مقالة منهجية

توصيف سلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض المشتقة من مزارع Oreochromis spp. باستخدام تسلسل الجينوم الكامل

DOI:

10.3791/64404

⸱

ديسمبر 23, 2022

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدت جدوى استراتيجيات تسلسل الجينوم الكامل (WGS) باستخدام أدوات الطاولة إلى تبسيط استجواب الجينوم لكل ميكروب ذي صلة بالصحة العامة في بيئة معملية. يتم وصف التكيف المنهجي لسير العمل ل WGS البكتيرية كما يتم تقديم خط أنابيب المعلوماتية الحيوية للتحليل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتبر الاستزراع المائي أحد أسرع قطاعات إنتاج الأغذية نموا في جميع أنحاء العالم، ويشكل استزراع البلطي (Oreochromis spp.) الصنف الرئيسي من أسماك المياه العذبة المستزرعة. نظرا لأن ممارسات تربية الأحياء المائية عرضة للتلوث الميكروبي المستمد من مصادر بشرية المنشأ ، فإن هناك حاجة إلى استخدام المضادات الحيوية على نطاق واسع ، مما يؤدي إلى أن تصبح أنظمة تربية الأحياء المائية مصدرا مهما للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية والمسببة للأمراض ذات الأهمية السريرية مثل الإشريكية القولونية (E. coli). هنا ، تم توضيح مقاومة مضادات الميكروبات ، والفوعة ، وخصائص mobilome لسلالة E. coli المسببة للأمراض ، المستردة من Oreochromis spp. المستزرعة الداخلية ، من خلال تسلسل الجينوم الكامل (WGS) وفي تحليل السيليكو . تم إجراء اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) و WGS. علاوة على ذلك ، تم تحديد المجموعة التطورية ، والنمط المصلي ، وكتابة التسلسل متعدد المواضع (MLST) ، ومقاومة مضادات الميكروبات المكتسبة ، والفوعة ، والبلازميد ، ومحتوى البروفاج باستخدام أدوات الويب المتنوعة المتاحة. أظهرت الإشريكية القولونية المعزولة فقط قابلية متوسطة للأمبيسيلين وتم وصفها بأنها سلالة ONT: H21-B1-ST40 من خلال الكتابة القائمة على WGS. على الرغم من اكتشاف جين واحد فقط مرتبط بمقاومة مضادات الميكروبات [mdf (A)] ، فقد تم تحديد العديد من الجينات المرتبطة بالفوعة (VAGs) من النمط المرضي المعوي اللانمطي للإشريكية القولونية (aEPEC). بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن شحنة من replicons البلازميد من مجموعات البلازميد الكبيرة و 18 منطقة مرتبطة بالبروفاج. وفي الختام، فإن توصيف WGS لعزلة aEPEC، التي تم استردادها من مزرعة سمكية في سينالوا، المكسيك، يسمح بإلقاء نظرة ثاقبة على إمكاناتها المسببة للأمراض والمخاطر المحتملة على صحة الإنسان لاستهلاك منتجات تربية الأحياء المائية الخام. من الضروري استغلال تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) لدراسة الكائنات الحية الدقيقة البيئية واعتماد إطار صحي واحد لمعرفة كيفية نشوء القضايا الصحية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد تربية الأحياء المائية واحدة من أسرع قطاعات إنتاج الأغذية نموا في جميع أنحاء العالم ، وتهدف ممارسات إنتاجها إلى تلبية الطلب المتزايد على الغذاء للاستهلاك البشري. تضاعف الإنتاج العالمي لتربية الأحياء المائية ثلاث مرات من 34 مليون طن في عام 1997 إلى 112 مليون طن في عام 20171. كانت مجموعات الأنواع الرئيسية ، التي ساهمت في ما يقرب من 75 ٪ من الإنتاج ، هي الأعشاب البحرية ، والكارب ، وذوات الصدفتين ، وسمك السلور ، والبلطي (Oreochromis spp.) 1. ومع ذلك ، فإن ظهور الأمراض التي تسببها الكيانات الميكروبية أمر لا مفر منه بسبب الاستزراع السمكي المكثف ، مما يؤدي إلى خسائر اقتصادية محتملة2.

