Method Article

توصيف سلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض المشتقة من مزارع Oreochromis spp. باستخدام تسلسل الجينوم الكامل

DOI:

10.3791/64404

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدت جدوى استراتيجيات تسلسل الجينوم الكامل (WGS) باستخدام أدوات الطاولة إلى تبسيط استجواب الجينوم لكل ميكروب ذي صلة بالصحة العامة في بيئة معملية. يتم وصف التكيف المنهجي لسير العمل ل WGS البكتيرية كما يتم تقديم خط أنابيب المعلوماتية الحيوية للتحليل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتبر الاستزراع المائي أحد أسرع قطاعات إنتاج الأغذية نموا في جميع أنحاء العالم، ويشكل استزراع البلطي (Oreochromis spp.) الصنف الرئيسي من أسماك المياه العذبة المستزرعة. نظرا لأن ممارسات تربية الأحياء المائية عرضة للتلوث الميكروبي المستمد من مصادر بشرية المنشأ ، فإن هناك حاجة إلى استخدام المضادات الحيوية على نطاق واسع ، مما يؤدي إلى أن تصبح أنظمة تربية الأحياء المائية مصدرا مهما للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية والمسببة للأمراض ذات الأهمية السريرية مثل الإشريكية القولونية (E. coli). هنا ، تم توضيح مقاومة مضادات الميكروبات ، والفوعة ، وخصائص mobilome لسلالة E. coli المسببة للأمراض ، المستردة من Oreochromis spp. المستزرعة الداخلية ، من خلال تسلسل الجينوم الكامل (WGS) وفي تحليل السيليكو . تم إجراء اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) و WGS. علاوة على ذلك ، تم تحديد المجموعة التطورية ، والنمط المصلي ، وكتابة التسلسل متعدد المواضع (MLST) ، ومقاومة مضادات الميكروبات المكتسبة ، والفوعة ، والبلازميد ، ومحتوى البروفاج باستخدام أدوات الويب المتنوعة المتاحة. أظهرت الإشريكية القولونية المعزولة فقط قابلية متوسطة للأمبيسيلين وتم وصفها بأنها سلالة ONT: H21-B1-ST40 من خلال الكتابة القائمة على WGS. على الرغم من اكتشاف جين واحد فقط مرتبط بمقاومة مضادات الميكروبات [mdf (A)] ، فقد تم تحديد العديد من الجينات المرتبطة بالفوعة (VAGs) من النمط المرضي المعوي اللانمطي للإشريكية القولونية (aEPEC). بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن شحنة من replicons البلازميد من مجموعات البلازميد الكبيرة و 18 منطقة مرتبطة بالبروفاج. وفي الختام، فإن توصيف WGS لعزلة aEPEC، التي تم استردادها من مزرعة سمكية في سينالوا، المكسيك، يسمح بإلقاء نظرة ثاقبة على إمكاناتها المسببة للأمراض والمخاطر المحتملة على صحة الإنسان لاستهلاك منتجات تربية الأحياء المائية الخام. من الضروري استغلال تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) لدراسة الكائنات الحية الدقيقة البيئية واعتماد إطار صحي واحد لمعرفة كيفية نشوء القضايا الصحية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد تربية الأحياء المائية واحدة من أسرع قطاعات إنتاج الأغذية نموا في جميع أنحاء العالم ، وتهدف ممارسات إنتاجها إلى تلبية الطلب المتزايد على الغذاء للاستهلاك البشري. تضاعف الإنتاج العالمي لتربية الأحياء المائية ثلاث مرات من 34 مليون طن في عام 1997 إلى 112 مليون طن في عام 20171. كانت مجموعات الأنواع الرئيسية ، التي ساهمت في ما يقرب من 75 ٪ من الإنتاج ، هي الأعشاب البحرية ، والكارب ، وذوات الصدفتين ، وسمك السلور ، والبلطي (Oreochromis spp.) 1. ومع ذلك ، فإن ظهور الأمراض التي تسببها الكيانات الميكروبية أمر لا مفر منه بسبب الاستزراع السمكي المكثف ، مما يؤدي إلى خسائر اقتصادية محتملة2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم انتشال سلالة الإشريكية القولونية ACM5 عن طريق معالجة واستزراع عينة الأسماك لتحديد القولونيات البرازية (FC)12. أثناء أخذ عينات الأسماك ، لم تظهر على الأسماك علامات سريرية للمرض أو العدوى البكتيرية أو الفطرية ، وساد متوسط درجة حرارة 22.3 درجة مئوية. بعد العزل ، خضعت عزلة الإشريكية القولونية لاختبارات كيميائية حيوية وحفظها بالتبريد في مرق ضخ قلب الدماغ (BHI) مع DMSO (8٪ v / v) كعامل وقائي بالتبريد.

