يصف هذا البروتوكول منهجيات إنشاء عضويات ظهارية بطانة الرحم للفأر للتعبير الجيني والتحليلات النسيجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تبطن أنسجة بطانة الرحم التجويف الداخلي للرحم وتخضع للسيطرة الدورية للإستروجين والبروجستيرون. وهو نسيج يتكون من ظهارة لمعية وغدية ، ومقصورة انسجة ، وشبكة أوعية دموية ، ومجموعة معقدة من الخلايا المناعية. كانت نماذج الفئران أداة قوية لدراسة بطانة الرحم ، وكشفت عن الآليات الحاسمة التي تتحكم في الزرع والمشيمة والسرطان. يقدم التطور الأخير للثقافات العضوية البطانية 3D نموذجا حديثا لتشريح مسارات الإشارات التي تكمن وراء بيولوجيا بطانة الرحم. يعد إنشاء عضويات بطانة الرحم من نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، وتحليل نسخها ، وتصور مورفولوجيتها بدقة خلية واحدة أدوات حاسمة لدراسة أمراض بطانة الرحم. تحدد هذه الورقة طرق إنشاء ثقافات 3D لظهارة بطانة الرحم من الفئران وتصف تقنيات لتحديد التعبير الجيني وتحليل أنسجة الكائنات العضوية. الهدف هو توفير مورد يمكن استخدامه لإنشاء وزراعة ودراسة التعبير الجيني والخصائص المورفولوجية للعضويات الظهارية البطانية.
المقدمة
بطانة الرحم - النسيج المخاطي المبطن الداخلي لتجويف الرحم - هي نسيج فريد وديناميكي للغاية يلعب أدوارا حاسمة في الصحة الإنجابية للمرأة. خلال العمر الإنجابي ، يحمل بطانة الرحم القدرة على الخضوع لمئات الدورات من الانتشار والتمايز والانهيار ، بتنسيق من العمل المتضافر لهرمونات المبيض - الاستروجين والبروجستيرون. كشفت الدراسات التي أجريت على الفئران المعدلة وراثيا عن آليات بيولوجية أساسية تدعم استجابة بطانة الرحم للهرمونات والتحكم في زرع الجنين ، ونزع الخلايا اللحمية ، والحمل1. ومع ذلك ، كانت الدراسات في المختبر محدودة بسبب الصعوبات في الحفاظ على أنسجة بطانة الرحم الأولية غير المحولة للفأر في مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء التعامل مع الفئران والدراسات التجريبية بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لكلية بايلور للطب والمبادئ التوجيهية التي وضعها دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.
1. عزل ظهارة الرحم من الفئران باستخدام الطرق الأنزيمية والميكانيكية
ملاحظة: يصف هذا القسم الخطوات المطلوبة لإنشاء عضويات بطانة الرحم الظهارية ومرورها وتجميدها وإذابتها من الفئران باستخدام سقالة مصفوفة هلامية. وقد حددت الدراسات السابقة أن الثقافات المثلى من عضويات بطانة الرحم الفئران يتم تأسيسها من الفئران خلال مرحلة شبق4 ، والتي يمكن تحدي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
صور تباين المرحلة من عضويات بطانة الرحم الماوس
أنشأنا عضويات من ظهارة بطانة الرحم للفأر WT ، كما هو موضح في البروتوكول المرفق (انظر الرسم البياني في الشكل 1). بعد التفكك الأنزيمي لظهارة بطانة الرحم للفأر ، تم فصل الصفائح الظهارية ميكانيكيا عن الخلايا اللحمية الرحمية وفصلها عن كولاجيناز لتوليد تعليق أحادي الخلية. إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، يجب أن تسفر طريقة فصل الخلايا الظهارية واللحمية هذه عن عينات ملوثة لا تزيد عن 10٪ -15٪ من نوع الخلية المعاكسة (انظر صور التألق المناعي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، نصف طرق توليد عضويات ظهارية بطانة الرحم من بطانة الرحم للفأر والبروتوكولات المستخدمة بشكل روتيني لتحليلها في المراحل النهائية. تعتبر عضويات بطانة الرحم أداة قوية لدراسة الآليات التي تتحكم في الأمراض المرتبطة ببطانة الرحم ، مثل التهاب بطانة الرحم وسرطان بطانة الرحم وفشل الزرع. ذكرت الدراسات التاريخية المنشورة في عام 2017 عن ظروف زراعة الثقافات طويلة الأجل والمتجددة من عضويات بطانة الرحم من الفئران والظهارة البشرية 4,5. على الرغم من أن المواد العضوية قد استخد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
نشكر الدكتورة ستيفاني بانجاس والدكتور مارتن إم ماتزوك (M.M.M.) على القراءة النقدية وتحرير مخطوطتنا. تم دعم الدراسات من قبل منح معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية R00-HD096057 (DM) و R01-HD105800 (DM) و R01-HD032067 (M.M.M.) و R01-HD110038 (M.M.M.) ، ومنحة دعم مركز السرطان NCI- P30 (NCI-CA125123). ديانا مونسيفيس ، دكتوراه حاصلة على جائزة الحمل من الجيل التالي من صندوق بوروز ويلكوم.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>صياغة الوسائط العضوية< قوي> | |||
| قوي<قوي>الاسم | <قوي>الشركة | <قوي>رقم الكتالوج | <قوي>التركيز النهائي |
| مصفوفة غشاء القاعدة لعامل نمو Corning Matrigel (GFR) ، * | كورنينج | 354230 | 100٪ |
| التربسين من البنكرياس البقري | سيجما ألدريتش | T1426-1G | 1٪ |
| Advanced DMEM / F12 | Life Technologies | 12634010 | مكمل 1X |