من المعروف جيدا استخدام المضادات الحيوية في ممارسات تربية الأسماك للوقاية من الالتهابات البكتيرية وعلاجها ، وهو العامل الرئيسي المحدد في الإنتاجية 3,4. ومع ذلك ، تتراكم المضادات الحيوية المتبقية في رواسب تربية الأحياء المائية والمياه ، مما يمارس ضغطا انتقائيا ويعدل المجتمعات البكتيرية المرتبطة بالأسماك والموجودة5،6،7،8. وبالتالي، فإن بيئة الاستزراع المائي تعمل كمستودع للجينات المقاومة لمضادات الميكروبات (ARGs)، وزيادة ظهور وانتشار البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية (ARB) في الوسط المحيط9. بالإضافة إلى مسببات الأمراض البكتيرية التي لوحظت عادة والتي تؤثر على ممارسات تربية الأسماك ، غالبا ما يصادف أفراد من عائلة Enterobacteriaceae ، بما في ذلك سلالات مسببات الأمراض البشرية من Enterobacter spp. ، والإشريكية القولونية ، و Klebsiella spp. ، والسالمونيلا spp.10. الإشريكية القولونية هي الكائنات الحية الدقيقة الأكثر شيوعا المعزولة من مسحوق السمك والماء في تربية الأسماك11،12،13،14،15.

الإشريكية القولونية هي بكتيريا سالبة الجرام متعددة الاستخدامات تعيش في الجهاز الهضمي للثدييات والطيور كعضو متعايش في الجراثيم المعوية. ومع ذلك ، تمتلك الإشريكية القولونية قدرة عالية على التكيف للاستعمار والاستمرار في منافذ بيئية مختلفة ، بما في ذلك التربة والرواسب والغذاء والماء16. بسبب اكتساب الجينات وفقدانها من خلال ظاهرة نقل الجينات الأفقية (HGT) ، تطورت الإشريكية القولونية بسرعة إلى ممرض مقاوم للمضادات الحيوية جيد التكيف ، وقادر على التسبب في مجموعة واسعة من الأمراض في البشر والحيوانات17,18. بناء على أصل العزلة ، يتم تعريف المتغيرات المسببة للأمراض على أنها الإشريكية القولونية المسببة للأمراض المعوية (InPEC) أو الإشريكية القولونية المسببة للأمراض خارج الأمعاء (ExPEC). علاوة على ذلك ، يتم تصنيف InPEC و ExPEC إلى أنماط مرضية محددة جيدا وفقا لمظاهر المرض والخلفية الجينية وسمات النمط الظاهري وعوامل الفوعة (VFs)16،17،19.

سمحت الثقافة التقليدية والتقنيات الجزيئية لسلالات الإشريكية القولونية المسببة للأمراض بالكشف السريع وتحديد الأنماط المرضية المختلفة. ومع ذلك ، فقد تستغرق وقتا طويلا وشاقة وتتطلب في كثير من الأحيان تدريبا تقنيا عاليا19. علاوة على ذلك ، لا يمكن استخدام طريقة واحدة لدراسة جميع المتغيرات المسببة للأمراض من الإشريكية القولونية بشكل موثوق بسبب تعقيد خلفيتها الجينية. حاليا ، تم التغلب على هذه العيوب مع ظهور تقنيات التسلسل عالي الإنتاجية (HTS). أدت مناهج تسلسل الجينوم الكامل (WGS) وأدوات المعلوماتية الحيوية إلى تحسين استكشاف الحمض النووي الميكروبي بتكلفة معقولة وعلى نطاق واسع ، مما يسهل التوصيف المتعمق للميكروبات في جولة واحدة ، بما في ذلك المتغيرات المسببة للأمراض ذات الصلة الوثيقة20،21،22. اعتمادا على الأسئلة البيولوجية ، يمكن استخدام العديد من أدوات المعلوماتية الحيوية والخوارزميات وقواعد البيانات لإجراء تحليل البيانات. على سبيل المثال ، إذا كان الهدف الرئيسي هو تقييم وجود ARGs و VFs والبلازميدات ، فقد تكون أدوات مثل ResFinder و VirulenceFinder و PlasmidFinder ، إلى جانب قواعد البيانات المرتبطة بها ، نقطة انطلاق جيدة. قدم Carriço et al.22 نظرة عامة مفصلة عن برامج المعلوماتية الحيوية المختلفة وقواعد البيانات ذات الصلة المطبقة لتحليل WGS الميكروبي ، من المعالجة المسبقة للبيانات الخام إلى الاستدلال التطوري.

