مقالة منهجية

طريقة لدراسة سمية α-سينوكلين وتجميعها باستخدام نموذج خميرة متوافق مع البشر

DOI:

10.3791/64418

⸱

نوفمبر 25, 2022

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ajou University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مطلوب نموذج فسيولوجي في الجسم الحي من α-synuclein لدراسة وفهم التسبب في مرض باركنسون. وصفنا طريقة لمراقبة السمية الخلوية والتكوين الكلي ل α-synuclein باستخدام نموذج الخميرة المتوافق مع البشر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض باركنسون هو ثاني أكثر الاضطرابات التنكسية العصبية شيوعا ويتميز بموت الخلايا التدريجي الناجم عن تكوين أجسام ليوي التي تحتوي على α سينوكلين غير مطوية ومجمعة. α-synuclein هو بروتين وفير قبل المشبكي ينظم الاتجار بالحويصلة المشبكية ، لكن تراكم شوائب البروتين يؤدي إلى سمية عصبية. كشفت الدراسات الحديثة أن العوامل الوراثية المختلفة ، بما في ذلك المرافقين البكتيريين ، يمكن أن تقلل من تكوين مجاميع α-synuclein في المختبر. ومع ذلك ، من المهم أيضا مراقبة التأثير المضاد للتجميع في الخلية لتطبيق هذا كعلاج محتمل للمرضى. سيكون من المثالي استخدام الخلايا العصبية ، ولكن يصعب التعامل مع هذه الخلايا وتستغرق وقتا طويلا لإظهار النمط الظاهري المضاد للتجميع. لذلك ، يلزم وجود أداة سريعة وفعالة في الجسم الحي لإجراء مزيد من التقييم لنشاط مكافحة التجميع في الجسم الحي. تم استخدام الطريقة الموصوفة هنا لمراقبة وتحليل النمط الظاهري المضاد للتجميع في الخميرة البشرية Saccharomyces cerevisiae ، والتي عبرت عن α synuclein البشري. يوضح هذا البروتوكول في الجسم الحي الأدوات التي يمكن استخدامها لرصد السمية الخلوية التي يسببها α سينوكلين ، وكذلك تكوين مجاميع α سينوكلين في الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض باركنسون (PD) هو مشكلة خطيرة للمجتمعات الشيخوخة في جميع أنحاء العالم. يرتبط تجميع α-synuclein ارتباطا وثيقا بمرض باركنسون ، وتستخدم مجاميع البروتين من α-synuclein على نطاق واسع كعلامة حيوية جزيئية لتشخيص المرض1. α-synuclein هو بروتين حمضي صغير (140 من الأحماض الأمينية في الطول) مع ثلاثة مجالات ، وهي N-terminal ربط الدهون α-helix ، والمجال المركزي المرتبط بالأميلويد (NAC) ، والذيل الحمضيC-terminal 2. يمكن أن يحدث اختلال α-synuclein تلقائيا ويؤدي في النهاية إلى تكوين مجاميع أميلويد تسمى أجسام ليوي3. قد يساهم α-synuclein في التسبب في مرض باركنسون بعدة طرق. بشكل عام ، يعتقد أن أشكالها قليلة القسيمات غير الطبيعية القابلة للذوبان والتي تسمى protofibrils هي أنواع سامة تسبب موت الخلايا العصبية من خلال التأثير على أهداف خلوية مختلفة ، بما في ذلك الوظيفة المشبكية3.

