إن قدرة البكتيريا على نقل الحمض النووي بين الخلايا البكتيرية تجعلها أدوات فعالة للتلاعب الجيني بمضيفيها البكتيريين. تظهر هنا منهجية لتحريض واستعادة واستخدام φBB-1 ، وهي بكتيريا من Borrelia burgdorferi ، لتحويل الحمض النووي غير المتجانس بين سلالات مختلفة من مرض لايم spirochete.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التلاعب الجيني بوساطة العاثيات لمرض لايم Spirochete Borrelia burgdorferi
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم إنجاز إدخال الحمض النووي الأجنبي في اللولبية Borrelia burgdorferi بشكل حصري تقريبا عن طريق التحويل باستخدام التثقيب الكهربائي. هذه العملية لها كفاءة أقل بشكل ملحوظ في مرض لايم spirochete مقارنة بالبكتيريا الأخرى سالبة الجرام ذات الخصائص الأفضل. يعتمد معدل نجاح التحول بشكل كبير على وجود كميات مركزة من الحمض النووي عالي الجودة من خلفيات محددة ويخضع لتباين كبير من سلالة إلى سلالة. يمكن أن تكون الوسائل البديلة لإدخال الحمض النووي الأجنبي (أي ناقلات المكوك ، ومراسلي الفلورسنت ، وعلامات مقاومة المضادات الحيوية) في B. burgdorferi إضافة مهمة إلى تسليح الأدوات المفيدة للتلاعب الجيني لمرض لايم spirochete. تم التعرف على البكتيريا جيدا كآليات طبيعية لحركة الحمض النووي بين البكتيريا في عملية تسمى النقل. في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة لاستخدام العاثية البورلية في كل مكان φBB-1 لتحويل الحمض النووي بين خلايا B. burgdorferi من نفس الخلفيات الجينية والمختلفة. يتضمن الحمض النووي المحول كلا من الحمض النووي المحول والحمض النووي غير المتجانس في شكل نواقل مكوكية صغيرة. يشير هذا العرض التوضيحي إلى استخدام محتمل للنقل بوساطة العاثيات كمكمل للتثقيب الكهربائي للتلاعب الجيني لمرض لايم spirochete. يصف هذا التقرير طرق تحريض وتنقية العاثية φBB-1 من B. burgdorferi ، واستخدام هذه العاثية في مقايسات النقل ، واختيار وفحص المحولات المحتملة.
المقدمة
أضاف تطوير أدوات للتلاعب الجيني للبكتيريا اللولبية Borrelia burgdorferi قيمة لا حصر لها لفهم طبيعة مرض لايم1،2،3،4. يحتوي B. burgdorferi على جينوم معقد بشكل غير عادي يتكون من كروموسوم خطي صغير وبلازميدات خطية ودائرية 5,6. أدى فقدان البلازميد التلقائي ، وإعادة الترتيب داخل الجينات (حركة الجينات من بلازميد إلى آخر داخل نفس الكائن الحي) ، ونقل الجينات الأفقي (HGT ، حركة الحمض النووي بين كائنين) إلى ظهور كمية مذهلة من عدم التجانس الجيني بين B. burgdorferi (على ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت مراجعة جميع التجارب التي تستخدم الحمض النووي المؤتلف والكائنات الحية BSL-2 والموافقة عليها من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة كوينيبياك.
1. إعداد ثقافة B. burgdorferi لإنتاج φBB-1
- تحضير وسط Barbour-Stoenner-Kelly المكمل بمصل أرنب طبيعي معطل بالحرارة بنسبة 6.6٪ (BSK)15. بالنسبة إلى 1 لتر من 1x BSK ، اجمع المكونات المدرجة في الجدول 1 في 900 مل من الماء ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.6 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم ، واخلطه ببطء عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 ساعات. بعد اكتمال الخلط ، افحص وأعد ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.6 إذا لزم الأمر ، وقم بزيادة ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمثل استخدام البكتيريا لنقل الحمض النووي بين سلالات B. burgdorferi القابلة للتحويل بسهولة أكبر أو الحيوانات المستنسخة المتمردة على التحول الكهربائي أداة أخرى للتحقيق الجزيئي المستمر لمحددات مرض لايم. يمكن تعديل مقايسة النقل الموصوفة هنا حسب الحاجة لتسهيل حركة الحمض النووي بين أي مستنسخات ذات أهمية باستخدام واحد أو اثنين من المضادات الحيوية لاختيار أجهزة نقل القناة المحتملة. تم إثبات نقل كل من الحمض النووي للتنبؤ ونواقل مكوك E. coli / B. burgdorferi غير المتجانسة بين سلالة CA-11.2A عالية المرور .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن أن يمثل استخدام النقل طريقة واحدة للتغلب على الأقل على بعض الحواجز البيولوجية والتقنية المرتبطة بالتحويل الكهربائي ل B. burgdorferi1،4،13،37. في العديد من الأنظمة ، يمكن للبكتيريا نقل الحمض النووي المضيف (غير التكهني) بين الخلايا البكتيرية إما عن طريق النقل المعمم أو المتخصص22،23،24،49<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.