أظهرت العديد من الدراسات الفائدة الواسعة ل WGS لاستجواب الجينوم فيما يتعلق بسمات مقاومة مضادات الميكروبات ، والإمكانات المسببة للأمراض ، وتتبع الظهور والعلاقات التطورية للمتغيرات ذات الصلة سريريا من الإشريكية القولونية التي يتم الحصول عليها من أصول متنوعة23،24،25،26 . وقد مكن النظام العالمي لتحليل الميكروبات من تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء مقاومة النمط الظاهري لمضادات الميكروبات، بما في ذلك آليات المقاومة النادرة أو المعقدة. هذا من خلال الكشف عن متغيرات ARG المكتسبة ، أو الطفرات الجديدة في الجينات المستهدفة للأدوية ، أو مناطق المروج27,28. علاوة على ذلك ، يوفر WGS إمكانية استنتاج ملامح مقاومة مضادات الميكروبات دون الحاجة إلى معرفة مسبقة بالنمط الظاهري للمقاومة للسلالة البكتيرية29. وبدلا من ذلك، سمح الفريق العامل بتوصيف العناصر الجينية المتنقلة التي تحمل كلا من مقاومة مضادات الميكروبات وخصائص الفوعة، مما دفع تطور الجينوم البكتيري لمسببات الأمراض الموجودة. على سبيل المثال، أدى تطبيق WGS أثناء التحقيق في فاشية الإشريكية القولونية الألمانية في عام 2011 إلى الكشف عن السمات الجينومية الفريدة للنمط المرضي الجديد على ما يبدو للإشريكية القولونية. ومن المثير للاهتمام ، أن سلالات الفاشية هذه نشأت من مجموعة الإشريكية القولونية المعوية (EAEC) ، التي اكتسبت البروفاج الذي يشفر سم الشيغا من النمط المرضيالمعوي النزفي E. coli (EHEC) 30.

يقدم هذا العمل تكيفا منهجيا لسير العمل ل WGS البكتيرية باستخدام جهاز تسلسل فوق الطاولة. علاوة على ذلك ، يتم توفير خط أنابيب المعلوماتية الحيوية باستخدام أدوات قائمة على الويب لتحليل التسلسلات الناتجة ودعم الباحثين ذوي الخبرة المحدودة أو معدومة في المعلوماتية الحيوية. سمحت الطرق الموصوفة بتوضيح مقاومة مضادات الميكروبات ، والفوعة ، وخصائص mobilome لسلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض ACM5 ، المعزولة في عام 2011 من Oreochromis spp. المستزرعة الداخلية في سينالوا ، المكسيك12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم انتشال سلالة الإشريكية القولونية ACM5 عن طريق معالجة واستزراع عينة الأسماك لتحديد القولونيات البرازية (FC)12. أثناء أخذ عينات الأسماك ، لم تظهر على الأسماك علامات سريرية للمرض أو العدوى البكتيرية أو الفطرية ، وساد متوسط درجة حرارة 22.3 درجة مئوية. بعد العزل ، خضعت عزلة الإشريكية القولونية لاختبارات كيميائية حيوية وحفظها بالتبريد في مرق ضخ قلب الدماغ (BHI) مع DMSO (8٪ v / v) كعامل وقائي بالتبريد.

