يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التلاعب الجيني بوساطة العاثيات لمرض لايم Spirochete Borrelia burgdorferi

2.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64408

⸱

سبتمبر 28, 2022

1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

في هذه المقالة

ملخص

إن قدرة البكتيريا على نقل الحمض النووي بين الخلايا البكتيرية تجعلها أدوات فعالة للتلاعب الجيني بمضيفيها البكتيريين. تظهر هنا منهجية لتحريض واستعادة واستخدام φBB-1 ، وهي بكتيريا من Borrelia burgdorferi ، لتحويل الحمض النووي غير المتجانس بين سلالات مختلفة من مرض لايم spirochete.

الملخص

تم إنجاز إدخال الحمض النووي الأجنبي في اللولبية Borrelia burgdorferi بشكل حصري تقريبا عن طريق التحويل باستخدام التثقيب الكهربائي. هذه العملية لها كفاءة أقل بشكل ملحوظ في مرض لايم spirochete مقارنة بالبكتيريا الأخرى سالبة الجرام ذات الخصائص الأفضل. يعتمد معدل نجاح التحول بشكل كبير على وجود كميات مركزة من الحمض النووي عالي الجودة من خلفيات محددة ويخضع لتباين كبير من سلالة إلى سلالة. يمكن أن تكون الوسائل البديلة لإدخال الحمض النووي الأجنبي (أي ناقلات المكوك ، ومراسلي الفلورسنت ، وعلامات مقاومة المضادات الحيوية) في B. burgdorferi إضافة مهمة إلى تسليح الأدوات المفيدة للتلاعب الجيني لمرض لايم spirochete. تم التعرف على البكتيريا جيدا كآليات طبيعية لحركة الحمض النووي بين البكتيريا في عملية تسمى النقل. في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة لاستخدام العاثية البورلية في كل مكان φBB-1 لتحويل الحمض النووي بين خلايا B. burgdorferi من نفس الخلفيات الجينية والمختلفة. يتضمن الحمض النووي المحول كلا من الحمض النووي المحول والحمض النووي غير المتجانس في شكل نواقل مكوكية صغيرة. يشير هذا العرض التوضيحي إلى استخدام محتمل للنقل بوساطة العاثيات كمكمل للتثقيب الكهربائي للتلاعب الجيني لمرض لايم spirochete. يصف هذا التقرير طرق تحريض وتنقية العاثية φBB-1 من B. burgdorferi ، واستخدام هذه العاثية في مقايسات النقل ، واختيار وفحص المحولات المحتملة.

المقدمة

أضاف تطوير أدوات للتلاعب الجيني للبكتيريا اللولبية Borrelia burgdorferi قيمة لا حصر لها لفهم طبيعة مرض لايم1،2،3،4. يحتوي B. burgdorferi على جينوم معقد بشكل غير عادي يتكون من كروموسوم خطي صغير وبلازميدات خطية ودائرية 5,6. أدى فقدان البلازميد التلقائي ، وإعادة الترتيب داخل الجينات (حركة الجينات من بلازميد إلى آخر داخل نفس الكائن الحي) ، ونقل الجينات الأفقي (HGT ، حركة الحمض النووي بين كائنين) إلى ظهور كمية مذهلة من عدم التجانس الجيني بين B. burgdorferi (على سبيل المثال ، انظر Schutzer et al.7). الأنماط الجينية الناتجة (أو "السلالات") كلها أعضاء في نفس النوع ولكن لها اختلافات وراثية تؤثر على قدرتها على الانتقال إلى وإصابة مضيفات الثدييات المختلفة8،9،10،11. وفي هذا التقرير، سيستخدم مصطلح "سلالة" للإشارة إلى B. burgdorferi ذات الخلفية الجينية المشتقة طبيعيا؛ سيتم استخدام مصطلح "استنساخ" للإشارة إلى سلالة تم تعديلها وراثيا لغرض معين أو نتيجة للتلاعب التجريبي.

يتضمن صندوق الأدوات الجزيئية المتاح للاستخدام في B. burgdorferi علامات قابلة للاختيار ، ومراسلين جينيين ، ونواقل مكوكية ، وطفرات transposon ، ومروجين محرضان ، وعلامات قابلة للاختيار المضاد (للمراجعة ، انظر Drektrah and Samuels12). يتطلب الاستخدام الفعال لهذه المنهجيات الإدخال الاصطناعي للحمض النووي غير المتجانس (الأجنبي) في سلالة B. burgdorferi ذات الأهمية. في B. burgdorferi ، يتم إدخال الحمض النووي غير المتجانس بشكل حصري تقريبا عن طريق التثقيب الكهربائي ، وهي طريقة تستخدم نبضة من الكهرباء لجعل الغشاء البكتيري قابلا للنفاذ بشكل عابر لقطع صغيرة من الحمض النووي يتم إدخالها في الوسائط1. يتم قتل غالبية الخلايا (المقدرة ب ≥99.5٪) بواسطة النبض ، لكن الخلايا المتبقية لديها تردد عال للاحتفاظ بالحمض النووي غير المتجانس13. على الرغم من أنها تعتبر من بين أكثر الطرق كفاءة لإدخال الحمض النووي في البكتيريا ، إلا أن تواتر التثقيب الكهربائي في B. burgdorferi منخفض جدا (يتراوح من محول واحد في 5 × 104 إلى 5 × 106 خلايا)13. يبدو أن الحواجز التي تحول دون تحقيق ترددات أعلى للتحويل هي حواجز تقنية وبيولوجية على حد سواء. تشمل العوائق التقنية أمام التثقيب الكهربائي الناجح ل B. burgdorferi كلا من كمية الحمض النووي (>10 ميكروغرام) الضرورية ومتطلبات اللولبيات لتكون في مرحلة النمو الصحيحة تماما (منتصف السجل ، بين 2 × 10 7 خلايا · مل − 1 و 7 × 107 خلايا · مل − 1) عند تحضير الخلايا الكهربائيةالمختصة 12,13. ومع ذلك ، قد يكون التغلب على هذه الحواجز التقنية أسهل من التغلب على الحواجز البيولوجية.

