مقايسة السحب إلى جانب التعبير المشترك في خلايا البكتيريا كأداة فعالة من حيث الوقت لاختبار التفاعلات الصعبة بين البروتين والبروتين

يستخدم السحب التقليدي على نطاق واسع لدراسة تفاعلات البروتين^{والبروتين 1}. ومع ذلك ، غالبا ما لا تتفاعل البروتينات النقية بشكل فعال في المختبر^2,3 ، وبعضها غير قابل للذوبان بدون شريكها^{الملزم 4,5}. قد تتطلب هذه البروتينات تجميعا متعديا مشتركا أو وجود مرافقين جزيئيين⁵،⁶،⁷،^8،9. هناك قيد آخر للسحب التقليدي وهو اختبار نشاط التعدد غير المتجانس المحتمل بين المجالات التي يمكن أن توجد كمتجانسات متجانسة مستقرة مجمعة بشكل مشترك⁸،^{10 ،} حيث لا يمكن للعديد منها الانفصال وإعادة الارتباط في المختبر خلال وقت الحضانة. وجد أن التعبير المشترك مفيد في التغلب على مثل هذه المشاكل ^3,11. تم استخدام التعبير المشترك باستخدام النواقل المتوافقة في البكتيريا بنجاح لتنقية المجمعات الجزيئية الكبيرة متعددة الوحدات الفرعية ، بما في ذلك المركب القمعي متعدد المشبك PRC2 12 ، وحدة رأس وسيط RNA polymerase^{II 13} ، صفيحة الأساس للبكتيريا T4¹⁴ ، وحدة deubiquitinylase المعقدة SAGA¹⁵،16 ^، والفيريتين¹⁷. أصول النسخ المتماثل المستخدمة بشكل شائع للتعبير المشترك هي ColE1 و p15A¹⁸ و CloDF13¹⁹ و RSF²⁰. في نظام التعبير Duet المتاح تجاريا ، يتم دمج هذه الأصول مع جينات مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية ومواقع استنساخ متعددة ملائمة لإنتاج ناقلات polycistronic ، مما يسمح بالتعبير عن ما يصل إلى ثمانية بروتينات. هذه الأصول لها أرقام نسخ مختلفة ويمكن استخدامها في مجموعات مختلفة لتحقيق مستويات تعبير متوازنة للبروتينات المستهدفة²¹. لاختبار تفاعلات البروتين والبروتين ، يتم استخدام علامات تقارب مختلفة ؛ الأكثر شيوعا هي 6xHistidine و glutathione-S-transferase (GST) وبروتين ربط المالتوز (MBP) ، ولكل منها تقارب محدد مع الراتنج المقابل. تعمل GST و MBP أيضا على تعزيز قابلية ذوبان واستقرار البروتينات الموسومة²².

كما تم تطوير عدد من الطرق التي تنطوي على التعبير المشترك للبروتين في الخلايا حقيقية النواة ، وأبرزها مقايسة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) ²³. اختبار Y2H رخيص وسهل ويسمح باختبار تفاعلات متعددة ؛ ومع ذلك ، يستغرق سير العمل أكثر من 1 أسبوع لإكماله. هناك أيضا عدد قليل من المقايسات القائمة على خلايا الثدييات الأقل استخداما ، على سبيل المثال ، مقايسة الفلورسنت ثنائية الهجين (F2H) ²⁴ ومقايسة تفاعل البروتين والبروتين في مجموعة الخلايا (CAPPIA) ²⁵. اختبار F2H سريع نسبيا ، مما يسمح بمراقبة تفاعلات البروتين في بيئتها الخلوية الأصلية ، ولكنه يتضمن استخدام معدات تصوير باهظة الثمن. كل هذه الطرق لها ميزة على التعبير بدائية النواة التي توفر الترجمة حقيقية النواة الأصلية وبيئة قابلة للطي. ومع ذلك ، فإنها تكتشف التفاعل بشكل غير مباشر ، إما عن طريق التنشيط النسخي أو عن طريق نقل الطاقة الفلورية ، والتي غالبا ما تنتج القطع الأثرية. أيضا ، قد تحتوي الخلايا حقيقية النواة على شركاء تفاعل آخرين للبروتينات ذات الأهمية ، والتي يمكن أن تتداخل مع اختبار التفاعلات الثنائية بين بروتينات حقيقيات النوى العليا.