| N2 | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27 & trade ؛ مكمل غذائي (50X) ، ناقص فيتامين أ | Life | Technologies 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 & micro ؛ جم / مل |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 ملي مولار |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 ملي |
| نيكوتيناميد | سيجما ألدريتش | N0636-100G | 10 نانومتر |
| ALK-4 ، -5 ، -7 مثبط ، A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| مؤتلف بشري EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 نانوغرام / مل |
| المؤتلف البشري Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 نانوغرام / مل |
| مؤتلف الإنسان Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 نانوغرام / مل |
| مؤتلف الإنسان FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 نانوغرام / مل |
| مؤتلف HGF | Peprotech | 100-39 | 50 نانوغرام / مل |
| WNT3a | R & أنظمة D | 5036-WN | 200 نانوغرام / مل |
| <قوي>الإمدادات والكواشف الأخرى < / قوي > | |||
| < قوي > الاسم < / قوي > | < قوي > الشركة < / قوي > | < قوي > رقم الكتالوج < / قوي > | < قوي > التركيز النهائي < / قوي > |
| كولاجيناز من المطثية الأنسجة | سيجما ألدريتش | C0130-1G | 5 مجم / مل |
| Deoxyribonuclease I من البنكرياس البقري | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 مجم / مل |
| DPBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS ، بدون كالسيوم ، خال من المغنيسيوم | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon & nbsp ؛ ألواح البوليسترين الدقيقة (24 بئر) | فيشر العلمي | # 08-772-51 | |
| فالكون ؛ ألواح البوليسترين الدقيقة (12 بئر) | فيشر العلمية | # 0877229 | |
| مصافي خلايا الصقر ، 40 & ميكرو ؛ م | فيشر العلمي | # 08-771-1 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep (50 & micro ؛ ز) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| كاشف Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM / F-12 ، HEPES ، لا يحتوي على الفينول الأحمر | ThermoFisher | 11039021 | |
| مصل الأبقار الجنيني ، تجريد الفحم | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2٪ |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 نانومتر |
| الفورمالديهايد 16٪ في الماء الحل ، EM Grade | VWR | 15710 | 4٪ |
| Epredia Cassette 1 أشرطة الأنسجة المشقوقة | فيشر Scientific | 1000961 | |
| Epredia قوالب قاعدة التضمين المصنوعة من الفولاذ المقاوم | Fisher Scientific | 64-010-15 ؛ | |
| الإيثانول ، 200 دليل (100٪) | فيشر Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| أكياس خزعة من النايلون Epredia | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel هلام معالجة العينات | VWR | 83009-992 | |
| حل Hematoxylin Premium | VWR | 95057-844 | |
| محلول Eosin Y (مصفر) Premium | VWR | 95057-848 | |
| TBS Buffer ، 20X ، درجة الحموضة 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X) ، درجة الحموضة 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| حامض الستريك ؛ | سيجما ألدريتش | C0759-1KG | |
| سترات الصوديوم ثلاثية القاعدة ثنائي الهيدرات | سيجما ألدريتش | S4641-500G | |
| Tween20 | فيشر Scientific | BP337-500 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3٪ |
| محلول DAPI (1 مجم / مل) | ThermoFisher | 62248 | 1: 1000 التخفيف |
| VECTASHIELD مضاد للتلاشي تصاعد مختبرات ناقلات متوسطة | H-1000-10 | ||
| طلاء الأظافر الشفاف | فيشر NC1849418 | ||
| فيشربراند سوبر فروست بلس شرائح مجهر | فيشر نظارات الغطاء الصغير Scientific | 22037246 | |
| VWR | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 الأجسام المضادة (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 التخفيف |
| خلية | Vimentin Antobody | 5741S | 1: 200 تخفيف |
| الحمار المضاد للفئران IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-21209 | 1:250 تخفيف |
| الحمار المضاد IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21206 | 1:250 التخفيف |
| ZEISS Stemi 508 ستيريو مجهر | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 مجهر روتيني مقلوب مع كاميرا رقمية | ZEISS | ||
| strong>Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | |
| _Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| لاكتوفيرين (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTCTCATCTCGTTC | |
| البروجسترون (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATTTCCGG | |
| Glyceraldehyde 3 نازعة هيدروجين الفوسفات (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTCTT |
المراجع
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
- Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biol....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