1. إعادة تنشيط ثقافة مخزون الإشريكية القولونية ACM5 المجمدة

  1. من المخزون البكتيري المجمد ، افتح الأنبوب واستخدم حلقة معقمة أو طرف ماصة أو عود أسنان لكشط سطح الثقافة البكتيرية المجمدة.
  2. ضع البكتيريا على صفيحة أجار لوريا بيرتاني (LB) واحتضنها عند 37 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

2. تحديد الحساسية المضادة للبكتيريا

ملاحظة: يتوافق اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات الموصوف هنا مع طريقة انتشار القرص بناء على إرشادات معهد المعايير السريرية والمخبرية (CLSI) (M02 Ed13: 2018)31. الإشريكية القولونية مطلوب سلالة ATCC 25922 لأغراض مراقبة الجودة.

  1. إعداد اللقاح بطريقة تعليق المستعمرة
    1. من الصفيحة LB المحتضنة في الخطوة 1.2 ، قم بخط مستعمرة أو مستعمرتين على صفيحة أجار مولر-هينتون (MH) واحتضانها عند 37 ± 2 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
    2. استخدم حلقة معقمة لاختيار مستعمرتين أو ثلاث مستعمرات من معزولة الإشريكية القولونية المستزرعة حديثا على صفيحة أجار MH وإعادة تعليقها في 3 مل من مرق MH المعقم أو 0.85٪ (وزن / حجم) محلول ملحي ، مع الخلط جيدا عن طريق الدوامة للحصول على تعليق بكتيري موحد.
    3. باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية (انظر جدول المواد) ، اضبط التعليق البكتيري على التعكر مقارنة بمعيار 0.5 MacFarland (أي ما يعادل حوالي 1-2 × 108 خلايا / مل). إذا كان المعلق البكتيري خفيفا جدا أو ثقيلا جدا ، أضف المزيد من مستعمرات الإشريكية القولونية أو مرق MH حسب الاقتضاء. استخدم اللقاح المحضر في غضون 15 دقيقة من التحضير.
  2. تلقيح لوحات أجار الاختبار
    1. اغمس قطعة قطن معقمة في المعلق البكتيري المعدل. قم بتدوير المسحة عدة مرات واضغط عليها بقوة على الجدار الداخلي للأنبوب لإزالة السوائل الزائدة من المسحة.
    2. قم بتلقيح صفيحة أجار MH عن طريق وضع المسحة 3x على سطح الأجار بالكامل ، مع تدوير اللوحة 60 درجة في كل مرة. امسحي حافة الآجار أيضا لضمان التوزيع المتساوي للقاح.
    3. اترك غطاء طبق بتري مواربا لمدة 3-5 دقائق للسماح للرطوبة بالتبخر.
  3. تطبيق القرص المضاد للميكروبات على ألواح أجار ملقحة
    1. وزع بالتساوي واضغط على كل قرص مضاد للميكروبات (انظر جدول المواد) لأسفل على سطح ألواح الأجار الملقحة لضمان التلامس الكامل. اقلب الألواح في غضون 15 دقيقة بعد تطبيق القرص واحتضانها عند 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
      ملاحظة: يجب استخدام 12 وستة أقراص كحد أقصى في أطباق بتري مقاس 150 مم و 100 مم على التوالي.
  4. بعد الحضانة ، قم بقياس منطقة أحجام التثبيط باستخدام فرجار الورنية وتفسير الأقطار الناتجة وفقا لمعايير نقطة توقف CLSI (M100 - الجدول 2A)32.