يجب أن تكون النماذج البيولوجية المستخدمة لدراسة الأمراض التنكسية العصبية ذات صلة بالبشر فيما يتعلق بالجينوم والبيولوجيا الخلوية. أفضل النماذج هي خطوط الخلايا العصبية البشرية. ومع ذلك ، ترتبط خطوط الخلايا هذه بالعديد من المشكلات الفنية ، مثل الصعوبات في الحفاظ على الثقافات ، وانخفاض كفاءة النقل ، وارتفاع النفقات4. لهذه الأسباب ، هناك حاجة إلى أداة سهلة وموثوقة لتسريع التقدم في هذا المجال البحثي. الأهم من ذلك ، يجب أن تكون الأداة سهلة الاستخدام لتحليل البيانات التي تم جمعها. من هذه المنظورات ، تم استخدام كائنات نموذجية مختلفة على نطاق واسع ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة ، و Caenorhabditis elegans ، و Danio rerio ، والخميرة ، والقوارض5. من بينها ، الخميرة هي أفضل كائن نموذجي لأن التلاعب الجيني سهل ، وهو أرخص من الكائنات الحية النموذجية الأخرى. الأهم من ذلك ، أن الخميرة لها أوجه تشابه عالية مع الخلايا البشرية ، مثل 60٪ تماثل تسلسلي مع تقويم العظام البشري و 25٪ تماثل وثيق مع الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية6 ، كما أنها تشترك في بيولوجيا الخلية حقيقية النواة الأساسية. تحتوي الخميرة على العديد من البروتينات ذات التسلسلات المتشابهة والوظائف المماثلة لتلك الموجودة في الخلايا البشرية7. في الواقع ، تم استخدام الخميرة التي تعبر عن الجينات البشرية على نطاق واسع كنظام نموذجي لتوضيح العمليات الخلوية8. تسمى سلالة الخميرة هذه الخميرة المؤنسنة وهي أداة مفيدة لاستكشاف وظيفة الجينات البشرية9. الخميرة المتوافقة مع البشر لها ميزة لدراسة التفاعلات الجينية لأن التلاعب الجيني راسخ في الخميرة.

في هذه الدراسة ، استخدمنا الخميرة Saccharomyces cerevisiae ككائن نموذجي لدراسة التسبب في مرض باركنسون ، خاصة للتحقيق في تكوين إجمالي α-synuclein والسمية الخلوية10. للتعبير عن α-synuclein في الخميرة الناشئة ، تم استخدام سلالة W303a للتحول مع ترميز البلازميدات للمتغيرات البرية والعائلية المرتبطة ب PD من α-synuclein. نظرا لأن سلالة W303a لها طفرة ذاتية التغذية على URA3 ، فهي قابلة للتطبيق لاختيار الخلايا التي تحتوي على البلازميدات مع URA3. يتم تنظيم التعبير عن α-synuclein المشفر في البلازميد تحت مروج GAL1. وبالتالي ، يمكن التحكم في مستوى التعبير عن α-synuclein. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اندماج البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في المنطقة الطرفية C من α-synuclein يسمح بمراقبة تكوين بؤر α-synuclein. لفهم خصائص المتغيرات العائلية المرتبطة ب PD ل α-synuclein ، قمنا أيضا بالتعبير عن هذه المتغيرات في الخميرة وفحصنا آثارها الخلوية. هذا النظام هو أداة مباشرة لفحص المركبات أو الجينات التي تظهر أدوارا وقائية ضد السمية الخلوية ل α-synuclein.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد وسائل الإعلام والحلول

