مطلوب نموذج فسيولوجي في الجسم الحي من α-synuclein لدراسة وفهم التسبب في مرض باركنسون. وصفنا طريقة لمراقبة السمية الخلوية والتكوين الكلي ل α-synuclein باستخدام نموذج الخميرة المتوافق مع البشر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة لدراسة سمية α-سينوكلين وتجميعها باستخدام نموذج خميرة متوافق مع البشر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مرض باركنسون هو ثاني أكثر الاضطرابات التنكسية العصبية شيوعا ويتميز بموت الخلايا التدريجي الناجم عن تكوين أجسام ليوي التي تحتوي على α سينوكلين غير مطوية ومجمعة. α-synuclein هو بروتين وفير قبل المشبكي ينظم الاتجار بالحويصلة المشبكية ، لكن تراكم شوائب البروتين يؤدي إلى سمية عصبية. كشفت الدراسات الحديثة أن العوامل الوراثية المختلفة ، بما في ذلك المرافقين البكتيريين ، يمكن أن تقلل من تكوين مجاميع α-synuclein في المختبر. ومع ذلك ، من المهم أيضا مراقبة التأثير المضاد للتجميع في الخلية لتطبيق هذا كعلاج محتمل للمرضى. سيكون من المثالي استخدام الخلايا العصبية ، ولكن يصعب التعامل مع هذه الخلايا وتستغرق وقتا طويلا لإظهار النمط الظاهري المضاد للتجميع. لذلك ، يلزم وجود أداة سريعة وفعالة في الجسم الحي لإجراء مزيد من التقييم لنشاط مكافحة التجميع في الجسم الحي. تم استخدام الطريقة الموصوفة هنا لمراقبة وتحليل النمط الظاهري المضاد للتجميع في الخميرة البشرية Saccharomyces cerevisiae ، والتي عبرت عن α synuclein البشري. يوضح هذا البروتوكول في الجسم الحي الأدوات التي يمكن استخدامها لرصد السمية الخلوية التي يسببها α سينوكلين ، وكذلك تكوين مجاميع α سينوكلين في الخلايا.
المقدمة
مرض باركنسون (PD) هو مشكلة خطيرة للمجتمعات الشيخوخة في جميع أنحاء العالم. يرتبط تجميع α-synuclein ارتباطا وثيقا بمرض باركنسون ، وتستخدم مجاميع البروتين من α-synuclein على نطاق واسع كعلامة حيوية جزيئية لتشخيص المرض1. α-synuclein هو بروتين حمضي صغير (140 من الأحماض الأمينية في الطول) مع ثلاثة مجالات ، وهي N-terminal ربط الدهون α-helix ، والمجال المركزي المرتبط بالأميلويد (NAC) ، والذيل الحمضيC-terminal 2. يمكن أن يحدث اختلال α-synuclein تلقائيا ويؤدي في النهاية إلى تكوين مجاميع أميلويد تسمى أجسام ليوي3. قد يساهم α-synuclein في التسبب في مرض باركنسون بعدة طرق. بشكل عام ، يعتقد أ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد وسائل الإعلام والحلول
- التحضير لوسائط الإعلام
- لتحضير وسط YPD ، قم بإذابة 50 جم من مسحوق YPD في dH2O لعمل حجم نهائي قدره 1 لتر. الأوتوكلاف للتعقيم. يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT).
- لجعل أجار YPD متوسطا ، قم بإذابة 50 جم من مسحوق YPD و 20 جم من أجار في 1 لتر من dH2O. الأوتوكلاف للتعقيم. بعد التبريد ، صب على أطباق بتري. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- لصنع SC مع وسط رافينوز (SRd) -Ura ، قم بإذابة 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة مع كبريتات الأمونيوم وبدون أحماض أمينية في 795 مل من dH2O. الأوتوكلاف للتعقيم. أضف 100 مل من 20٪ رافينوز ، و 5 مل من 20٪ جلوكوز ، و 100 مل من 10x -U....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
من المعروف أن التعبير العالي ل α-synuclein مرتبط بموت الخلايا العصبية و PD في الأنظمة النموذجية ل PD. تصف هذه الدراسة ثلاث طرق لمراقبة السمية الخلوية ل α-synuclein وتشكيل بؤر α-synuclein المجمعة في الخميرة. هنا ، تم التعبير عن α-synuclein بشكل مفرط في الخميرة ، وتم فحص الأنماط الظاهرية للنوع البري α-synuclein وثلاثة أنواع من α-synuclein المعروفة باسم الطفرات العائلية ل PD (الشكل 1 وجدول المواد).