3. استخراج الحمض النووي الجينومي (gDNA) والقياس الكمي

  1. استخراج الحمض النووي الجينومي
    1. أعد تعليق حلقة من مستعمرات الإشريكية القولونية المستزرعة حديثا في 5 مل من مرق LB واحتضانها طوال الليل في حاضنة اهتزاز (180 دورة في الدقيقة) عند 37 ± 2 درجة مئوية.
    2. جهاز طرد مركزي للمعلق البكتيري عند 3500 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص بعناية من المادة الطافية.
    3. استخرج gDNA باتباع إرشادات مجموعة استخراج الحمض النووي (انظر جدول المواد).
    4. تحقق من نقاء gDNA عن طريق قياس الكثافة البصرية عند 260/280 نانومتر (النسبة: >1.8) و 260/230 نانومتر (النسبة: 2.0-2.2) باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية. إجراء 0.8 ٪ هلام agarose الكهربائي للتحقق من سلامة gDNA.
  2. القياس الكمي للحمض النووي الجينومي
    ملاحظة: استخدم فقط أنابيب PCR رقيقة الجدار وشفافة سعة 0.5 مل معتمدة من قبل الشركة المصنعة لمجموعة فحص التألق (انظر جدول المواد).
    1. قم بإعداد العدد المطلوب من الأنابيب للعينات ومعايير الفحص. قم بإعداد حل فحص العمل عن طريق خلط المكون A والمكون B المقدمين في المجموعة ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    2. قم بإعداد معايير الفحص بإضافة 190 ميكرولتر من محلول العمل و 10 ميكرولتر من كل معيار إلى الأنبوب المناسب (يلزم وجود معيارين).
    3. أضف 198 ميكرولتر من محلول العمل و 2 ميكرولتر من عينة الحمض النووي إلى الأنبوب المناسب. تخلط بقوة عن طريق دوامة جميع الأنابيب لمدة 5 ثوان. احرص على عدم إنشاء فقاعات.
    4. احتضان جميع الأنابيب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. قم بقياس مضان جميع الأنابيب بناء على إرشادات الشركة المصنعة باستخدام مقياس الفلور (انظر جدول المواد).
    5. اضبط تركيز عينة gDNA بشكل صحيح لإجراء التسلسل.

4. إعداد مكتبة الحمض النووي

ملاحظة: تم إجراء إعداد مكتبة الحمض النووي وتسلسلها باتباع إرشادات وبروتوكولات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). تركيز gDNA الأولي هو 4.0 نانوغرام.