شكر وتقدير
يود المؤلف أن يشكر شونا ريد ود. سكوت صامويلز وباتريك سيكور على مناقشتهم المفيدة وفاريون (بام) تشونوييراونغ على مساعدتهم التقنية. تم دعم هذا العمل من قبل قسم العلوم الطبية الحيوية ومنح أبحاث أعضاء هيئة التدريس إلى كريستيان إتش إيجرز من كلية العلوم الصحية بجامعة كوينيبياك.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وحدات تصفية 1 لتر (PES ، 0.22 ومايكرو ؛ حجم المسام م) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| أنبوب 12 مم × 75 مم (غطاء مزدوج الموضع) (بولي بروبلين) يحمل | USA Scientific | 1450-0810 | 4 مل بحجم فراغ منخفض (للحث) |
| 15 مل أنابيب طرد مركزي مخروطية (بولي بروبيلين) | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 5618-8271 | |
| 1-ميثيل -3-نيتروسو-نيتروجوانيدين (MNNG) | ميليبور سيجما | تحذير: مادة مسرطنة محتملة. لم يعد متاحا بسهولة ، ولم يتم اختبار بديل | |
| ماصات باستور 5.75 بوصة (زجاج البورسليكات القطني / غير المعقم) | الأوتوكلاف | الحراري فيشر العلمي | 13-678-8A |
| 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية (البولي بروبيلين) | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1500-1211 | |
| الإيثانول | |||
| المطلق Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| ألبومين مصل الأبقار (درجة استبدال المصل) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| Chloroform (للبيولوجيا الجزيئية) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | تحذير: عضوي متطاير ؛ استخدم فقط في غطاء الدخان الكيميائي |
| CMRL-1066 ث / س L-Glutamine (مسحوق) | الولايات المتحدة البيولوجية | C5900-01 | درجة ثقافة الخلايا |
| منتجات أبحاث الإريثروميسين | International Corp | E57000-25.0 | |
| محلول كاشف الجنتاميسين | جيبكو | 15750-060 | |
| جلوكوز (سكر العنب اللامائي ) | ثيرمو فيشر العلمي | BP350-500 | |
| HEPES | ثيرمو فيشر العلمي | BP310-500 | |
| كبريتات كاناميسين | ثيرمو فيشر العلمي | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0.22 & micro; حجم المسام M) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | لتصفية تعقيم المضادات الحيوية وغيرها من الحلول ذات الحجم الصغير |
| Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | تحذير: مادة مسرطنة محتملة ؛ استخدم فقط في غطاء الدخان الكيميائي |
| N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals، LLC | 100068 | |
| قليل النوكليوتيدات (الاشعال ل PCR) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (مجموعة الاستخراج الجيني الكلي) | G Biosciences | 786-136 | |
| Petri Dish (100 مم ومرات ؛ 15 مم) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Petroff-Hausser غرفة العد | Hausser Scientific | HS-3900 | |
| Petroff-Hausser غطاء غرفة العد زجاجي | Hausser Scientific | HS-5051 | |
| البولي إيثيلين جلايكول 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| مصل الأرانب غير معقم شباب متحلل الأثر (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | تعطيل الحرارة وفقا لتعليمات الشركة |
| المصنعة كوفيت شفاف شبه ميكرو للأشعة فوق البنفسجية | الولايات المتحدة الأمريكية Scientific | 9750-9150 | |
| بيكربونات الصوديوم | ثيرمو فيشر Scientific | BP328-500 | |
| كلوريد | الصوديومثيرمو فيشر العلمي | BP358-1 | |
| بيروفات الصوديوم | ميليبور سيجما | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | محلول كبريتات الستربتومايسين العلمي | ||
| Millipore Sigma | S6501-50G | ||
| سترات ثلاثي الصوديوم ثنائي هيدرات | Millipore Sigma | S1804-500G | سترات الصوديوم ل BSK |
المراجع
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorf....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