تصف الدراسة الحالية طريقة للتعبير المشترك البكتيري للبروتينات الموسومة بشكل تفاضلي تليها تقنيات السحب التقليدية. تسمح هذه الطريقة بدراسة التفاعلات بين البروتينات المستهدفة التي تتطلب التعبير المشترك. إنه أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بالسحب التقليدي ، مما يسمح باختبار الدفعات لأهداف متعددة ، مما يجعله مفيدا في معظم الحالات. يعد التعبير المشترك باستخدام المتجهات المتوافقة أكثر ملاءمة من التعبير المشترك متعدد السيسترونيك لأنه لا يتطلب خطوة استنساخ شاقة.

يظهر التمثيل التخطيطي لسير عمل الطريقة في الشكل 1.

1. التحول المشترك للإشريكية القولونية

1. تحضير متجهات التعبير للبروتينات المستهدفة باستخدام طرق الاستنساخ القياسية.
   ملاحظة: عادة ما تكون نقطة البداية الجيدة هي استخدام نواقل pGEX / pMAL التقليدية التي تحمل جين مقاومة الأمبيسلين وأصل ColE1 للتعبير عن البروتينات الموسومة ب GST / MBP وناقل متوافق مع أصل p15A أو RSF ومقاومة الكانامايسين للتعبير عن البروتينات الموسومة ب 6xHis، في بعض الحالات مقترنة إما بثيوريدوكسين أو علامة SUMO لزيادة الذوبان. عادة ، يجب اختبار عدة مجموعات من العلامات قبل التجربة. الطريقة الموصوفة نفسها ملائمة لاختبار الدفعات لظروف التعبير عن البروتينات المستهدفة. من المهم ملاحظة أن معظم سلالات رشيد تحتوي بالفعل على البلازميد مع أصل p15A للتعبير عن tRNAs للكودون النادر ؛ وبالتالي إذا كان استخدام مثل هذه السلالات خيارا ممكنا ، فيجب تجنب البلازميدات p15A. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.
   1. تنمو البكتيريا من سلالة مناسبة في وسط Luria-Bertani (LB) عند 37 درجة مئوية إلى كثافة بصرية (OD) من 0.1-0.2. تم استخدام سلالة BL21 (DE3) كأمثلة في هذه الدراسة.
      ملاحظة: يوصى باستخدام خلايا مختصة معدة حديثا لتحقيق التحول المشترك الفعال مع متجهين. إذا كانت هناك حاجة إلى تحويل أكثر من متجهين ، فمن الأفضل تحويلهما بالتتابع لتحقيق كفاءة تحويل جيدة. التثقيب الكهربائي هو بديل جيد.
   2. جهاز طرد مركزي 1.0 مل من المعلق البكتيري لمدة دقيقة واحدة عند 9000 × جم عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
   3. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت لتحويل المخزن المؤقت البارد (TB) (10 mM MOPS [pH 6.7] ، 250 mM KCl ، 55 mM MnCl 2 ، و 15 mM CaCl₂) واحتضانها لمدة 10 دقائق على الجليد.
   4. أجهزة طرد مركزي لمدة 30 ثانية عند 8000 × جم عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
   5. أضف 100 ميكرولتر من محلول السل ، وأضف 100 نانوغرام من كل ناقل ، واحتضن لمدة 30 دقيقة على الجليد. تحويل النواقل المفردة بشكل منفصل لدراسة سلوك البروتين دون التعبير المشترك. بالإضافة إلى ذلك، التحويل المشترك لمتجهات التعبير في أزواج مع متجهات التعبير المشترك الفارغة لعناصر تحكم الربط غير المحددة.
      ملاحظة: في الأمثلة المقدمة في هذه الدراسة ، تم استخدام نواقل pGEX / pMAL مع cDNAs المقابلة المدمجة في GST / MBP cDNAs بالاشتراك مع ناقلات متوافقة مشتقة من pACYC تحمل مجالات بروتين شريك ترميز cDNA مدمجة في Thioredoxin cDNA.
   6. يسخن على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 150 ثانية ، ثم يبرد لمدة 1 دقيقة على الثلج.
   7. أضف 1 مل من السائل LB Media بدون مضادات حيوية واحتضانه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. لوحة على صفائح LB-agar تحتوي على 0.5٪ جلوكوز والمضادات الحيوية المقابلة (التركيزات الشائعة هي: 50 ملغم / لتر أمبيسلين ؛ 20 ملغ / لتر كاناميسين ؛ 50 ملغ / لتر ستربتومايسين ؛ 35 ملغ / لتر كلورامفينيكول). احتضان الأطباق طوال الليل على حرارة 37 درجة مئوية.