  1. وضع العلامات وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل والفهرسة
    1. في أنبوب سعة 0.2 مل ، أضف 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعلامات و 2 ميكرولتر من gDNA المدخلات (2.0 نانوغرام / ميكرولتر). تخلط بلطف عن طريق ماصة العين.
    2. أضف 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم واخلطه برفق عن طريق سحب العينات. تدور لأسفل في 280 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. ضع العينات في دراجة حرارية (انظر جدول المواد) وقم بتشغيل برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل التالي: 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم امسك عند 10 درجات مئوية. عندما تصل العينات إلى 10 درجات مئوية ، تابع على الفور لتحييد التفاعل.
    4. أضف 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعادل إلى أنابيب العينة واخلطها برفق عن طريق سحب العينات. تدور لأسفل في 280 × غرام لمدة 1 دقيقة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. أضف 1.7 ميكرولتر من كل محول فهرس (أي الفهارس i7 و i5) و 3 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لفهرسة PCR. تخلط بلطف عن طريق ماصة العين. تدور لأسفل في 280 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. ضع العينات في العجلة الحرارية وقم بإجراء تفاعل PCR ثان على النحو التالي: 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 18 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وعقد عند 10 درجات مئوية.
  2. تنظيف المكتبة المضخم
    1. امزج عن طريق دوامة محلول الخرزة المغناطيسية التجارية (انظر جدول المواد) بناء على إرشادات الشركة المصنعة.
    2. انقل عينة gDNA الموسومة / المفهرسة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل وأضف 0.6 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل ميكرولتر من الحجم النهائي لعينة gDNA (≈13 ميكرولتر). تخلط بلطف عن طريق السحب واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. ضع أنابيب العينة على رف مغناطيسي (انظر جدول المواد) لمدة 2 دقيقة حتى يتم مسح المادة الطافية. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية دون إزعاج الخرز.
    4. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ دون خلط. احتضان لمدة 30 ثانية حتى ينقشع الشطف وقم بإزالة المادة الطافية بعناية والتخلص منها دون إزعاج الخرز.
    5. نفذ خطوة غسيل ثانية. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى الخرز واحتضانها لمدة 30 ثانية. بعد أن ينقشع الشطف ، قم بإزالة المادة الطافية وتخلصي منها وجففيها في الهواء لمدة 10 دقائق.
    6. أضف 15 ميكرولتر من 10 مللي متر تريس عازلة (درجة الحموضة 8) إلى الخرز واخلطها برفق عن طريق السحب. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع أنابيب العينة مرة أخرى على الرف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة ، مما يسمح للطافي بالمسح.
    7. انقل بعناية 14 ميكرولتر من المادة الطافية من أنبوب العينة إلى أنبوب جديد سعة 0.2 مل. هذه هي المكتبة التي تم تنظيفها.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين المكتبة التي تم تنظيفها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.