يدرك باحثو مرض لايم أنه يمكن تقسيم استنساخ B. burgdorferi إلى فئتين عريضتين فيما يتعلق بقدرتها على التلاعب بها وراثيا13,14. غالبا ما تتحول العزلات عالية المرور والمتكيفة في المختبر بسهولة ولكنها عادة ما تفقد البلازميدات الضرورية للعدوى ، وتتصرف بطريقة شاذة من الناحية الفسيولوجية ، ولا يمكنها إصابة مضيف الثدييات أو الاستمرار داخل ناقل القراد12,13. في حين أن هذه الحيوانات المستنسخة كانت مفيدة لتشريح البيولوجيا الجزيئية لل spirochete داخل المختبر ، إلا أنها ذات قيمة قليلة لدراسة spirochete في السياق البيولوجي للدورة enzootic. من ناحية أخرى ، تتصرف العزلات المعدية ذات المرور المنخفض بطريقة فسيولوجية تعكس حالة معدية ويمكن أن تكمل الدورة المعدية ولكنها عادة ما تكون متمردة على إدخال الحمض النووي غير المتجانس ، وبالتالي يصعب التلاعب بها للدراسة12,13. ترتبط صعوبة تحويل عزلات الممر المنخفض بعاملين مختلفين على الأقل: (أ) غالبا ما تتجمع العزلات ذات الممر المنخفض بإحكام معا ، لا سيما في ظل الظروف عالية الكثافة المطلوبة للتثقيب الكهربائي ، وبالتالي تمنع العديد من الخلايا من التطبيق الكامل للشحنة الكهربائية أو الوصول إلى الحمض النووي في الوسائط13,15 ؛ و (ii) يشفر B. burgdorferi نظامين مختلفين على الأقل لتعديل التقييد (R-M) اللذين قد يضعان في عزلات الممر العالي14,16. تطورت أنظمة R-M للسماح للبكتيريا بالتعرف على الحمض النوويالأجنبي 17 والقضاء عليه. في الواقع ، أظهرت العديد من الدراسات في B. burgdorferi أن كفاءات التحول تزداد عندما يكون مصدر الحمض النووي هو B. burgdorferi بدلا من Escherichia coli13,16. لسوء الحظ ، فإن الحصول على التركيز العالي المطلوب من الحمض النووي للتثقيب الكهربائي من B. burgdorferi هو احتمال مكلف ويستغرق وقتا طويلا. مصدر قلق محتمل آخر عند التوصيل الكهربائي واختيار العزلات ذات المرور المنخفض هو أن العملية يبدو أنها تفضل المحولات التي فقدت البلازميد المرتبط بالفوعة الحرجة ، lp2514،18،19 ؛ وبالتالي ، فإن فعل التلاعب الجيني بعزلات B. burgdorferi ذات الممر المنخفض عن طريق التثقيب الكهربائي قد يختار الحيوانات المستنسخة غير المناسبة للتحليل ذي الصلة بيولوجيا ضمن الدورة الحيوانية20. بالنظر إلى هذه المشكلات ، فإن النظام الذي يمكن فيه تحويل الحمض النووي غير المتجانس كهربائيا إلى استنساخ B. burgdorferi عالي المرور ثم نقله إلى عزلات معدية منخفضة المرور بطريقة أخرى غير التثقيب الكهربائي يمكن أن يكون إضافة مرحب بها إلى المجموعة المتزايدة من الأدوات الجزيئية المتاحة للاستخدام في مرض لايم spirochete.

بالإضافة إلى التحول (امتصاص الحمض النووي العاري) ، هناك آليتان أخريان تأخذ من خلالهما البكتيريا بانتظام الحمض النووي غير المتجانس: الاقتران ، وهو تبادل الحمض النووي بين البكتيريا في اتصال جسدي مباشر مع بعضها البعض ، والنقل ، وهو تبادل الحمض النووي بوساطة البكتيريا21. في الواقع ، تم استخدام قدرة البكتيريا على التوسط HGT كأداة تجريبية لتشريح العمليات الجزيئية داخل عدد من الأنظمة البكتيرية22،23،24. B. burgdorferi ليست مؤهلة بشكل طبيعي لامتصاص الحمض النووي العاري ، وهناك القليل من الأدلة على أن B. burgdorferi يشفر الجهاز اللازم لتعزيز الاقتران الناجح. ومع ذلك ، فقد وصفت التقارير السابقة التحديد والتوصيف الأولي ل φBB-1 ، وهي بكتيريا معتدلة من B. burgdorferi25،26،27،28. φBB-1 حزم عائلة من 30 كيلو بايت البلازميدات الموجودة داخل B. burgdorferi25 ؛ تم تعيين أفراد هذه العائلة CP32S. تمشيا مع دور φBB-1 في المشاركة في HGT بين سلالات B. burgdorferi ، أبلغ Stevenson et al. عن وجود cp32 متطابق في سلالتين مع cp32s متباينة ، مما يشير إلى مشاركة حديثة لهذا cp32 بين هاتين السلالتين ، على الأرجح عن طريق النقل29. هناك أيضا دليل على إعادة تركيب كبيرة عبر HGT بين cp32s في جينوم مستقر نسبيا30،31،32،33. أخيرا ، تم إثبات قدرة φBB-1 على تحويل كل من cp32s والحمض النووي المتجه للمكوك غير المتجانس بين خلايا نفس السلالة وبين خلايا سلالتين مختلفتين سابقا27,28. بالنظر إلى هذه النتائج ، تم اقتراح φBB-1 كأداة أخرى يتم تطويرها لتشريح البيولوجيا الجزيئية ل B. burgdorferi.

