مقالة منهجية

تقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفأر

DOI:

10.3791/64459

⸱

سبتمبر 13, 2022

 ,  , 
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطأ في فصل الكروموسومات هو سمة شائعة في البويضات. لذلك ، فإن دراسة نقطة تفتيش تجميع المغزل تعطي أدلة مهمة حول الآليات اللازمة لإنتاج بيض صحي. يصف البروتوكول الحالي ثلاثة مقايسات تكميلية لتقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفئران.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختلال الصيغة الصبغية هو الشذوذ الوراثي الرئيسي الذي يسبب الإجهاض المبكر وفشل الحمل لدى البشر. تحدث معظم الأخطاء في فصل الكروموسومات التي تؤدي إلى اختلال الصيغة الصبغية أثناء الانقسام الميوزي في البويضات ، ولكن لماذا يكون الانقسام الاختزالي للخلايا البيضية عرضة للخطأ لا يزال غير مفهوم تماما. أثناء انقسام الخلايا ، تمنع الخلايا الأخطاء في فصل الكروموسومات عن طريق تنشيط نقطة فحص تجميع المغزل (SAC). تعتمد آلية التحكم هذه على اكتشاف مرفقات كينيتوخور (KT) - الأنابيب الدقيقة (MT) واستشعار التوتر الناتج عن ألياف المغزل. عندما تكون KTs غير متصلة ، يتم تنشيط SAC ويمنع تقدم دورة الخلية. يتم تنشيط SAC أولا بواسطة كيناز MPS1 ، والذي يؤدي إلى تجنيد وتشكيل مجمع نقطة التفتيش الانقسامية (MCC) ، المكون من MAD1 و MAD2 و BUB3 و BUBR1. بعد ذلك ، ينتشر MCC في السيتوبلازم ويعزل CDC20 ، وهو منشط مركب / سيكلوسوم معزز للطور (APC / C). بمجرد أن تصبح KTs متصلة بالأنابيب الدقيقة ويتم محاذاة الكروموسومات في لوحة الطور ، يتم إسكات SAC ، ويتم إطلاق CDC20 ، ويتم تنشيط APC / C ، مما يؤدي إلى تدهور Cyclin B و Securin ، مما يسمح ببداية الطور. بالمقارنة مع الخلايا الجسدية ، فإن SAC في البويضات ليست فعالة لأن الخلايا يمكن أن تخضع للطور الانفصالي على الرغم من وجود KTs غير مرتبطة. إن فهم سبب كون SAC أكثر تساهلا وما إذا كان هذا التساهل هو أحد أسباب أخطاء فصل الكروموسومات في البويضات لا يزال بحاجة إلى مزيد من التحقيق. يصف البروتوكول الحالي التقنيات الثلاث لتقييم سلامة SAC بشكل شامل في بويضات الفئران. تتضمن هذه التقنيات استخدام نوكودازول لإزالة بلمرة MTs لتقييم استجابة SAC ، وتتبع إسكات SAC باتباع حركية تدمير Securin ، وتقييم توظيف MAD2 إلى KTs عن طريق التألق المناعي. تعمل هذه التقنيات معا على فحص الآليات اللازمة لإنتاج بويضات صحية من خلال توفير تقييم كامل لسلامة SAC.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختلال الصيغة الصبغية ، الذي ينشأ عن أخطاء في فصل الكروموسومات ، هو السبب الرئيسي للإجهاض المبكر ويرتبط ارتباطا وثيقا بالأخطاء في الانقسام الاختزالي1. يختلف الانقسام الميوزي عن الانقسام الميتوزي؛ لأنه يتكون من جولتين من الانقسام الخلوي دون تدخل خطوة تضاعف الحمض النووي (DNA). في الانقسام الميوزي الأول، تنفصل الكروموسومات المتماثلة بينما تظل الكروماتيدات الشقيقة معا. في البويضات ، تكون هذه الخطوة عرضة للخطأ ، مما يؤدي إلى إنتاج بيض اختلال الصيغة الصبغية2.

