اللوحة عند 0.41 ، مما يعني أن العينات ذات MFI النسبي أقل من 0.41 ستعتبر ضربات تثبط تنشيط β2 integrin الناجم عن fMLP في العدلات البشرية. لم يتم التعرف على أي ضربات من هذه اللوحة.

لتأكيد فعالية البروتوكول ، تم استخدام Nexinhib20 ، الذي يثبط تنشيط β2 integrin عن طريق استعداء وظيفة Rac-1 ، و lifitegrast ، الذي يعادي integrin αLβ2 مباشرة^32,33. ومع ذلك ، تم تعديل أوقات الحضانة إلى ساعة واحدة ل Nexinhib20 ونصف ساعة ل lifitegrast. تمت تسوية البيانات الناتجة من هذه التجارب باستخدام نفس طريقة القياس الموضحة أعلاه. ثم تم دمج نقاط البيانات هذه مع نتائج اللوحة وتحليلها بشكل جماعي (الشكل 4).

الشكل 1: تخطيط اللوحة للغربلة المركبة. رسم تخطيطي يوضح ترتيب مركبات الغربلة وأدوات التحكم في لوحة 384 بئرا. يتم تصوير آبار التحكم السلبية باللون الأزرق (العمودين 1 و 23) ، وتظهر آبار التحكم الإيجابي باللون الأحمر (العمودين 2 و 24). يتم تمثيل آبار الاختبار باللون البيج (الأعمدة من 3 إلى 22). تشير الأسهم إلى تسلسل قراءة اللوحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: فصل العدلات باستخدام وسط تدرج الكثافة. صور تمثيلية توضح الفصل الناجح وغير الناجح للعدلات باستخدام وسط تدرج الكثافة. أ: في البداية، توضع 4 mL من الدم على 8 mL من وسط تدرج الكثافة. (ب) بعد الطرد المركزي، يجب أن يكون شريطان غائمان مرئيين: الشريط العلوي الذي يحتوي بشكل أساسي على خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) والشريط السفلي الذي يحتوي في الغالب على العدلات مع بعض خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). يتم تكوير معظم كرات الدم الحمراء في الأسفل. (ج) فصل غير ناجح حيث لا يتم تكوير كرات الدم الحمراء ، ولا يتم ملاحظة شريط العدلات. ستكون هناك حاجة إلى طرد مركزي إضافي (10-30 دقيقة) لفصل شريط العدلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: بوابات العدلات باستخدام مخططات FSC / SSC. مخططات التشتت الأمامي التمثيلي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) التي توضح استراتيجية البوابات لتحديد العدلات. (أ) يتم بوابات العدلات بناء على مساحة التشتت الأمامي (FSC-A) والتشتت الجانبي (SSC-A) المسجل بواسطة مقياس التدفق الخلوي. (B) يتم فتح بوابات أخرى للخلايا المفردة بناء على العرض (FSC-W) والارتفاع (FSC-H) للتشتت الأمامي ، و (C) العرض (SSC-W) والارتفاع (SSC-H) للتشتت الجانبي. يمثل مقياس اللون كثافة الخلية ، وينتقل من الأحمر إلى الأصفر والأخضر والأزرق مع انخفاض الكثافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: ينتج عن الفحص صفيحة تمثيلية مكونة من 384 بئرا. ينتج الفحص من صفيحة تمثيلية مكونة من 384 بئرا ، مما يدل على عامل Z '0.3. يشار إلى الضوابط السلبية والإيجابية بنقاط زرقاء وحمراء ، على التوالي. يتم تمثيل عينات الاختبار المعالجة بمركبات مختلفة كنقاط بيج. يمثل الخط المتقطع متوسط شدة التألق (MFI) لتحديد الضربات. لم يتم تحديد أي من المركبات المختبرة على أنها مضادات β2 integrin ، حيث أظهرت جميع المركبات المختبرة قيم MFI فوق خط القطع. يتم تجميع نتائج التجارب المستقلة التي تختبر مضادات الإنتغرين β2 المعروفة بأوقات حضانة متفاوتة (Nexinhib20 لمدة 1 ساعة ، lifitegrast لمدة نصف ساعة) للعرض في هذا الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يتم تحديد بدء وإنهاء تحفيز العدلات وتلطيخها عن طريق إضافة العدلات و PFA المثبت. لذلك ، فإن ضمان نفس الفاصل الزمني بين العدلات الماصة أو PFA في كل عمود أمر بالغ الأهمية. هذا يضمن أن وقت التحفيز وتلطيخ العدلات من كل بئر لا يزال ثابتا. نظرا لقصر عمر العدلات ، يجب إجراء التجربة بأكملها ، من جمع الدم من المتبرعين إلى إكمال قياس التدفق الخلوي ، في نفس اليوم. العدلات حساسة للغاية للتغيرات في درجات الحرارة ويمكن أن تنشط عند تعرضها لزيادات سريعة في درجات الحرارة ، مثل الانتقال من 4 درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة أو من درجة حرارة الغرفة إلى 37 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، بناء على تجربتنا السابقة ، لا يحدث تنشيط العدلات β2 entgerin الناجم عن fMLP عندما يتم تخزين الخلايا على الجليد أو عند 4 درجات مئوية (البيانات غير معروضة). لذلك ، قبل التثبيت ، يجب حفظ الدم الكامل والعدلات في درجة حرارة الغرفة أو 20 درجة مئوية (أثناء خطوة الطرد المركزي المعزولة). لا تضع الدم الكامل والعدلات على الجليد.