الهدف من هذا التقرير هو تفصيل طريقة لتحفيز وتنقية العاثية φBB-1 من B. burgdorferi ، بالإضافة إلى توفير بروتوكول لإجراء اختبار نقل بين استنساخ B. burgdorferi واختيار وفحص المحولات المحتملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع التجارب التي تستخدم الحمض النووي المؤتلف والكائنات الحية BSL-2 والموافقة عليها من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة كوينيبياك.

1. إعداد ثقافة B. burgdorferi لإنتاج φBB-1

  1. تحضير وسط Barbour-Stoenner-Kelly المكمل بمصل أرنب طبيعي معطل بالحرارة بنسبة 6.6٪ (BSK)15. بالنسبة إلى 1 لتر من 1x BSK ، اجمع المكونات المدرجة في الجدول 1 في 900 مل من الماء ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.6 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم ، واخلطه ببطء عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 ساعات. بعد اكتمال الخلط ، افحص وأعد ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.6 إذا لزم الأمر ، وقم بزيادة الحجم إلى 1 لتر بالماء. تعقيم الوسط عن طريق المرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) واستخدامه طازجا أو تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ≤2 أشهر.
  2. قبل ثلاثة إلى خمسة أيام من بدء بروتوكول النقل ، قم بتلقيح 150 ميكرولتر من استنساخ (نسخ) B. burgdorferi المناسب إلى 15 مل من 1x BSK في أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة بإحكام (انظر جدول المواد). استكمل الوسط بالتركيز المناسب للمضادات الحيوية أو مجموعة من المضادات الحيوية لاختيار وصيانة الحمض النووي غير المتجانس داخل استنساخ (استنساخات) B. burgdorferi (الجدول 2).
    ملاحظة: B. burgdorferi هو كائن حي من المستوى 2 للسلامة الأحيائية. اتخاذ جميع الاحتياطات المناسبة أثناء العمل مع هذا الكائن الحي. أداء جميع الأعمال مع الثقافات الحية ل B. burgdorferi في خزانة سلامة بيولوجية معتمدة ومطهرة بشكل صحيح من الفئة الثانية. تخلص بشكل صحيح من جميع المواد التي تتصل ب B. burgdorferi والكائنات الحية نفسها بناء على إرشادات CDC34.
  3. احتضان الثقافات عند 33 درجة مئوية دون الاهتزاز حتى تصل الثقافات إلى كثافة ≥5 × 107 spirochetes·mL−1 ، والتي تستغرق حوالي 3-5 أيام.

2. تحديد كثافة ثقافة (ثقافات) B. burgdorferi (معدلة من Samuels)15

  1. بالنسبة للكثافات المتوقع أن تكون أعلى من 5 × 106 خلايا · مل − 1 ، حدد كثافة الخلية باستخدام التحليل الطيفي.
    1. انقل 1 مل من الثقافة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 8000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ 137 mM NaCl ، 2.7 mM KCl ، 10 mM Na 2 HPO 4 ، و 1.8mM KH2PO4). انقل معلق الخلية بالكامل إلى كوفيت شفاف شبه دقيق للأشعة فوق البنفسجية.
    3. أوجد الكثافة البصرية للعينة المعاد تعليقها عند طول موجي مقداره 600 نانومتر (A600). صفر مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد) مقابل PBS.
    4. لحساب تركيز اللولبيات · مل − 1 في الثقافة الأصلية ، اضرب الكثافة البصرية عند A600 في 1.4 × 109.
  2. بالنسبة للكثافات المتوقع أن تكون بين 5 × 104 خلايا · مل − 1 و 5 × 106 خلايا · مل − 1 ، حدد كثافة الخلية باستخدام غرفة عد Petroff-Hausser (انظر جدول المواد) لحساب عدد اللولبيات مباشرة. يمكن استخدام هذه الطريقة أيضا للكثافات العالية بعد التخفيف المناسب.
    ملاحظة: يتطلب تصور اللولبيات الحية مجهرا معدلا بمكثف المجال المظلم.
    1. ضع 10 ميكرولتر من العينة على غرفة العد وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي مناسب. بالنسبة للكثافات الأعلى من 1 × 107 ، قم بتخفيف العينة في PBS لإنتاج 50-100 spirochetes لكل حقل.
    2. عد الخلايا باستخدام مجهر الحقل المظلم بتكبير 200x-400x. عد الحقل بأكمله المكون من 25 مجموعة من 16 مربعا صغيرا في جميع المستويات.
    3. اضرب العدد المحسوب بعامل التخفيف (إن وجد) و 5 × 104 للحصول على خلايا · مل − 1 من الثقافة الأصلية.