أظهر تعبير α-synuclein تحت محفز GAL1 في ناق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نظرا لتعقيد الأنظمة الخلوية المختلفة في البشر ، من المفيد استخدام الخميرة كنموذج لدراسة الأمراض التنكسية العصبية البشرية. على الرغم من أنه يكاد يكون من المستحيل التحقيق في التفاعلات الخلوية المعقدة للدماغ البشري باستخدام الخميرة ، من منظور خلية واحدة ، فإن خلايا الخميرة لديها مستوى عال من التشابه مع الخلايا البشرية من حيث تماثل التسلسل الجيني والعمليات الخلوية حقيقية النواةالأساسية 8,13. علاوة على ذلك ، نظرا لسهولة التلاعب الجيني ، يمكن للخميرة تسهيل دراسة الأنظم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
نشكر جيمس باردويل وتياغو ف. أوتيرو على تفضلهما بمشاركة البلازميدات التي تحتوي على α-synuclein. تلقى Changhan Lee تمويلا من المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF) بتمويل من الحكومة الكورية (MSIT) (منحة 2021R1C1C1011690) ، وبرنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال NRF الممول من وزارة التعليم (منحة 2021R1A6A1A10044950) ، وصندوق أبحاث أعضاء هيئة التدريس الجديد بجامعة Ajou.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 96 لوحة بئر | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | متنوع التكنولوجيا الحيوية | BEM-1 | غشاء مانع للتسرب للغاز لألواح ميكروتيتر |
| تغطي النظارات | Marienfeld | 24 × 60 مم | |
| أنبوب الثقافة | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D- (+) -Galactose | sigma | G0625 | |
| D- (+) -Glucose | sigma | G8270 | |
| D- (+) -Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| حاضنة (اهتزاز) | Labtron | : حاضنة SHI1 | |
| (ثابت) | الرؤية العلمية | الموديل: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| قارئ Microplate | Tecan | 30050303 01 | الموديل: Infinite 200 pro |
| ماصة متعددة القنوات 20-200 & مايكرو ؛ ماصة L | gilson | FA10011 | |
| متعددة القنوات 2-20 & micro; L | gilson | FA10009 | |
| Olympus المجهر | أوليمبوس | IX-53 | |
| PEG | سيجما | P4338 | متوسط مول الوزن 3،350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | كريستيانسون ، تي دبليو ، سيكورسكي ، آر إس ، دانتي ، إم ، شيرو ، جي إتش & أمبير Hieter ، P. ناقلات مكوكية متعددة الوظائف عالية النسخ عالية الخميرة. الجين. 110 (1) ، 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 < / em>promoter & alpha - synuclein A30P | Outeiro ، T. F. & amp Lindquist، S. توفر خلايا الخميرة نظرة ثاقبة لبيولوجيا ألفا سينوكلين وعلم الأحياء المرضي. علم. 302 (5651) ، 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1< / em> المروج & alpha synuclein A53T | Outeiro ، T. F. & amp Lindquist، S. توفر خلايا الخميرة نظرة ثاقبة لبيولوجيا ألفا سينوكلين وعلم الأحياء المرضي. علم. 302 (5651) ، 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 < / em>promoter &alpha ؛ -synuclein E46K | Outeiro ، T. F. & amp Lindquist، S. توفر خلايا الخميرة نظرة ثاقبة لبيولوجيا ألفا سينوكلين وعلم الأحياء المرضي. علم. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 < / em>promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & amp; amp; Lindquist، S. توفر خلايا الخميرة نظرة ثاقبة لبيولوجيا ألفا سينوكلين وعلم الأحياء المرضي. علم. 302 (5651) ، 1772-1775 (2003) | ||
| الخزان | SPL | 23050 | |
| مقياس الطيف الضوئي | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | الحاضر من جيمس باردويل | ||
| قاعدة النيتروجين الخميرة بدون الأحماض الأمينية | Difco | 291940 | |
| الخميرة الاصطناعية التسرب من المكملات الغذائية بدون يوراسيل | سيجما | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
المراجع
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intrac....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