  1. التحضير لوسائط الإعلام
    1. لتحضير وسط YPD ، قم بإذابة 50 جم من مسحوق YPD في dH2O لعمل حجم نهائي قدره 1 لتر. الأوتوكلاف للتعقيم. يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. لجعل أجار YPD متوسطا ، قم بإذابة 50 جم من مسحوق YPD و 20 جم من أجار في 1 لتر من dH2O. الأوتوكلاف للتعقيم. بعد التبريد ، صب على أطباق بتري. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    3. لصنع SC مع وسط رافينوز (SRd) -Ura ، قم بإذابة 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة مع كبريتات الأمونيوم وبدون أحماض أمينية في 795 مل من dH2O. الأوتوكلاف للتعقيم. أضف 100 مل من 20٪ رافينوز ، و 5 مل من 20٪ جلوكوز ، و 100 مل من 10x -Ura المتسربة قبل الاستخدام.
    4. لجعل SD-Ura أجار المتوسطة ، قم بإذابة 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة مع كبريتات الأمونيوم وبدون أحماض أمينية و 20 جم من الآجار في 800 مل من dH 2 O. الأوتوكلاف في قارورة بحجم يزيد عن2لتر. أضف 100 مل من الجلوكوز بنسبة 20٪ و 100 مل من التسرب من 10x -Ura. تخلط جيدا وتصب على أطباق بتري. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    5. لجعل SC مع الجالاكتوز (SG) -Ura أجار المتوسطة ، قم بإذابة 6.7 غرام من قاعدة نيتروجين الخميرة مع كبريتات الأمونيوم وبدون أحماض أمينية و 20 جم من أجار في 800 مل من dH 2 O. الأوتوكلاف في قارورة بحجم يزيد عن2لتر. أضف 100 مل من 20٪ جالاكتوز و 100 مل من 10x -Ura التسرب. تخلط جيدا وتصب على أطباق بتري. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. حلول الأسهم لاستخدامها مع وسائط SD
    1. لصنع مصدر كربون بنسبة 20٪ (الجلوكوز والجالاكتوز والرافينوز) ، قم بإذابة 100 جم من الجلوكوز أو الجالاكتوز أو الرافينوز في dH2O لعمل حجم نهائي يبلغ 500 مل. الأوتوكلاف وتخزينها في RT.
    2. لصنع 10x خميرة مكملات متوسطة التسرب الاصطناعية بدون يوراسيل (10x-Ura drop-out) ، قم بإذابة 19.2 جم من "مكملات الخميرة الاصطناعية المتوسطة بدون اليوراسيل" في dH2O لعمل حجم نهائي قدره 1 لتر. الأوتوكلاف وتخزينها في RT.
      ملاحظة: لتحضير وسط يحتوي على أجار ، أضف قضيب تحريك مغناطيسي إلى القارورة لخلط جميع المحاليل جيدا قبل سكبها على أطباق بتري.

2. تحول الخميرة

ملاحظة: تم استخدام بلازميد pRS426 لاستنساخ جين α-synuclein واحتوى على جين URA3 كعلامة قابلة للتحديد. هناك متغيرات عائلية مرتبطة بمرض باركنسون من α-سينوكلين لها أنماط ظاهرية شديدة للأمراض (على سبيل المثال ، السمية الخلوية). تم استخدام هذه المتغيرات هنا أيضا لمراقبة سميتها الخلوية وتشكيل البؤر المجمعة. استخدم نفس مستعمرة محولات الخميرة لجميع التجارب للحصول على نتائج متسقة.

  1. لتحويل بلازميدات تعبير الخميرة ، استخدم متجه فارغ (pRS426) كبلازميدات تحتوي على α سينوكلين. بالإشارة إلى طريقة أسيتات الليثيوم القياسية (LiAc)11 ، قم بإعداد ست خلايا مختصة و 0.5 ميكروغرام من كل بلازميد ، وقم بإجراء التحويل.
  2. لاختيار محولات الخميرة التي تحتوي على البلازميدات ، استخدم الوسط الاصطناعي المحدد (وسط SD) بدون اليوراسيل (SD-Ura) ، واحتضان الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  3. قم بتصحيح ثلاث مستعمرات مفردة على صفيحة أجار SD-Ura لاختيار الخلايا التي تحتوي على البلازميدات لإجراء مزيد من التجارب.
    ملاحظة: للحصول على نتائج دقيقة وموثوقة ، قمنا بفحص ما لا يقل عن ثلاث نسخ بيولوجية لكل سلالة.

3. اكتشاف الفحص

ملاحظة: من المعروف أن التعبير عن α-synuclein الموسوم ب GFP في البلازميدات ذات العدد العالي يرتبط بالسمية الخلوية في الخميرة10.