  3. تطبيع المكتبة
    1. تابع تحديد المكتبات التي تم تنظيفها بواسطة مقايسة مضان كما هو موضح في الخطوة 3.2 ، باستثناء الخطوة 3.2.5.
    2. تصور المكتبات التي تم تنظيفها على 1٪ هلام الأغاروز الكهربائي لتحديد متوسط أحجام الشظايا.
    3. احسب القيمة المولارية للمكتبة باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-1
    4. باستخدام قيمة المولارية ، احسب الأحجام المناسبة للمخزن المؤقت لإعادة التعليق (RSB) والمكتبات التي تم تنظيفها لتخفيف المكتبة الفردية بتركيز يبدأ من 10 نانومتر.

5. تجميع المكتبة ، ونزع الطبيعة ، وبدء التسلسل

  1. قم بإذابة خرطوشة الكاشف باتباع إرشادات الشركة المصنعة. استخرج خلية التدفق من الثلاجة (4 درجات مئوية) واتركها في درجة حرارة الغرفة قبل التسلسل.
  2. قم بتجميع 5 ميكرولتر من كل مكتبة طبيعية (10 نانومتر) في أنبوب منخفض الربط سعة 1.5 مل. قم بتخفيف المكتبة المجمعة عند 4 نانومتر بالحجم المناسب من RSB.
  3. أضف 5 ميكرولتر من المكتبة المجمعة (4 نانومتر) و 5 ميكرولتر من 0.2 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم في أنبوب جديد منخفض الربط سعة 1.5 مل. امزج لفترة وجيزة عن طريق الدوامة ، وقم بتدويرها لأسفل عند 280 × جم لمدة 1 دقيقة ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتفكيك المكتبة المجمعة إلى خيوط مفردة.
  4. امزج برفق 10 ميكرولتر من المكتبة المجمعة المشوهة و 990 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين المبرد مسبقا عن طريق السحب وضعه على الثلج حتى يتم إجراء التخفيف النهائي لتحميل جهاز التسلسل. تركيز المكتبة المجمعة المشوهة هو 20 pM.
  5. قم بإذابة وإعداد مكتبة تحكم (انظر جدول المواد) بتركيز 4 نانومتر عن طريق خلط 2 ميكرولتر من مكتبة التحكم (10 نانومتر) و 3 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
  6. امزج 5 ميكرولتر من مكتبة التحكم (4 نانومتر) و 5 ميكرولتر من 0.2 N NaOH الطازج. امزج لفترة وجيزة عن طريق الدوامة ، وقم بتدويرها لأسفل عند 280 × جم لمدة 1 دقيقة ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحويل مكتبة التحكم إلى خيوط مفردة.
  7. امزج برفق 10 ميكرولتر من مكتبة التحكم المشوهة و 990 ميكرولتر من مخزن التهجين المبرد مسبقا عن طريق السحب وضعه على الثلج حتى يتم التخفيف النهائي لتحميل جهاز التسلسل. تركيز مكتبة التحكم المشوهة هو 20 pM.
  8. في أنبوب جديد منخفض الربط سعة 1.5 مل ، اجمع 594 ميكرولتر من المكتبة المجمعة المشوهة عند 20 دقيقة و 6 ميكرولتر من مكتبة التحكم المشوهة عند 20 دقيقة. تخلط بشكل صحيح.
  9. قم بتخفيف مزيج المكتبة النهائي (20 pM) إلى تركيز تحميل نهائي يبلغ 1.2 pM في حجم 600 μL باستخدام مخزن التهجين المبرد مسبقا.
  10. قبل تحميل مزيج المكتبة النهائي على خرطوشة الكاشف ، قم بإجراء معالجة حرارية إضافية لتحقيق تحميل فعال في خلية التدفق. احتضان مزيج المكتبة النهائي لمدة 2 دقيقة عند 96 درجة مئوية. اقلب الأنبوب للخلط ، وضع الأنبوب على الثلج لمدة 5 دقائق.
  11. قم بتحميل 500 ميكرولتر من مزيج المكتبة النهائي في الخزان المصمم على خرطوشة الكاشف. ابدأ التسلسل باتباع الإرشادات. قم بتحميل خلية التدفق وخرطوشة الكاشف وقم بإعداد تشغيل التسلسل.