يجب أن يؤدي تلطيخ mAb24 في الضوابط السلبية إلى نتائج منخفضة للغاية. إذا لوحظ ارتفاع مستوى تلطيخ mAb24 في تجربة ، فيرجى التحقق مما يلي: (1) ما إذا كان هناك تغير كبير في درجة الحرارة أثناء التجربة قبل التثبيت ؛ (2) ما إذا كان هناك تلوث fMLP أو السموم الداخلية في وسط العدلات ؛ (3) ما إذا كانت معالجة العينات عدوانية للغاية ، مثل توليد الفقاعات أثناء السحب والخلط.

يستخدم البروتوكول الحالي mAb24 للإبلاغ عن افتتاح غطاء الرأس β2 integrin. من الناحية النظرية ، يمكن استخدام KIM127 ، وهو جسم مضاد وحيد النسيلة يبلغ عن امتداد β2 integrins ^34,35 ، جنبا إلى جنب مع mAb24 لتقييم شكل β2 integrin بشكل شامل. ومع ذلك ، فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء لتلطيخ KIM127 (1.5 إلى 2 أضعاف) ليست مواتية مثل نسبة mAb24 (من 5 إلى 10 أضعاف) ، والتي لا توفر عادة عامل Z مرضيا في فحص لوحة 384 بئرا. في فحص لوحة 96 بئرا ، يمكن غسل العينات قبل إجراء قياس التدفق الخلوي ، مما يقلل من إشارات الخلفية المشتقة من الأجسام المضادة القابلة للذوبان. لذلك ، يمكن إجراء الفحص المستند إلى KIM127 في مقايسة لوحة 96 بئرا ، والتي تتميز بإنتاجية أقل مقارنة بفحص لوحة 384 بئرا.

نظرا لأن هذه الطريقة تستخدم شدة التألق كقراءة لتقييم التأثير المثبط للإنتغرين للأدوية ، فقد تتداخل بعض الأدوية الفلورية مع النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأدوية السامة التي تحفز موت العدلات خلال فترة تحفيز 10 دقائق ستظهر أيضا أنها تبلغ عن تثبيط الأنتغرين. الأدوية التي تمنع تحلل العدلات ستقمع التعبير الكلي β2 integrin. سيتم أيضا تحديد مثبطات إزالة التحلل هذه في فحصنا. لذلك ، هناك حاجة إلى فحص ثانوي مع عناصر تحكم أخرى لتأكيد التأثيرات المثبطة للضربات. تتم الإشارة إلى الشاشات الثانوية كوسيلة للتحقق من صحة وتحديد آلية عمل الزيارات. بالإضافة إلى تكرار اختبارات mAb24 ، سيتم تقييم إجمالي تعبير CD18 على سطح الخلية باستخدام جسم مضاد CD18 مضاد للإنسان. سيتم تطبيع مستوى β2 integrin المنشط ، كما تم قياسه بواسطة mAb24 ، من خلال إجمالي تعبير CD18. سيمكننا هذا من تحديد ما إذا كانت آلية عمل العامل تتضمن معاداة تنشيط الأنتغرين و / أو تثبيط التعبير عن CD18 على سطح الخلية. يجب أيضا إجراء فحص الجدوى في الشاشة الثانوية لاستبعاد أي تأثيرات سامة للضربات.

هذا البروتوكول له قيود. أولا ، mAb24 قادر على اكتشاف المجال الشبيه ب β2 I فقط في الحالات التي يكون فيها الإنتغرين في حالة تقارب عالية. لذلك ، لا يمكنه تحديد α / β الخصوم الخيفية الشبيهة ب I مثل lifitegrast من خلال تقليل ارتباط mAb24. يحفز Lifitegrast المزيد من ربط mAb24³² ويظهر قيمة MFI متزايدة بشكل غير طبيعي مع mAb24 (الشكل 4). لمثل هذه القيم غير الطبيعية ، قد تكون هناك حاجة إلى فحوصات أخرى للتحقق مما إذا كانت هذه الضربات α / β الخصوم الخيفية الشبيهة ب I مثل lifitegrast. ثانيا ، عامل Z لهذا الفحص دون المستوى الأمثل ويمكن تحسينه من خلال استخدام السحب التلقائي والإثارة. لسوء الحظ ، يفتقر مختبرنا إلى المعدات اللازمة لاختبار هذه الفرضية. سيكون تكرار المقايسات أو تكرارها ثلاث مرات مفيدا في تحديد الإيجابيات والسلبيات الخاطئة في حالة تعذر تحسين عامل Z بالطرق المذكورة أعلاه. علاوة على ذلك ، قد يكون من المفيد تمديد وقت الحضانة لتحديد المزيد من الزيارات ، كما لوحظ مع مثبط تنشيط الإنتغرين β2 المعروف Nexinhib20 ، والذي يتطلب ساعة من الحضانة لإنتاج تأثيرات مثبطة. ركزت هذه الدراسة على تحديد العوامل سريعة المفعول. يجب على الباحثين ملاحظة أنه يمكنهم تعديل وقت الحضانة ليناسب احتياجاتهم الخاصة.