  1. تلقيح محولات الخميرة المرقعة الثلاثة لكل سلالة إلى 3 مل من SRd-Ura للنمو الانتقائي للخميرة التي تحتوي على البلازميدات مع 2٪ رافينوز لتثبيط تحريض α-synuclein تحت محفز GAL1 و 0.1٪ جلوكوز. احتضان مزرعة الخلية عند 30 درجة مئوية تحت التحريك عند 200 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: من المهم تكرار جميع التجارب مع مستعمرات مختلفة. الحصول على نفس النتائج من أكثر من ثلاث مستعمرات مستقلة يعني أن النتيجة موثوقة.
  2. في اليوم التالي ، قم بتلقيح الخلايا المستزرعة طوال الليل في 3 مل من SRd-Ura الطازج إلى OD 600 من 0.2 ، واحتضانها لمدة 6 ساعات عند 30 درجة مئوية تحت التحريك عند200 دورة في الدقيقة.
  3. عندما يصل OD600 إلى 0.6-0.8 ، قم بتخفيف الخلايا في 96 لوحة بئر لفحص الإكتشاف على النحو التالي.
    1. قم بقياس OD 600 لجميع العينات ، وقم بتخفيف العينات إلى OD 600 من 0.5 باستخدام dH2O المعقم (الحجم المختلط هو100 ميكرولتر) في الحارة 1 من لوحة 96 بئرا لمعادلة عدد الخلايا في كل مزرعة.
    2. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية خمسة أضعاف لخلايا الخميرة عن طريق إضافة 160 ميكرولتر من dH2O المعقم إلى الممرات الخمسة التالية. تأكد من حجم إجمالي قدره 40 ميكرولتر عند تخفيف الخلايا بشكل متسلسل في كل حارة.
      ملاحظة: يمكن أن تؤدي عوامل التخفيف المنخفضة إلى اختلافات أكبر بين العينات. مطلوب ماصة كافية لضمان خلط موحد عند إجراء التخفيفات التسلسلية. يجب استبدال طرف الماصة عند كل نقطة تخفيف. خلاف ذلك ، يمكن نقل الخلايا المرتبطة بسطح الطرف إلى البئر التالي وتؤثر على رقم الخلية.
  4. استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 10 ميكرولتر من كل بئر لتحديد العينات على ألواح أجار SD-Ura لأدوات التحكم وألواح أجار SG-Ura لمراقبة السمية.
    ملاحظة: يجب تجفيف الألواح حتى يتم امتصاص العينات المرقطة بالكامل على الألواح.
  5. احتضان الأطباق المرقطة رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 4 أيام.
  6. التقط صورا للصفائح كل 24 ساعة حتى اليوم 4 ، ثم حلل البيانات من خلال مقارنة اختلافات النمو بين السلالات التي رصدتها العين. عد المستعمرات الفردية في العينة الأكثر تخفيفا ، أو احسب عدد الخلايا القابلة للحياة في الثقافة الأصلية لكل سلالة ، أو قارن حجم المستعمرات الفردية.

4. قياس نمو الخميرة باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة

  1. قم بتلقيح محولات الخميرة المرقعة الثلاثة لكل سلالة إلى 3 مل من SRd-Ura ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية تحت التحريك عند 200 دورة في الدقيقة طوال الليل.
    ملاحظة: لفهم كل نمط ظاهري مستعمرة من سلالة الخميرة المتوافقة مع البشر التي تعبر عن α-synuclein ، استخدم نفس المحولات لجميع التجارب.
  2. في اليوم التالي ، قم بتلقيح الخلايا المستزرعة طوال الليل في ما مجموعه 200 ميكرولتر من SD-Ura و SG-Ura الطازجة في 96 لوحة بئر. اضبط الحجم النهائي ، بما في ذلك الخلايا ، على 200 ميكرولتر ، واضبط الخلية الأولية OD600 إلى 0.05.
    1. اضبط إعدادات البرنامج في لوحة المعايرة الدقيقة على النحو التالي: اضبط درجة الحرارة المستهدفة على 30 درجة مئوية ، واضبط مدة الاهتزاز (الخطية) على 890 ثانية ، واضبط سعة الاهتزاز (الخطية) على 5 مم ، واضبط وقت الفاصل الزمني على 00:15:00 ، واضبط القياس على أنه امتصاص عند 600 نانومتر.
    2. احتضان اللوحة لمدة 2-3 أيام لجميع السلالات للوصول إلى المرحلة الثابتة في قارئ الصفيحة الدقيقة.
  3. قم بتحليل البيانات عن طريق رسم منحنى النمو (على سبيل المثال ، باستخدام المصنف). الحصول على نقاط البيانات عن طريق حساب متوسط قيم الامتصاص من التكرارات البيولوجية الثلاثة ، والإشارة إلى أشرطة الخطأ. استخدم قيمة الامتصاص من الوسائط فقط كعنصر تحكم ، واطرحها من القيم من الخلايا المستزرعة (اختياري).

