مقالة منهجية

الهندسة المجهرية 3D الكولاجين الهلاميات المائية مع محاذاة الألياف طويلة المدى

DOI:

10.3791/64457

⸱

سبتمبر 7, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول استخدام قناة الموائع الدقيقة مع تغيير الهندسة على طول اتجاه تدفق السوائل لتوليد إجهاد ممتد (تمتد) لمحاذاة الألياف في هيدروجيل الكولاجين ثلاثي الأبعاد (سمك <250 ميكرومتر). تمتد المحاذاة الناتجة عبر عدة ملليمترات وتتأثر بمعدل الإجهاد الممتد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجه ألياف الكولاجين I (COL1) المحاذاة حركة الخلايا السرطانية ، وتؤثر على مورفولوجيا الخلايا البطانية ، وتتحكم في تمايز الخلايا الجذعية ، وهي سمة مميزة لأنسجة القلب والعضلات والعظام. لدراسة استجابة الخلايا للبيئات الدقيقة المحاذاة في المختبر ، تم تطوير العديد من البروتوكولات لتوليد مصفوفات COL1 مع محاذاة الألياف المحددة ، بما في ذلك الطرق المغناطيسية والميكانيكية والقائمة على الخلايا والموائع الدقيقة. من بين هذه الأساليب ، توفر مناهج الموائع الدقيقة قدرات متقدمة مثل التحكم الدقيق في تدفقات السوائل والبيئة المكروية الخلوية. ومع ذلك ، فإن مناهج الموائع الدقيقة لتوليد مصفوفات COL1 المحاذاة لمنصات الزراعة المتقدمة في المختبر قد اقتصرت على "الحصير" الرقيقة (<40 ميكرومتر في السماكة) من ألياف COL1 التي تمتد على مسافات أقل من 500 ميكرومتر ولا تفضي إلى تطبيقات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. هنا ، نقدم بروتوكولا لتصنيع مصفوفات 3D COL1 (بسمك 130-250 ميكرومتر) مع مناطق مقياس ملليمتر من محاذاة الألياف المحددة في جهاز الموائع الدقيقة. توفر هذه المنصة قدرات متقدمة لزراعة الخلايا لنمذجة البيئات الدقيقة للأنسجة المهيكلة من خلال توفير الوصول المباشر إلى المصفوفة المهندسة الدقيقة لزراعة الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجد الخلايا في شبكة ليفية ثلاثية الأبعاد معقدة تسمى المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، ويتكون الجزء الأكبر منها من الكولاجين البروتيني الهيكلي من النوع الأول (COL1) 1,2. توفر الخصائص الفيزيائية الحيوية ل ECM إشارات إرشادية للخلايا ، واستجابة لذلك ، تعيد الخلايا تشكيل العمارة الدقيقة ECM3،4،5. يمكن أن تؤدي هذه التفاعلات المتبادلة بين مصفوفة الخلايا إلى محاذاة مجالات ألياف COL16 التي تعزز تكوين الأوعية الدموية وغزو الخلايا في بيئة الورم7،....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع القناة المكونة من قطعتين وقاعدة المنصة المعيارية

ملاحظة: يتم إنشاء قناة الموائع الدقيقة باستخدام جزأين - قناة الموائع الدقيقة "انقطاع" ، وهي عبارة عن شفرة حلاقة مقطوعة من ورقة بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) بسماكة محددة ، وغطاء القناة ، الذي يرتبط بشكل عكسي بالانقطاع ويشكل القناة. القناة محاطة بإطار بولي (ميثيل ميثاكريلات) (PMMA) يعمل كخزان وسائط (الشكل 1). يمكن أيضا استخدام إطار PMMA لتثبيت الوحدات المتخصصة مغناطيسيا للحصول على وظائف إضافية.

  1. قنوات القطع الحلاقة:
    ملاحظة: يرد تصميم قناة الموائع الدقيقة لهذه الخطوة في الشكل التكميلي 1. تتكون القناة من خمسة....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عندما يتدفق محلول COL1 ذاتي التجميع عبر قناة ذات مساحة مقطعية متناقصة ، تزداد السرعة الانسيابية (v x) لمحلول COL1 محليا بمقدار ∂v x ، على طول الانقباض بين الجزأين (∂x) ، مما يؤدي إلى معدل إجهاد ممتد (ε̇) حيث ε̇ = ∂v x / ∂x. يمكن حساب معدل الإجهاد الممتد من سرعة السائل ، والتي يتم قياسها باستخدام قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV) ، كما هو موضح في الشكل 2.