لمنع أخطاء فصل الكروموسومات ، تقوم معظم أنواع الخلايا بتنشيط آلية مراقبة توقف دورة الخلية مؤقتا ، تسمى نقطة تفتيش تجميع المغزل (SAC). تستشعر ه....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إيواء جميع الفئران المستخدمة في هذه البروتوكولات وتربيتها وفقا للجنة جامعة روتجرز المؤسسية لاستخدام الحيوانات ورعايتها (البروتوكول 201702497) وإرشادات المعاهد الوطنية للصحة. وافقت هذه الهيئات التنظيمية على جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على دراسات على الحيوانات. كانت جميع الفئران المستخدمة في الدراسة الحالية من الإناث CF-1 البالغة من العمر 6-8 أسابيع.

1. التحضير التجريبي

  1. قبل البدء في تقييمات SAC ، اجمع بويضات الفئران باتباع التقرير المنشور مسبقا12. قسم البويضات المجمعة إلى ثلاث مجموعات متساوية الحجم واحتفظ بها في وسائط استزراع Chatot و Ziomek و Bavister (CZB) تحتوي على 2.5 ميكرومتر ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم استجابة SAC عن طريق علاج نوكودازول
الغرض من هذه التجربة هو تقييم تنشيط SAC وقوته. باستخدام نوكودازول لإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة المغزل ، سيتم فك جميع الحركية ، مما سيؤدي إلى توقف دورة الخلية بوساطة SAC. في نظام التصوير الحالي ، قامت بويضات التحكم المعالجة ب DMSO ببثق جسم قطبي بعد حوالي 14 ساعة من إطلاقه من ميلرينون (الشكل 1 ، الألواح العلوية). تمشيا مع تنشيط SAC ، تم القبض على البويضات المعالجة بالنوكودازول في الطور الاستوائي الأول ولم تقذف جسما قطبيا (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقطة تفتيش تجميع المغزل هي آلية تحكم حرجة أثناء انقسام الخلايا مصممة لمنع أخطاء فصل الكروموسومات. يسمح للخلية بالحصول على وقت كاف لتصحيح مرفقات KT-MT غير الصحيحة. الانقسام الاختزالي في البويضات هو عملية معرضة للخطأ ، حيث يحدث معظم الفصل الخاطئ للكروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي الأول ، مما يؤدي إلى توليد بويضات اختلال الصيغة الصبغية التي هي السبب الرئيسي للإجهاض المبكر والعقم عند البشر 1,24. يتم اختبار العديد من الفرضيات لفك تشابك سبب وجود أخطاء في الانقسام المي.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R35GM136340 إلى KS).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ألبومين مصل الأبقار (BSA)SigmaA4503
DAPILife TechnologiesD1306
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)SigmaD5879
الحمار المضاد للأرانب Alexa-568Life TechnologiesA10042
EVOS FL نظام التصوير التلقائيتقنياتالمجهر
الفلوريEVOS على خشبة المسرح حاضنةتقنيات الحياةغرفة حاضنة
زجاج القاع 96- ألواح البئر N 1.5 غير المطليةMatTek CorporationP96G-1.5-5-F
الماعز المضاد للإنسان Alexa-633Life TechnologiesA21091
HEPESSigmaH3537
الأجسام المضادةالبشرية المضادة ل ACAمدمجة 15-234التخفيف 1/30
ImageJNIH
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Leica SP8 مجهزة ب 63 مرة;, 1.40 NA هدف الغمر في الزيتLeica
MgSO4· 7H20SigmaM7774
MilrinoneSigmaM4659
Na2HPO4SigmaS2429
NaClSigmaS5886
NaN3SigmaS2002
NocodazoleSigmaM1404
بارافورمالهايد (PFA)SigmaP6148
PIPESSigmaP6757
Rabbit anti- MAD2Biolegend924601التخفيف 1/1000 ؛ سابقا Covance #PRB-452C
ReversineCayman Chemical10004412
Triton-XSigma274348
Tween-20SigmaX100
فيكتاشيلدناقلاتH-1000
الحياة مختبرات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MAD2

مقالات ذات صلة