5. المجهر مضان

  1. قم بتلقيح محولات الخميرة المرقعة إلى 3 مل من SRd-Ura ، وقم بزراعتها طوال الليل عند 30 درجة مئوية تحت التحريك عند 200 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: لتحديد ارتباط النمط الظاهري بالسمية الخلوية وتكوين البؤر ، استخدم نفس المستعمرات للتجربة.
  2. في اليوم التالي ، أعد تلقيح الخلايا المستزرعة طوال الليل إلى 3 مل من SRd-Ura الطازج إلىOD 600 من 0.003 . احتضان الاستزراع حتى يصل OD 600 إلى 0.2 عند 30 درجة مئوية تحت التحريك عند200 دورة في الدقيقة (~ 18 ساعة).
  3. عندما يتم تحقيق OD 600 من 0.2 ، أضف 300 ميكرولتر من 20٪ جالاكتوز ، ثم احتضن لمدة 6 ساعات أخرى عند 30 درجة مئوية تحت التحريك عند200 دورة في الدقيقة.
  4. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بمعدل 800 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 30 ميكرولتر من الماء المقطر.
  6. قم بتحميل 5 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها على زجاج منزلق. تحضير وسادة هلام agarose12 ووضعها على الخلايا المحملة لجعلها تنتشر بالتساوي.
  7. قم بإجراء التصوير المجهري بهدف 100x باستخدام كل من مرشحات برايت فيلد و GFP-fluorescence.
    1. أولا ، استخدم حقل ساطع لتركيز الخلية بهدف 100x باستخدام زيت الغمر. استخدم خيار التقاط الشاشة لإنشاء الصور باستخدام البرنامج.
    2. قم بالتبديل إلى مرشح مضان GFP. اضبط وقت تعريض الصورة إلى ما بين 50 مللي ثانية و 300 مللي ثانية للحصول على صورة واضحة من خلال موازنة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. التقاط الشاشة للصورة باستخدام البرنامج.
    3. صور العديد من الخلايا من نقاط متعددة بدلا من نقطة واحدة فقط.
  8. تحليل الصور عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على بؤر من مجاميع α-synuclein باستخدام البرامج التحليلية. لاحظ الاختلافات بين إشارة بروتين GFP القابلة للذوبان وإشارة GFP المكونة من بؤر ، وكذلك انتشار GFP مع شكل متغير A30P من α-synuclein.
    ملاحظة: سيتم ملاحظة تكوين البؤر مع المتغيرات البرية من النوع البري و E46K و A53T من α-synuclein.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المعروف أن التعبير العالي ل α-synuclein مرتبط بموت الخلايا العصبية و PD في الأنظمة النموذجية ل PD. تصف هذه الدراسة ثلاث طرق لمراقبة السمية الخلوية ل α-synuclein وتشكيل بؤر α-synuclein المجمعة في الخميرة. هنا ، تم التعبير عن α-synuclein بشكل مفرط في الخميرة ، وتم فحص الأنماط الظاهرية للنوع البري α-synuclein وثلاثة أنواع من α-synuclein المعروفة باسم الطفرات العائلية ل PD (الشكل 1 وجدول المواد).