3. تحريض B. بورغدورفيري فاج φBB-1

ملاحظة: تعقيم جميع الأواني الزجاجية والبلاستيكية عن طريق التعقيم ؛ تعقيم جميع الحلول عن طريق التعقيم أو الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يتم تقديم الخطوات أدناه بناء على أحجام 15 مل ، ولكن الطريقة قابلة للتطوير إلى أحجام أصغر أو أكبر اعتمادا على الاحتياجات الفردية للتجربة.

  1. بالنسبة لمزرعة B. burgdorferi التي سيتم إنتاج العاثية منها (المتبرع) ، استخدم التركيز المحسوب بأي من الطريقتين في الخطوة 2 لتحديد حجم ثقافة البداية اللازمة لإنتاج 4 مل من 2 × 108 spirochetes · mL − 1. سينتج عن ذلك تركيز نهائي قدره 5 × 107 spirochetes·mL−1 في 15 مل خلال مرحلة الاسترداد (الخطوة 3.6 أدناه).
  2. أجهزة الطرد المركزي حجم الثقافة المحسوبة في الخطوة 3.1 عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 4 مل من BSK الطازج. انقل العينة إلى أصغر أنبوب معقم متاح لحمل العينة بأقل مساحة للرأس.
  3. أضف الكمية المناسبة من العامل المحرض إلى التركيز الموصى به (الجدول 3) بناء على حجم مزرعة يبلغ 4 مل للحث على إنتاج العاثيات. قم بتغطية الأنبوب بإحكام واخلطه جيدا.
  4. احتضان العينة عند 33 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعات.
  5. بعد الحضانة ، انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي للعينة عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق. صب الطاف.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 15 مل من 1x BSK.
    ملاحظة: بعد تحريض العاثية ، هناك طريقتان مختلفتان للمضي قدما في فحص النقل. يتم عرض هذه الطرق في الشكل 1 وفي الخطوة 4 والخطوة 6.

4. النقل أثناء الاستزراع المشترك بعد تعرض المتبرع للعامل المحرض (الشكل 1 أ)

ملاحظة: لا يمكن استخدام هذا البروتوكول إلا عندما تكون السلالة المنتجة للعاثيات (المتبرع) مقاومة لمضاد حيوي معين والسلالة المراد تحويلها (المتلقي) لديها مقاومة لمضاد حيوي آخر.

  1. قم بإعداد مزرعة B. burgdorferi لاستخدامها كمتلقي في فحوصات النقل ، كما هو موضح لسلالة المتبرع في الخطوة 1 أعلاه. بناء على الكثافة المحددة كما في الخطوة 2 ، احسب الحجم اللازم لإنتاج 15 مل من 1 × 107 spirochetes·mL−1.
  2. أجهزة الطرد المركزي حجم الثقافة المحسوبة في الخطوة 4.1 عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق. صب الطاف.
  3. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المزرعة من الخطوة 3.6 (المتبرع بالعاثيات المعاد تعليقه). أضف المستلم المعاد تعليقه مرة أخرى إلى الثقافة مع المتبرع. لا تكمل مع المضادات الحيوية. الحجم الكلي الذي يحتوي على كلتا الثقافتين هو 15 مل.
  4. احتضان عند 33 درجة مئوية لمدة 72-96 ساعة.
  5. قم بإجراء اختيار أجهزة نقل الهواء عن طريق الطلاء في الطور الصلب بعد الاستزراع المشترك كما هو موضح في الخطوة 7.

5. ترسيب البولي إيثيلين جلايكول (PEG) لاستعادة العاثية لاستخدامها في مقايسة النقل

ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول في الحالات التي يكون فيها للسلالة المنتجة للعاثيات (المانح) مقاومة لمضاد حيوي معين والسلالة المراد تحويلها (المتلقي) إما ليس لديها مقاومة للمضادات الحيوية أو مقاومة لمضاد حيوي آخر.