2. التعبير

1. اغسل الخلايا من الصفيحة ب 2 مل من وسائط LB السائلة إلى 50 مل من وسائط LB مع المضادات الحيوية المقابلة (التركيزات الشائعة هي: 50 مجم / لتر أمبيسيلين ؛ 20 مجم / لتر كاناميسين ؛ 50 مجم / لتر ستربتومايسين ؛ 35 مجم / لتر كلورامفينيكول). أضف أيونات المعادن أو غيرها من العوامل المساعدة المعروفة (في الأمثلة المقدمة في هذه الدراسة ، تمت إضافة 0.2 mM ZnCl₂ إلى الوسائط). قم بتخزين القسمة مع 20٪ من الجلسرين عند -70 درجة مئوية لتكرار التجربة لاحقا.
   ملاحظة: يوصى بطرد العديد من المستعمرات مباشرة من اللوحة لاستبعاد إمكانية التعبير السيئ في استنساخ واحد معزول بسبب أحداث إعادة التركيب العرضية بين اثنين من البلازميدات.
2. قم بتنمية الخلايا بدوران ثابت يبلغ 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية إلى OD من 0.5-0.7 ، وتبرد إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ، وأضف الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى 1 mM. قم بتخزين حصة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية كعنصر تحكم في العينة غير المستحثة.
3. احتضان الخلايا مع دوران ثابت من 220 دورة في الدقيقة عند 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: قد يختلف الوقت الأمثل ودرجة حرارة الحضانة. 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها يعمل بشكل أفضل لمعظم البروتينات وينصح بتجربتها افتراضيا. تقليل وقت الحضانة إلى 2-3 ساعات إذا لوحظ ارتباط قوي غير محدد.
4. قسم المعلق البكتيري إلى جزأين (أو أكثر إذا تم استخدام أكثر من علامتين مختلفتين) وقم بتخزين حصة 20 ميكرولتر من معلق الخلية لتأكيد تعبير البروتين. جهاز طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: نقطة التوقف: يمكن تخزين الكريات البكتيرية في -70 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.

3. مقايسة القائمة المنسدلة

ملاحظة: يتم وصف الإجراءات التفصيلية للبروتينات الموسومة إما ب 6xhis أو MBP / GST. يتم تنفيذ جميع الإجراءات عند 4 درجات مئوية.