على حد علمنا ، هذه هي أول طريقة فحص عالية الإنتاجية لمضادات β2 integrin. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد مركبات الجزيئات الصغيرة التي ترتبط مباشرة ب β2 integrins ومنع التغيرات التوافقية التي تؤدي إلى حالات integrin متوسطة / عالية التقارب ، على غرار الخصوم بدون خصائص "ناهضة" تم وصفها مؤخرا لل integrins αIIbβ3 و α4β1²⁶. العدلات ضرورية في العديد من الأمراض الالتهابية ، مثل إصابة نقص تروية عضلة القلب³⁶ ، الإنتان 37 ، وأمراض المناعة الذاتية^38,39. قد توفر الأدوية الجزيئية الصغيرة مزيدا من المرونة في علاج هذه الأمراض مقارنة بالأدوية القائمة على الأجسام المضادة. يمكن أن توفر الزيارات من شاشتنا علاجات محتملة للأمراض الالتهابية.

الطريقة الحالية هي شاشة عالية الإنتاجية تعتمد على الأجسام المضادة الفلورية. نظرا لأن الأجسام المضادة لمراسل التنشيط متاحة أيضا ل β1 40،^41،42،43،⁴⁴ و αIIbβ3 45،46 و αL^{integrins 47}،^48،49،^{50 ،} يمكن توسيع هذه الطريقة لتحديد مضادات الانتغرينات الأخرى. تم استخدام جسم مضاد حساس للتوافق مثل HUTS-21 ، والذي يرتبط بالمجال الهجين β1 51،⁵²،⁵³ ، في شاشة عالية الإنتاجية لتحديد مضادات المستضد 4 المتأخرة جدا (VLA-4 ^، integrin α4β1)⁵⁴. يمكن أيضا تعديل طريقة الفحص الحالية وتوسيعها للعثور على الأدوية التي تمنع أو تعزز التعبير عن المستقبلات السطحية الأخرى ، مثل المركبات التي تزيد من التعبير السطحي لمنظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) على خلايا التليف الكيسي (CF). في التليف الكيسي ، تؤدي الطفرات المتعددة إلى اختلال CFTR ، مما يؤدي إلى غياب التعبير عن CFTR على غشاء الخلية⁵⁵. ثبت أن الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة تستعيد تعبير CFTR⁵⁶. بالنسبة لتعديلات البروتوكول ، من الضروري زيادة وقت حضانة الأدوية إلى عدة ساعات للسماح بحدوث تغييرات في تعبير البروتين.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ماصات 16 قناة	Thermo	4661090N	Instrument
384 بئر لوحة	Greiner	784201	المواد
APC مضادة للإنسان CD11a / CD18 (LFA-1) استنساخ الأجسام المضادة: m24	BioLegend	363410	الكواشف
Bravo   ؛ منصة معالجة السوائل الآلية	Agilent	16050-102	384 معالج السوائل متعدد القنوات
جهاز طرد مركزي	Eppendorf	موديل 5810R
Instrument FlowJo	Becton و Dickinson & amp شركة	NA	Software
Human Serum Albumin Solution (25٪)	GeminiBio	800-120	Recodes
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	الكواشف
Nexinhib20	Tocris	6089	الكواشف
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	الكواشف
Paraformaldehyde 16٪ محلول علوم	المجهر الإلكتروني	15710	دلاء لوحة الكواشف
	Eppendorf	UL155
شاكر لوحة الملحقات	فيشر	88-861-023	أداة
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (1114683 السابقة)	الكواشف
مركبة المكتبة الكيميائية Prestwick (10 ملم)	مكتبات بريستويك الكيميائية	Ver19_384	1520 جزيئا صغيرا ، 98٪ من الأدوية المعتمدة المسوقة (وافقت إدارة الغذاء والدواء والوكالة الأوروبية لإدارة الغذاء والدواء والوكالة الأوروبية لإدارة الطوارئ (إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA و EMA و JAN ووكالات أخرى معتمدة)
	RPMI 1640 متوسط ، بدون كواشف جيبكو	11-835-030
دوار دلو التأرجح	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 محلل الخلايا	Bio-Rad Laboratories	نموذج ZE5	Instrument