  1. استكمل الثقافة من الخطوة 3.6 بالمضاد الحيوي المناسب بالتركيز الموضح في الجدول 2. احتضان العينة عند 33 درجة مئوية لمدة 72-96 ساعة.
  2. إعداد حلول لهطول الأمطار PEG.
    1. تحضير 500 مل من 5 م كلوريد الصوديوم. تعقيم عن طريق التعقيم والسماح لتبرد قبل الاستخدام. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    2. تحضير 500 مل من 40٪ PEG عن طريق إذابة 200 غرام من PEG8000 في 400 مل من الماء ؛ يسخن برفق مع التحريك حتى يمتزج المحلول جيدا. ارفع الحجم إلى 500 مل بالماء. لإذابة PEG8000 تماما وتعقيم المحلول ، قم بتعقيم المحلول وتبريده قبل الاستخدام. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإعداد 100 مل من وسط التعليق (SM ؛ 100 mM NaCl ، 10 mM MgSO4 ، و 50 mM Tris-HCl [pH 7.5]). تعقيم عن طريق التعقيم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  3. بالنسبة لترسيب PEG للعاثية من استنساخ B. burgdorferi المانح (من الخطوة 3.6) ، بعد 72-96 ساعة من الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 8000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. صب المادة الطافية في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل ؛ تخلص من بيليه الخلية. أضف 5 م كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي قدره 1 م. تخلط جيدا. صخرة بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  5. أجهزة الطرد المركزي للعينات عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل ؛ قد تكون الحبيبات صغيرة أو غائبة. أضف محلول PEG8000 بنسبة 40٪ إلى المادة الطافية إلى تركيز نهائي بنسبة 10٪. تخلط جيدا وتوضع على الثلج لأكثر من 1 ساعة حتى بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: لا يبدو أن الأوقات الأطول ترتبط بزيادة كبيرة في استعادة العاثيات.
  6. أجهزة الطرد المركزي للعينات عند 8000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل الزائدة دون فقد أي حبيبات تحتوي على جزيئات العاثية.
  7. أعد تعليق الحبيبات في الحد الأدنى من حجم SM ، باستخدام SM لغسل جانب الزجاجة وجمع أي جزيئات عاثية محتملة. النسبة الموصى بها هي 400 ميكرولتر من SM لكل 10 مل من المادة الطافية الأصلية ، ولكن اعتمادا على حجم الحبيبات ، قد تكون هناك حاجة إلى SM أكثر أو أقل للتعليق الكامل.
  8. عالج عينة العاثية المستردة بحجم متساو من الكلوروفورم بناء على حجم التعليق. امزج العينة جيدا ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 8000 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الطبقة المائية (العلوية) إلى أنبوب نظيف ، وتجنب أي من طبقة الواجهة السميكة.
    ملاحظة: φBB-1 عبارة عن عاثية غير مغلفة وليست عرضة للعلاج بالكلوروفورم25. تتم هذه الخطوة لزيادة تعطيل أي هياكل مرتبطة بالغشاء (أي الخلايا أو الفقاعات) وقتل أي ملوثات خلوية محتملة. الكلوروفورم هو مادة عضوية متطايرة ويجب استخدامه فقط في غطاء دخان جيد التهوية ؛ تخلص من المواد التي تحتوي على الكلوروفورم كنفايات عضوية.
  9. حدد الحجم المستعاد بعد معالجة الكلوروفورم الأولى وعالج العينة مرة أخرى بكمية من الكلوروفورم تساوي 10٪ من هذا الحجم. تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي في 8000 × غرام لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الطبقة المائية (العلوية) ، مع الحرص على تجنب أي من الواجهة أو الطبقة العضوية. نقل الطبقة المائية إلى أنبوب نظيف.
  10. استخدم العاثية على الفور (كما هو موضح في الخطوة 6) أو خزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لا ينصح بتجميد عينات العاثية φBB-1. على الرغم من أن استقرار φBB-1 عند 4 درجات مئوية لم يتم فحصه بدقة ، فقد تم استخدام العينات المخزنة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد بعد الاسترداد بنجاح في فحوصات النقل.

6. مقايسة النقل بعد هطول الأمطار PEG من φBB-1 (الشكل 1B)

  1. قم بإعداد مزارع B. burgdorferi لاستخدامها كمتلقي في فحوصات النقل ، كما هو موضح لسلالة المتبرع في الخطوة 1 أعلاه. بناء على الكثافة المحددة كما في الخطوة 2 ، احسب حجم ثقافة المتلقي اللازمة لإنتاج 15 مل من 1 × 107 spirochetes · mL − 1.
  2. أجهزة الطرد المركزي حجم الثقافة المحسوبة في الخطوة 6.1 عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 14.5 مل من BSK الطازج.
  3. أضف ≤500 ميكرولتر من عينة العاثية المترسبة ب PEG (من الخطوة 5) إلى ثقافة استنساخ المتلقي. تخلط جيدا وتحتضن عند 33 درجة مئوية لمدة 72-96 ساعة.
    ملاحظة: يمكن أن تكون كمية العاثيات المستعادة أثناء هطول الأمطار PEG متغيرة ، اعتمادا على عدد من العوامل. ومع ذلك ، من 15 مل من سلالة B. burgdorferi المستحثة CA-11.2A ، يحتوي 500 ميكرولتر عادة على 50-1000 عاثيةقابلة للحياة 28. تؤثر أحجام استعادة العاثيات ≥500 ميكرولتر سلبا على نمو B. burgdorferi ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى زيادة نسبة SM إلى BSK.
  4. قم بإجراء اختيار أجهزة نقل الهواء عن طريق الطلاء بالمرحلة الصلبة بعد الخلط مع العاثية المترسبة ب PEG كما هو موضح في الخطوة 7.

7. اختيار المحولات

ملاحظة: يتم إجراء طلاء الطور الصلب للمحولات المحتملة باستخدام تعديل أحادي الطبقة للبروتوكول الذي وصفه صموئيل15 لأول مرة. تنمو مستعمرات B. burgdorferi داخل أجار ، لذلك لاختيار المحولات عن طريق الطلاء في المرحلة الصلبة ، يجب إضافة العينات إلى الوسائط أثناء سكب الألواح. كما تم وصف طريقة بديلة لاختيار المحولات باستخدام طريقة التخفيف في 96 لوحة بئر سابقا35. قد تكون هذه التقنية فعالة أيضا في اختيار أجهزة التحويل ولكن لم يتم تجربتها بعد لهذا الغرض.