أظهر تعبير α-synuclein تحت محفز GAL1 في ناق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا لتعقيد الأنظمة الخلوية المختلفة في البشر ، من المفيد استخدام الخميرة كنموذج لدراسة الأمراض التنكسية العصبية البشرية. على الرغم من أنه يكاد يكون من المستحيل التحقيق في التفاعلات الخلوية المعقدة للدماغ البشري باستخدام الخميرة ، من منظور خلية واحدة ، فإن خلايا الخميرة لديها مستوى عال من التشابه مع الخلايا البشرية من حيث تماثل التسلسل الجيني والعمليات الخلوية حقيقية النواةالأساسية 8,13. علاوة على ذلك ، نظرا لسهولة التلاعب الجيني ، يمكن للخميرة تسهيل دراسة الأنظم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جيمس باردويل وتياغو ف. أوتيرو على تفضلهما بمشاركة البلازميدات التي تحتوي على α-synuclein. تلقى Changhan Lee تمويلا من المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF) بتمويل من الحكومة الكورية (MSIT) (منحة 2021R1C1C1011690) ، وبرنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال NRF الممول من وزارة التعليم (منحة 2021R1A6A1A10044950) ، وصندوق أبحاث أعضاء هيئة التدريس الجديد بجامعة Ajou.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96 لوحة بئرSPL30096
AgaroseTAESHIN0158
Bacto AgarBD Difco214010
Breathe-easyمتنوع التكنولوجيا الحيويةBEM-1غشاء مانع للتسرب للغاز لألواح ميكروتيتر
تغطي النظاراتMarienfeld24 × 60 مم
أنبوب الثقافةSPL40014
Cuvetteratiolab2712120
D- (+) -GalactosesigmaG0625
D- (+) -GlucosesigmaG8270
D- (+) -Raffinose pentahydrateDaejung6638-4105
حاضنة (اهتزاز)Labtron: حاضنة SHI1
(ثابت)الرؤية العلميةالموديل: VS-1203PV-O
LiAcsigmaL6883
قارئ MicroplateTecan30050303 01الموديل: Infinite 200 pro
ماصة متعددة القنوات 20-200 & مايكرو ؛ ماصة LgilsonFA10011
متعددة القنوات 2-20 & micro; LgilsonFA10009
Olympus المجهرأوليمبوسIX-53
PEGسيجماP4338متوسط مول الوزن 3،350
PetridishSPL10090
pRS426كريستيانسون ، تي دبليو ، سيكورسكي ، آر إس ، دانتي ، إم ، شيرو ، جي إتش & أمبير Hieter ، P. ناقلات مكوكية متعددة الوظائف عالية النسخ عالية الخميرة. الجين. 110 (1) ، 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 < / em>promoter & alpha - synuclein A30POuteiro ، T. F. & amp Lindquist، S. توفر خلايا الخميرة نظرة ثاقبة لبيولوجيا ألفا سينوكلين وعلم الأحياء المرضي. علم. 302 (5651) ، 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1< / em> المروج & alpha synuclein A53TOuteiro ، T. F. & amp Lindquist، S. توفر خلايا الخميرة نظرة ثاقبة لبيولوجيا ألفا سينوكلين وعلم الأحياء المرضي. علم. 302 (5651) ، 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 < / em>promoter &alpha ؛ -synuclein E46KOuteiro ، T. F. & amp Lindquist، S. توفر خلايا الخميرة نظرة ثاقبة لبيولوجيا ألفا سينوكلين وعلم الأحياء المرضي. علم. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 < / em>promoter α-synuclein WTOuteiro, T. F. & amp; amp; Lindquist، S. توفر خلايا الخميرة نظرة ثاقبة لبيولوجيا ألفا سينوكلين وعلم الأحياء المرضي. علم. 302 (5651) ، 1772-1775 (2003)
الخزانSPL23050
مقياس الطيف الضوئيeppendorf6131 05560
W303aالحاضر من جيمس باردويل
قاعدة النيتروجين الخميرة بدون الأحماض الأمينيةDifco291940
الخميرة الاصطناعية التسرب من المكملات الغذائية بدون يوراسيلسيجماY1501
YPDCondalab1547.00
نموذج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
  2. Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
  3. Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
  4. Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
  5. Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).
  6. Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
  7. Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
  8. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  9. Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
  10. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
  11. Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. Methods in Yeast Genetics and Genomics. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Woodbury, New York. (2015).
  12. Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
  13. Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
  14. Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421(2019).
  15. Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
  16. Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15(2019).
  17. Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643(2021).
  18. Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease. PLoS One. 7 (6), 38545(2012).
  19. Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson's Disease. 2016, 1720621(2016).
  20. Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
  21. Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111(2020).
  22. Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
  23. Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Alpha Synuclein AggregationYeast ModelParkinson s DiseaseSynuclein ToxicityHumanized YeastProtein AggregationFluorescence MicroscopyWestern BlottingGenetic ScreeningSynaptic Vesicle Trafficking

مقالات ذات صلة