1. أعد تعليق الكريات البكتيرية في 1 مل من محلول التحلل المثلج البارد مع مثبطات الأنزيم البروتيني وعوامل الاختزال (انظر أدناه) المضافة مباشرة قبل التجربة. تجنب ديثيوتريتول (DTT) عند استخدام راتنجات مخلبية معدنية لأنه يزيل أيونات المعادن. اضبط تركيبة المخزن المؤقت للبروتينات المختبرة. الوصفات الشائعة لمخازن التحلل التي تم العثور عليها مناسبة لمعظم البروتينات هي:
   1. 6xHis-pulldown: امزج 30 مللي مول HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 400 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول إيميدازول ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] جلسرين ، 5 مللي مول بيتا ميركابتوإيثانول ، 1 مللي متر فينيل ميثيل فولفونيل فلوريد (PMSF) ، وتخفيف 1: 1000 من كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد).
   2. GST- أو MBP-pulldown: امزج 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 150 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول KCl ، 10 مللي مول MgCl 2 ، 0.1 مللي مول ZnCl₂ ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] جلسرين ، 5 مللي متر DTT ، 1 مللي مول PMSF ، وتخفيف 1: 1000 من كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد).
2. تعطيل الخلايا عن طريق صوتنة على الجليد. تخزين حصص 20 ميكرولتر للكهربائي.
   ملاحظة: عادة ، يلزم 20-25 نبضة من 5 ثوان مع فترات 15 ثانية مع طاقة خرج 20 واط لكل عينة. يجب ضبط قوة الصوتنة المناسبة لكل أداة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة وضمان تعطيل الخلية بالكامل. لتحقيق أداء أفضل ، يوصى بشدة باستخدام مجسات صوتي متعددة الأطراف عالية الإنتاجية.
3. جهاز طرد مركزي عند 20000 × جرام لمدة 30 دقيقة. اجمع 20 ميكرولتر من المحللة الموضحة لتحليل SDS-PAGE اللاحق.
4. قم بموازنة الراتنج (50 ميكرولتر لكل عينة) مع 1 مل من محلول تحلل الثلج البارد لمدة 10 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
5. أضف محللات الخلايا (تركيز البروتين الكلي: 20-50 مجم / مل) إلى الراتنج ، واحتضانها لمدة 10 دقائق عند دوران ثابت يبلغ 15 دورة في الدقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية. اجمع 20 ميكرولتر من الكسر غير المنضم لتحليل SDS-PAGE اللاحق.
6. أضف 1 مل من محلول الغسيل المثلج والاحتضان لمدة دقيقة واحدة. أجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية. الوصفات الشائعة لمخازن الغسيل هي:
   1. 6xHis-pulldown: مزيج 30 مللي متر HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 400 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 30 مللي متر إيميدازول ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] الجلسرين ، و 5 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول.
   2. GST- أو MBP-pulldown: امزج 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 500 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول KCl ، 10 مللي مول MgCl 2 ، 0.1 مللي مول ZnCl₂ ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] الجلسرين ، و 5 مللي متر DTT.
7. قم بإجراء غسلتين طويلتين: أضف 1 مل من محلول الغسيل المثلج ، واحتضانه لمدة 10-30 دقيقة مع دوران ثابت يبلغ 15 دورة في الدقيقة ، وأجهزة طرد مركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
8. أضف 1 مل من محلول الغسيل المثلج ، واحتضانه لمدة دقيقة واحدة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
9. قم بإزالة البروتينات المرتبطة ب 50 ميكرولتر من محلول الشطف في شاكر عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. الوصفات الشائعة لمخازن الشطف هي:
   1. 6xHis-pulldown: امزج 30 مللي متر HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 400 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 300 مللي متر إيميدازول ، و 5 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول.
   2. سحب ضريبة السلع والخدمات: 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 150 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 50 مللي مول الجلوتاثيون (المعدل إلى الرقم الهيدروجيني 7.5 مع Tris الأساسي) ، و 5 مللي متر DTT.
   3. MBP-pulldown: امزج 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 150 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 40 مللي متر مالتوز ، و 5 مللي متر DTT.
10. تحليل البروتينات المستخلصة باستخدام SDS-PAGE.
    ملاحظة: يجب تعديل نسبة مادة الأكريلاميد حسب حجم البروتينات. في الأمثلة المقدمة في هذه الدراسة ، تم استخدام 12٪ من المواد الهلامية الأكريلاميد ، تعمل في محلول tris-glycine-SDS (2 mM Tris ، 250 mM Glycine ، 0.1٪ SDS) بجهد ثابت يبلغ 180 فولت. تم تلطيخ المواد الهلامية بالغليان في 0.2٪ Coomassie blue R250 ، و 10٪ حمض الخليك ، و 30٪ إيزوبروبانول ، وإزالة تلطيخها بالغليان في 10٪ حمض الأسيتيك. يجب ألا تكون كمية البروتين المحمل متساوية ، حيث يمكن سحب كميات مختلفة من البروتينات المتفاعلة في تجارب مختلفة.