  1. حدد عدد الألواح اللازمة لاختيار أجهزة نقل الهواء بناء على عدد العينات من مقايسات النقل وأدوات التحكم المراد طلاؤها.
    ملاحظة: عادة ، يتم سكب طبقين لكل عينة ، أحدهما يعادل حوالي 10٪ من حجم المستنبت والآخر يتضمن بقية الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بصب الألواح التي تعمل كعناصر تحكم سلبية لاختبار أن إعداد العاثية و / أو استنساخ الوالدين المستخدم كمتبرع ومتلقي لا ينمو في وجود المضاد الحيوي (المضادات الحيوية) المستخدم أثناء الاختيار. يوصى أيضا بإعداد مواد الطلاء لطبقين إضافيين على الأقل. على سبيل المثال ، إذا كان عدد العينات وأدوات التحكم المراد طلاؤها ثمانية ، فقم بإعداد مزيج طلاء كاف ل 10 لوحات.
  2. قم بإعداد حلول للطلاء كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: ستكون كل لوحة 30 مل ، تتكون من 20 مل من 1.5x BSK للطلاء و 10 مل من 2.1٪ أغاروز (نسبة 2: 1). سينتج عن ذلك صفيحة بتركيزات نهائية تبلغ 1x BSK و 0.7٪ أغاروز. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 10 ألواح ، قم بإعداد مزيج طلاء إجمالي يبلغ 300 مل ، يتكون من 200 مل من 1.5x BSK و 100 مل من 2.1٪ أغاروز.
    1. قم بإعداد 1 لتر من 1.5x BSK كما هو موضح ل 1x BSK في الخطوة 1.1 باستخدام كميات كل مكون مدرج ل 1.5x BSK في الجدول 1. يخزن كما هو موضح ل 1x BSK.
    2. تحضير 2.1 ٪ agarose في الماء والأوتوكلف. استخدم محلول الأغاروز طازجا أو خزنه في درجة حرارة الغرفة. إذا تم تخزينها في درجة حرارة الغرفة ، في الميكروويف مع الغطاء بشكل غير محكم حتى يذوب تماما قبل الطلاء.
    3. تحديد حجم المضادات الحيوية اللازمة لتحقيق التركيز المناسب (الجدول 2) بناء على مزيج الطلاء بأكمله.
      ملاحظة: إذا كان الحجم الإجمالي لمحلول الطلاء النهائي 300 مل ، فقم بخلط 200 مل من 1.5x BSK ومضاد حيوي كاف للتأكد من أن 300 مل بالكامل تحتوي على تركيز المضادات الحيوية النهائي الصحيح. إذا كان لدى كل من المتبرع والمتلقي في مقايسة النقل جينات مختلفة مقاومة للمضادات الحيوية ، فيجب أن يحتوي مزيج الطلاء على كلا المضادات الحيوية. إذا كانت العاثية المترسبة ب PEG من المتبرع (كما هو موضح في الخطوة 5) تشفر علامة مقاومة للمضادات الحيوية ولم يكن لدى المتلقي أي علامة ، فيجب أن يحتوي مزيج الطلاء على مضاد حيوي واحد فقط.
  3. بناء على عدد الأطباق المراد سكبها ، انقل الكمية المناسبة من 1.5x BSK والمضادات الحيوية إلى زجاجة معقمة كبيرة بما يكفي لاستيعاب مزيج الطلاء بالكامل. التوازن في حمام مائي عند 56 درجة مئوية لمدة ≥15 دقيقة.
  4. قم بموازنة الأغاروز المنصهر من الأوتوكلاف أو الميكروويف في حمام مائي بدرجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة ≥15 دقيقة.
  5. بعد التوازن ، أضف الكمية المحددة من 2.1٪ أغاروز إلى الزجاجة مع 1.5x BSK (مع مضاد حيوي) ووضع محلول الطلاء مرة أخرى في حمام مائي عند 42 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي درجات الحرارة المرتفعة إلى إتلاف أو قتل اللولبيات36. في حالة استخدام نفس الحمام المائي المذكور أعلاه ، قم بتبريد الحمام المائي إلى 42-45 درجة مئوية قبل بدء المؤقت للتوازن. لا تدع محلول الطلاء يتوازن عند 42 درجة مئوية لأكثر من 20 دقيقة وإلا سيبدأ في التصلب أثناء صب الألواح.
  6. أثناء التوازن ، قم بإعداد عينات B. burgdorferi المراد طلاؤها. انقل الكمية المراد طلاؤها إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 مل (انظر جدول المواد).
    1. في حالة الطلاء بكمية أقل من 1.5 مل (<5٪ من حجم اللوحة النهائي 30 مل) ، انقل العينة إلى الأنبوب الجديد وأضف مزيج الطلاء مباشرة إلى العينة أثناء الطلاء.
    2. بالنسبة للأحجام الأكبر ، انقل الحجم المطلوب من الثقافة إلى الأنبوب الجديد ثم قم بجهاز طرد مركزي بسرعة 6000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب كل ما عدا 100-500 ميكرولتر من المادة الطافية واستخدم الباقي لإعادة تعليق الحبيبات تماما قبل الطلاء.
    3. بالنسبة للوحات التحكم بعد الزراعة المشتركة ، أضف ≥107 خلايا من استنساخ المتبرع أو المتلقي إلى أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة سعة 50 مل. إذا كان الحجم أكثر من 1.5 مل ، قم بالطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات كما في الخطوة 7.6.2. إذا تم إجراء اختبار نقل باستخدام العاثية المترسبة ب PEG ، بالإضافة إلى استنساخ المتلقي ، أضف 100-250 ميكرولتر من عينة العاثية إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل للطلاء.
  7. بعد توازن محلول الطلاء عند 42-45 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة ، انقل 30 مل من محلول الطلاء إلى أنبوب مع العينة المناسبة ؛ قم على الفور بتوزيع مزيج الطلاء والعينة في لوحة ملصقة. كرر باستخدام ماصة جديدة لكل عينة ليتم طلاؤها.
  8. اترك الألواح تتجمد لمدة 15-20 دقيقة ثم ضعها في حاضنة 33 درجة مئوية مكملة ب 5٪ CO2. لا تقلب الألواح لمدة 48 ساعة على الأقل بعد سكبها.
  9. اعتمادا على خلفية استنساخ المستلم ، تحقق من ظهور المستعمرات داخل الأغاروز على لوحات الاختيار بعد 10-21 يوما من الحضانة. اختر ما لا يقل عن 5-10 مستعمرات تنمو على الطبق في وجود كلا المضادات الحيوية باستخدام 5.75 معقم موصول بالقطن في ماصة البورسليكات (انظر جدول المواد) وقم بتلقيحها إلى 1.5 مل من 1x BSK مع المضادات الحيوية المناسبة.
  10. قم بزراعة المستعمرات الملقحة عند 33 درجة مئوية كما في الخطوة 1.3 لمدة 3-5 أيام أو حتى تصل إلى كثافة تقارب 20-40 لولبية لكل حقل عند تكبير 200x باستخدام مجهر المجال المظلم.
    ملاحظة: بمجرد غربلة (انظر الخطوة 8) ، يمكن تجميد اللولبيات للتخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية عن طريق خلط حجم متساو من الثقافة مع خليط من 60٪ جلسرين و 40٪ 1x BSK معقم عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.