6. تحليل بيانات التسلسل

ملاحظة: تحقق من الملف التكميلي 1 للحصول على مزيد من الوصف للمعالجة المسبقة لبيانات WGS العامة ، والبرامج ، وإعدادات المعلمات ، وتحليل تسلسل جينوم الإشريكية القولونية .

  1. اتصل بخادم بيانات التسلسل وقم بتنزيل ملفات FASTQ.
  2. قم بتقييم الجودة الأولية لبيانات التسلسل الأولية باستخدام برنامج تابع لجهة خارجية. قم بإزالة تسلسلات المحول المتبقية والقواعد منخفضة الجودة (الملف التكميلي 1).
  3. قم بتجميع بيانات التسلسل التي تم التحقق من جودتها في مستوى contig أو scaffold باستخدام برنامج تابع لجهة خارجية (انظر الملف التكميلي 1).
  4. قم بإجراء تعليق توضيحي للجينوم عن طريق إرسال ملف FASTA الذي يحتوي على الجينوم المجمع إلى خادم RAST (https://rast.nmpdr.org/).
  5. قم بتحميل ملف FASTA إلى منصات الويب الخاصة بمركز علم الأوبئة الجينومية (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) و ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) لتحديد السمات الوبائية و ARGs و VAGs والبلازميدات (انظر الملف التكميلي 1).
  6. قم بتحميل ملف FASTA إلى خادم PHASTER لتحديد تسلسلات النبوءة (https://phaster.ca/).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحديد حساسية مضادات الميكروبات من خلال طريقة انتشار القرص وتفسيرها من خلال معايير نقطة توقف CLSI ل 12 مضادا حيويا تغطي ست فئات متميزة من مضادات الميكروبات ، أي الأمينوغليكوزيدات ، β لاكتام ، الفلوروكينولونات ، النيتروفوران ، الفينيكول ، ومضادات مسار حمض الفوليك. أظهر E. coli ACM5 حساسية لجميع المضادات الحيوية باستثناء دواء واحد β-lactam. تم اختبار أربعة أدوية β لاكتام: الأمبيسلين ، كاربينيسيلين ، سيفالوثين ، وسيفوتاكسيم. من بين هؤلاء ، تم قياس هالة تثبيط 14 ملم للأمبيسيلين. لذلك ، وفقا للفئات التفسيرية CLSI ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة تكيفا لسير عمل WGS البكتيري باستخدام جهاز تسلسل على الطاولة وخط أنابيب للتوصيف الجيني لمتغير الإشريكية القولونية الممرض. اعتمادا على منصة التسلسل المستخدمة ، يمكن أن تختلف أوقات الاستجابة (TATs) لإجراءات المختبر الرطب (زراعة البكتيريا ، واستخراج gDNA ، وإعداد المكتبة ، والتسلسل) وتحليل التسلسل ، خاصة إذا تمت دراسة البكتيريا بطيئة النمو. وفقا لبروتوكول WGS الموصوف أعلاه ، كان TAT في غضون 4 أيام ، وهو ما يمكن مقارنته بما تنص عليه الأدبيات حاليا (<5 أيام) 34.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إلى المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في المكسيك (CONACyT باختصارها باللغة الإسبانية) لمنحة الدكتوراه الممنوحة لخوسيه أنطونيو ماغانيا-ليزاراغا [رقم 481143].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Accublock حمام جاف رقمي صغيرLabnetD0100حمام جاف لاحتضانة الأنابيب
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881حبات مغناطيسية في محلول لتنقية مكتبة الحمض النووي
DeNovix DS-11DeNovix Inc.مقياس الطيف الضوئي UV-Vis للتحقق من جودة
الحمض النووي المستخرجة منgDNA Eppendorf0030108418أنابيب PCR سعة 1.5 مل لتجميع مكتبة الحمض النووي
DynaMag-2 MagnetInvitrogen ، Thermo Fisher Scientific12321Dرف الأنابيب الدقيقة المغناطيسي المستخدم أثناء تنقية الحمض النووي القائم على الخرز
المغناطيسي معرف Multibac سالب الجرام.البحث التشخيصي (المكسيك)PT-35أقراص المضادات الحيوية القياسية التجارية لاختبار الحساسية لمضادات الميكروبات
MiniSeq Mid Output Kit (300 دورة)IlluminaFC-420-1004كاشف كارتدريج للتسلسل المزدوج (2x150)
نظام MiniSeqIlluminaSY-420-1001التسلسل على الطاولة يستخدم لتسلسل الجيل
التالي من أجهزةالطرد المركزي MiniSpinEppendorf5452000816جهاز طرد مركزي قياسي للأنابيب مجموعة
تحضير مكتبة Nextera XT DNAكواشف IlluminaFC-131-1024لأداء مكتبات الحمض النووي للتسلسل. يتضمن الكواشف Box 1 و Box 2 ل 24 عينة
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001 ، FC-131-2002 ، FC-131-2003 ، FC-131-2004مجموعة الفهرس A ، B ، C ، D
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001التحكم في مكتبة الحمض النووي للتسلسل
الدقة LabCareAmerica51221081شاكر حمام مائي يستخدم للثقافة البكتيرية
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen ، Thermo Fisher ScientificQ33231الكواشف لمقايسة قياس الحمض النووي القائم على التألق
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogen ، Thermo Fisher ScientificQ32866Fluorometer المستخدمة في مقايسة التألق   ؛
أنابيب فحص كيوبيتInvitrogen ، Thermo Fisher ScientificQ328560.5 مل أنابيب PCR لمقايسة قياس الحمض النووي المستندة إلى التألق   ؛
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems ، Thermo Fisher ScientificA24811Thermocycler المستخدمة لتضخيم مكتبة الحمض
النووي Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900Spectophotometer المستخدمة للتعليق البكتيري في اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.D4300لاستخراج الحمض النووي الجيني (50 إعدادية)
أنابيب أداة جهاز مجموعة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160(2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854(2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173(2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626(2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128(2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653(2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136(2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782(2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662(2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437(2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957(2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204(2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23(2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38(2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

الوسوم

Antimicrobial ResistanceTilapia FarmingPathogenic BacteriaNext Generation SequencingAquaculture MicrobiologyPlasmid AnalysisVirulence GenesProphage Detection

مقالات ذات صلة