تم استخدام الطريقة الموصوفة بشكل روتيني مع العديد من الأهداف المختلفة. تظهر هنا بعض النتائج التمثيلية التي من المحتمل ألا يمكن الحصول عليها باستخدام تقنيات السحب التقليدية. الأول هو دراسة DIMERIZATION محددة ZAD (المجال المرتبط بإصبع الزنك)11. تشكل ZADs ثنائيات مستقرة ومحددة ، مع إمكانية التغاير فقط بين المجالات ذات الصلة الوثيقة داخل المجموعات المتشابهة. الثنائيات التي تشكلها هذه المجالات مستقرة ولا تنفصل لبضعة أيام على الأقل ؛ وبالتالي ، فإن خلط ZADs المنقى لا ينتج عنه أي ربط يمكن اكتشافه. في الوقت نفسه ، يظهر التعبير المشترك ل MBP و Thioredoxin-6xHis-fused ZADs نشاطا جيدا وقابلا للتكرار (الشكل 2 أ) ، يظهر كنطاق إضافي في نتائج SDS-PAGE لمقايسة MBP-pulldown. يمكن رؤية جزء صغير من heterodimers مع M1BP معبرا عنها بشكل مشترك مع مجال آخر. لم يتم تأكيد هذا التفاعل مع Y2A وعلى الأرجح هو نتيجة لارتباط غير محدد بسبب ارتفاع تركيز البروتين ، لأن هذه المجالات غنية بالسيستين وعرضة للغاية للتجميع. والجدير بالذكر ، في هذه الحالة ، أن السحب 6xHis غير مناسب لأن ZADs هي مجالات تنسيق معدنية لا ترتبط على وجه التحديد بالراتنج المخلب المعدني. يجب فحص هذا النشاط بعناية في تجربة موازية.

مثال آخر هو اختبار المنافسة بين بروتين ENY2 وشركائه الملزمين Sgf11 (1-83aa) ومجال إصبع الزنك (460-631 aa) لبروتين CTCF26. عند التعبير عنه بمفرده ، يشكل بروتين ENY2 ثنائيات تمنعه من التفاعل مع شركائه الملزمين الأصليين. من المفترض أن كلا من بروتينات Sgf11 و CTCF ترتبط بنفس السطح الجزيئي ل ENY2 ، مما يجعل تفاعلها متعارضا. في مقايسة التعبير المشترك ، تفاعل ENY2 الموسوم 6xHisمع كل من Sgf11 و MBP-CTCF الموسوم بضريبة السلع والخدمات ، ولكن لم يكن GST-Sgf11 موجودا في عمليات سحب MBP والعكس صحيح ، (الشكل 2B). تشير هذه النتائج إلى أنه لا يمكن تشكيل مركب ثلاثي ، وأن التفاعلات يستبعد بعضها بعضا. تم تأكيد هذه البيانات بشكل مستقل مع فحوصات أخرى ودعم الأدوار الوظيفية المختلفة ل ENY2 في هذه المجمعات. يجب لفت الانتباه إلى حقيقة أن علامات التقارب الكبيرة يمكن أن تفرض عوائق صارمة في حد ذاتها ، مما يمنع التكوين المعقد ؛ لذلك ، لا ينبغي أن يستند الاستنتاج فقط إلى بيانات التعبير المشترك.