8. التحقق من المحولات المحتملة

ملاحظة: فحص الحيوانات المستنسخة التي تنمو على لوحات في وجود اثنين من المضادات الحيوية للتحقق من أنها تمثل ناقلات حقيقية في الخلفية المتوقعة (المتلقي). تعتمد هذه الطرق على تضخيم مناطق محددة ، وربما تسلسلها ، بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل. تم وصف البروتوكولات والممارسات التفصيلية لأداء تفاعل البوليميراز المتسلسل في B. burgdorferi في مكان آخر (للحصول على مثال حديث ، انظر Seshu et al.37). حدد البادئات المستخدمة لفحص المحولات بناء على السلالات المستخدمة. فيما يلي بعض الاقتراحات حول كيفية التعامل مع فحص أجهزة التحويل.

  1. تحضير محللات B. burgdorferi لفحص PCR.
    ملاحظة: يستخدم البروتوكول التالي لإنتاج محللات B. burgdorferi المغسولة من الخلايا المستزرعة المزروعة كما في الخطوة 7.9 للتحليل الفوري للحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تصميم هذه الطريقة لتقليل تداخل المثبطات المحتملة في BSK ولكن لا ينصح بها لإنتاج حمض نووي عالي الجودة للتسلسل أو التخزين. لهذا الغرض ، استخدم بروتوكولا أو مجموعة لاستخراج الجينوم الكلي (انظر جدول المواد). يوصى بشدة بإعداد المحللات من الحيوانات المستنسخة الأم (سلالات المتبرع والمتلقي) في نفس الوقت لتضمينها في كل تحليل.
    1. نقل 500 ميكرولتر من كل ناقل محتمل تم اختياره واستزراعه كما في الخطوة 7.10 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف.
    2. قم بالطرد المركزي للثقافات لمدة 10 دقائق عند 8000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 500 ميكرولتر من TE (10 mM Tris Cl ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 1 mM EDTA ، درجة الحموضة 8.0). جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 8000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 50 ميكرولتر من الماء بجودة تفاعل البوليميراز المتسلسل. اغلي العينات لمدة 10 دقائق. دعها تبرد لفترة وجيزة ، ثم أجهزة الطرد المركزي بسرعة 8000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. لكل PCR ، استخدم على الفور 2 ميكرولتر من أعلى عينة الطرد المركزي ؛ تجنب إزعاج الحبيبات.
  2. فحص المحولات المحتملة للجينات المحددة التي تشفر مقاومة المضادات الحيوية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. انظر الجدول 4 للاطلاع على البادئات لفحص علامات مقاومة المضادات الحيوية التي يشيع استخدامها في مقايسات النقل.
    ملاحظة: على الرغم من ندرتها في تجربتنا ، يمكن أن تحدث طفرة عفوية في المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد المستخدمة لاختيار الحمض النووي غير المتجانس في B. burgdorferi.
  3. قم بفحص المحولات المحتملة أيضا باستخدام سلالة أخرى أو علامة استنساخ للتأكد من أن الخلفية هي خلفية المستلم. قم بتضمين كل من المستنسخ من المتبرع والمتلقي في هذه التحليلات. فحص العلامات الخاصة بالسلالة باستخدام تسلسلات بناء على السلالات المستخدمة والبروتوكولات المختبرية الفردية لتحديد سلامة السلالة.
  4. في حالة محاولة التحويل إلى استنساخ خبيث للاستخدام داخل ناقل القراد أو مضيف الثدييات أو للمقارنة المباشرة مع استنساخ آخر ، حدد محتوى البلازميد الكامل للمحولات واستنساخ الأصل. يتم ذلك لضمان نفس محتوى البلازميد مثل محتوى السلالة المقارنة أو وجود العناصر الوراثية اللازمة للتكاثر داخل الدورة الحيوانية ، كما هو موضح في مكان آخر 18،19،37،38،39.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمثل استخدام البكتيريا لنقل الحمض النووي بين سلالات B. burgdorferi القابلة للتحويل بسهولة أكبر أو الحيوانات المستنسخة المتمردة على التحول الكهربائي أداة أخرى للتحقيق الجزيئي المستمر لمحددات مرض لايم. يمكن تعديل مقايسة النقل الموصوفة هنا حسب الحاجة لتسهيل حركة الحمض النووي بين أي مستنسخات ذات أهمية باستخدام واحد أو اثنين من المضادات الحيوية لاختيار أجهزة نقل القناة المحتملة. تم إثبات نقل كل من الحمض النووي للتنبؤ ونواقل مكوك E. coli / B. burgdorferi غير المتجانسة بين سلالة CA-11.2A عالية المرور ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن أن يمثل استخدام النقل طريقة واحدة للتغلب على الأقل على بعض الحواجز البيولوجية والتقنية المرتبطة بالتحويل الكهربائي ل B. burgdorferi1،4،13،37. في العديد من الأنظمة ، يمكن للبكتيريا نقل الحمض النووي المضيف (غير التكهني) بين الخلايا البكتيرية إما عن طريق النقل المعمم أو المتخصص22،23،24،49<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلف أن يشكر شونا ريد ود. سكوت صامويلز وباتريك سيكور على مناقشتهم المفيدة وفاريون (بام) تشونوييراونغ على مساعدتهم التقنية. تم دعم هذا العمل من قبل قسم العلوم الطبية الحيوية ومنح أبحاث أعضاء هيئة التدريس إلى كريستيان إتش إيجرز من كلية العلوم الصحية بجامعة كوينيبياك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وحدات تصفية 1 لتر (PES ، 0.22 ومايكرو ؛ حجم المسام م)Millipore SigmaS2GPU10RE