1. إعادة تنشيط ثقافة مخزون الإشريكية القولونية ACM5 المجمدة

  1. من المخزون البكتيري المجمد ، افتح الأنبوب واستخدم حلقة معقمة أو طرف ماصة أو عود أسنان لكشط سطح الثقا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحديد حساسية مضادات الميكروبات من خلال طريقة انتشار القرص وتفسيرها من خلال معايير نقطة توقف CLSI ل 12 مضادا حيويا تغطي ست فئات متميزة من مضادات الميكروبات ، أي الأمينوغليكوزيدات ، β لاكتام ، الفلوروكينولونات ، النيتروفوران ، الفينيكول ، ومضادات مسار حمض الفوليك. أظهر E. coli ACM5 حساسية لجميع المضادات الحيوية باستثناء دواء واحد β-lactam. تم اختبار أربعة أدوية β لاكتام: الأمبيسلين ، كاربينيسيلين ، سيفالوثين ، وسيفوتاكسيم. من بين هؤلاء ، تم قياس هالة تثبيط 14 ملم للأمبيسيلين. لذلك ، وفقا للفئات التفسيرية CLSI ل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة تكيفا لسير عمل WGS البكتيري باستخدام جهاز تسلسل على الطاولة وخط أنابيب للتوصيف الجيني لمتغير الإشريكية القولونية الممرض. اعتمادا على منصة التسلسل المستخدمة ، يمكن أن تختلف أوقات الاستجابة (TATs) لإجراءات المختبر الرطب (زراعة البكتيريا ، واستخراج gDNA ، وإعداد المكتبة ، والتسلسل) وتحليل التسلسل ، خاصة إذا تمت دراسة البكتيريا بطيئة النمو. وفقا لبروتوكول WGS الموصوف أعلاه ، كان TAT في غضون 4 أيام ، وهو ما يمكن مقارنته بما تنص عليه الأدبيات حاليا (<5 أيام) 34.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إلى المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في المكسيك (CONACyT باختصارها باللغة الإسبانية) لمنحة الدكتوراه الممنوحة لخوسيه أنطونيو ماغانيا-ليزاراغا [رقم 481143].

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Accublock حمام جاف رقمي صغيرLabnetD0100حمام جاف لاحتضانة الأنابيب
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881حبات مغناطيسية في محلول لتنقية مكتبة الحمض النووي
DeNovix DS-11DeNovix Inc.مقياس الطيف الضوئي UV-Vis للتحقق من جودة
الحمض النووي المستخرجة منgDNA Eppendorf0030108418أنابيب PCR سعة 1.5 مل لتجميع مكتبة الحمض النووي
DynaMag-2 MagnetInvitrogen ، Thermo Fisher Scientific12321Dرف الأنابيب الدقيقة المغناطيسي المستخدم أثناء تنقية الحمض النووي القائم على الخرز
المغناطيسي معرف Multibac سالب الجرام.البحث التشخيصي (المكسيك)PT-35أقراص المضادات الحيوية القياسية التجارية لاختبار الحساسية لمضادات الميكروبات
MiniSeq Mid Output Kit (300 دورة)IlluminaFC-420-1004كاشف كارتدريج للتسلسل المزدوج (2x150)
نظام MiniSeqIlluminaSY-420-1001التسلسل على الطاولة يستخدم لتسلسل الجيل
التالي من أجهزةالطرد المركزي MiniSpinEppendorf5452000816جهاز طرد مركزي قياسي للأنابيب مجموعة
تحضير مكتبة Nextera XT DNAكواشف IlluminaFC-131-1024لأداء مكتبات الحمض النووي للتسلسل. يتضمن الكواشف Box 1 و Box 2 ل 24 عينة
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001 ، FC-131-2002 ، FC-131-2003 ، FC-131-2004مجموعة الفهرس A ، B ، C ، D
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001التحكم في مكتبة الحمض النووي للتسلسل
الدقة LabCareAmerica51221081شاكر حمام مائي يستخدم للثقافة البكتيرية
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen ، Thermo Fisher ScientificQ33231الكواشف لمقايسة قياس الحمض النووي القائم على التألق
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogen ، Thermo Fisher ScientificQ32866Fluorometer المستخدمة في مقايسة التألق   ؛
أنابيب فحص كيوبيتInvitrogen ، Thermo Fisher ScientificQ328560.5 مل أنابيب PCR لمقايسة قياس الحمض النووي المستندة إلى التألق   ؛
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems ، Thermo Fisher ScientificA24811Thermocycler المستخدمة لتضخيم مكتبة الحمض
النووي Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900Spectophotometer المستخدمة للتعليق البكتيري في اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.D4300لاستخراج الحمض النووي الجيني (50 إعدادية)
أنابيب أداة جهاز مجموعة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Escherichia ColiWhole Genome SequencingAntimicrobial ResistanceTilapia FarmingPathogenic BacteriaNext Generation SequencingAquaculture MicrobiologyPlasmid AnalysisVirulence GenesProphage Detection

Related Articles