في السابق ، ثبت أن الإجهاد الممتد المحلي يعزز محاذاة ألياف COL1 طويلة المدى

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف بروتوكولات توليد مصفوفات COL1 مع الألياف المحاذاة باستخدام الطرق المغناطيسية ، والتطبيق المباشر للإجهاد الميكانيكي ، وتقنيات الموائع الدقيقة47. تستخدم مناهج الموائع الدقيقة بشكل شائع لإنشاء أنظمة فسيولوجية دقيقة بسبب خصائص التدفق والنقل المحددة جيدا ، والتي تتيح التحكم الدقيق في البيئة الدقيقة البيوكيميائية. نظرا لأن ألياف COL1 المحاذاة توفر إشارات إرشادية رئيسية أثناء العمليات الفيزيولوجية المرضية مثل التئام الجروح وغزو الخلايا السرطانية وتطور الأنسجة ، فإن إنشاء مصفوفات COL1 المحاذاة في أ.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعهد الوطني للصحة بموجب رقم الجائزة R21GM143658 ومن قبل المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم 2150798. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية لوكالات التمويل.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان ، 99٪ (APTES)سيجما ألدريتش440140-100 مللي
20 مقياس من سلسلة تكنولوجيا المعلومات طرف الاستغناء بزاويةجنسن جلوبالJG-20-1.0-90
3/16 "ضياء. × 1/16 "مغناطيس مطلي بالنيكل سميكKJ MagneticsD31
3M (TC) 12X12-6-467MPDigiKey3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT &ge ؛ 99.5٪Signa Aldrich179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATMENTERمنتجات Electro-Technic12051A
ألبومين مصل البقر (BSA) ، الكسر V ، 98٪ ، درجة الكاشف ، Alfa AesarVWRAAJ64100-09
لوح أكريليك مصبوب شفافMcMaster-Carr8560K181
كورنينج 100 مل تريبسين 10x ، 2.5٪ تريبسين في HBSS [-] الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر وفيروس بارفو الخنازير تم اختبارهVWR45000-666
الكونتيسة الثانية عداد الخلايا الآليالحرارية فيشر AMQAX1000
برنامج CT-FIRELOCI - جامعة ويسكونسن
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit ، (CC-3156 & amp; CC-4176) ، Lonza CC-3162 ، 500 ملLonzaCC-3162
Glutaraldehyde 50٪ في محلول مائي ، درجة الكاشف ، التعبئة والتغليف = زجاجة HDPE ، الحجم = 100 ملVWRVWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50GraphtecCE LITE-50
HEPES (1 م)Thermo Fisher Scientific15-630-080
مطاط سيليكون عالي النقاء .010 بوصة سميكة ، 6 × 8 بوصة ورقة ، 55A مقياس التحملMcMaster-Carr87315K62
الخلايا البطانية للوريد السري البشريThermo Fisher ScientificC0035C
Invitrogen  Trypan Blue Stain (0.4٪)Thermo Fisher ScientificT10282
IsopropanolFisher ScientificA4154
قاطع ليزركامل الطيف20x12
H مضخات حقنة عصر جديدNE-1002X
Microman E ماصة أحادية القناة ، جيلسون ، موديل M1000EجيلسونFD10006
المجسات الجزيئية Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
المجسات الجزيئية Hoechst 33342 ، ثلاثي هيدروكلوريد ، ثلاثي الهيدراتالحرارية فيشر ScientificH3570
Nutragen Bovine Atelo CollagenAdvanced BioMatrix5010-50ML
Pbs (10x) ، درجة الحموضة 7.4VWR70011044.00
PBS درجة الحموضة 7.4ثيرمو فيشر العلمي10010049.00
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، 10x) ، مع Triton X-100Alfa AesarJ63521
ورقة حاملة بديلة لحرفة graphtec ROBO CC330L-20USCUTTERGRPCARSHTN
Restek Norm-Ject حقنة بلاستيكية 1 مل Luer SlipRestek22766.00
رقاقة جامعةرقاقة السيليكون452
هيدروكسيد الصوديوم ، ACS ، التعبئة والتغليف = زجاجة بولي ، الحجم = 500 جمVWRBDH9292-500G
Sylgard 184VWR102092-312
Thermo Scientific   ؛ بيرس 20x PBS توين 20ثيرمو فيشر العلمي28352.00
مضخة حقنة الموائع الدقيقة من سلسلة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4),....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Microfluidic Device3D Cell CultureCollagen I MatrixTumor MicroenvironmentEndothelial CellsPDMS ChannelMagnetic AlignmentCell Motility

مقالات ذات صلة