أنبوب 12 مم × 75 مم (غطاء مزدوج الموضع) (بولي بروبلين) يحملUSA Scientific1450-08104 مل بحجم فراغ منخفض (للحث)
15 مل أنابيب طرد مركزي مخروطية (بولي بروبيلين)الولايات المتحدة الأمريكية العلمية5618-8271
1-ميثيل -3-نيتروسو-نيتروجوانيدين (MNNG)ميليبور سيجماتحذير: مادة مسرطنة محتملة. لم يعد متاحا بسهولة ، ولم يتم اختبار بديل
ماصات باستور 5.75 بوصة (زجاج البورسليكات القطني / غير المعقم)الأوتوكلافالحراري فيشر العلمي13-678-8A
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية (البولي بروبيلين)الولايات المتحدة الأمريكية العلمية1500-1211
الإيثانول
المطلق Agarose LEDot Scientific inc.AGLE-500
Bacto NeopeptoneGibcoDF0119-17-9
Bacto TC YeastolateGibco255772
ألبومين مصل الأبقار (درجة استبدال المصل)Gemini Bio-Products700-104P
Chloroform (للبيولوجيا الجزيئية)Thermo Fisher ScientificBP1145-1تحذير: عضوي متطاير ؛ استخدم فقط في غطاء الدخان الكيميائي
CMRL-1066 ث / س L-Glutamine (مسحوق)الولايات المتحدة البيولوجيةC5900-01درجة ثقافة الخلايا
منتجات أبحاث الإريثروميسينInternational CorpE57000-25.0
محلول كاشف الجنتاميسينجيبكو15750-060
جلوكوز (سكر العنب اللامائي )ثيرمو فيشر العلميBP350-500
HEPESثيرمو فيشر العلميBP310-500
كبريتات كاناميسينثيرمو فيشر العلمي25389-94-0
Millex-GS (0.22 & micro; حجم المسام M)Millipore SigmaSLGSM33SSلتصفية تعقيم المضادات الحيوية وغيرها من الحلول ذات الحجم الصغير
Mitomycin CThermo Fisher ScientificBP25312تحذير: مادة مسرطنة محتملة ؛ استخدم فقط في غطاء الدخان الكيميائي
N-acetyl-D-glucosamineMP Biomedicals، LLC100068
قليل النوكليوتيدات (الاشعال ل PCR)IDT DNA
OmniPrep (مجموعة الاستخراج الجيني الكلي)G Biosciences786-136
Petri Dish (100 مم ومرات ؛ 15 مم)Thermo Fisher ScientificFB0875712
Petroff-Hausser غرفة العدHausser ScientificHS-3900
Petroff-Hausser غطاء غرفة العد زجاجيHausser ScientificHS-5051
البولي إيثيلين جلايكول 8000 (PEG)Thermo Fisher ScientificBP233-1
مصل الأرانب غير معقم شباب متحلل الأثر (NRS)Pel-Freez Biologicals31119-3تعطيل الحرارة وفقا لتعليمات الشركة
المصنعة كوفيت شفاف شبه ميكرو للأشعة فوق البنفسجيةالولايات المتحدة الأمريكية Scientific9750-9150
بيكربونات الصوديومثيرمو فيشر ScientificBP328-500
كلوريدالصوديومثيرمو فيشر العلميBP358-1
بيروفات الصوديومميليبور سيجماP8674-25G
Spectronic Genesys 5محلول كبريتات الستربتومايسين العلمي
Millipore SigmaS6501-50G
سترات ثلاثي الصوديوم ثنائي هيدراتMillipore SigmaS1804-500Gسترات الصوديوم ل BSK
قبل استخدامThermo Fisher

المراجع

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, F1000 Faculty Rev-763 (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066(2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195(2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131(1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331(2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , Centers for National Institutes of Health. Bethesda, Maryland. (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61(2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622(2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165(2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994(2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16(2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7(2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298(1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. Saier, M. H., Garcia-Lara, J. , Horizon Scientific Press. Wymondham, UK. Chapter 4 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , Springer. New York, NY. (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DNA PEG
التلاعب الجيني بوساطة العاثيات لمرض لايم Spirochete Borrelia burgdorferi
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.