تظهر مقارنة خطوة بخطوة لسير عمل عمليات السحب التقليدية والمقترنة للتعبير المشترك في الشكل 3 أ. يعد الرسم المنسدل المقترن بالتعبير المشترك أكثر كفاءة من حيث الوقت مرتين على الأقل ، حتى مع وجود عدد صغير من العينات ، ويسمح بقابلية جيدة للتوسع. نتائج استخدام كلتا التقنيتين لدراسة نفس التفاعل بين مجال BTB لبروتين CP190 (1-126aa) والمجال الطرفي C الموسوم بضريبة السلع والخدمات (610-818aa) لبروتين ذبابة الفاكهة CTCF (dCTCF) موضحة في الشكل 3B. تظهر كلتا الطريقتين كفاءة جيدة وقابلية للتكرار (تم إجراء المقايسات في ثلاث نسخ متماثلة) ؛ في هذه الحالة ، أظهر الرسم المنسدل المقترن بالتعبير المشترك ارتباطا أقل غير محدد ، كما يمكن رؤيته في عينات التحكم مع بروتين GST وحده.

الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول. يوضح الرسم التخطيطي طريقة سير العمل المستخدمة في هذه الدراسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: النتائج التمثيلية . (أ) دراسة تجانس المجال المرتبط بإصبع الزنك (ZAD) في مقايسات MBP- و 6xHis-pulldown. تم دمج ZADs إما مع MBP (40 كيلو دالتون) أو مع 6xHis-Thioredoxin (20 كيلو دالتون) تم التعبير عنها بشكل مشترك في خلايا البكتيريا وتقارب منقى براتنج الأميلوز (يربط البروتينات الموسومة ب MBP) أو مع راتنج Ni-NTA (يربط البروتينات الموسومة 6xHis). تم تصور البروتينات المنقاة المشتركة باستخدام SDS-PAGE متبوعة بتلوين Coomasie. تظهر نتائج السحب MBP في اللوحات العلوية ، ونتائج السحب 6xHis-في الألواح السفلية (تستخدم فقط كتحكم في التعبير عن البروتين نظرا لأن العديد من ZADs ترتبط بشكل غير محدد ب Ni-NTA). (ب) دراسة التفاعلات الحصرية المتبادلة بين بروتينات ENY2 و Sgf11 / CTCF. تم التعبير عن Sgf11 (1-81aa) الموسومة بضريبة السلع والخدمات ، ومجال إصبع الزنك CTCF الموسوم ب MBP (460-631aa) ، وبروتينات ENY2 الموسومة ب 6xHis-His في مجموعات مختلفة وتقارب منقى براتنج الأميلوز أو راتنج الجلوتاثيون (يربط البروتينات الموسومة ب GST) أو مع راتنج Ni-NTA. تم تصور البروتينات المنقاة المشتركة باستخدام SDS-PAGE متبوعة بتلوين Coomasie. وقد عدل الشكل الوارد في اللوحتين ألف وباء بإذن من بونشوك وآخرين 11 وبونشوك وآخرون 26. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: مقارنة سير عمل مقايسات القائمة المنسدلة التقليدية والمقترنة. (أ) مقارنة خطوة بخطوة للفترات الزمنية المطلوبة في سير عمل مقايسة القائمة المنسدلة التقليدية مقارنة بالقائمة المنسدلة المقترنة بالتعبير المشترك. (ب) مقارنة بين تقنيتين مختلفتين للسحب في دراسة التفاعل بين المجال الطرفي C dCTCF (610-818aa) ومجال BTB لبروتين CP190 (1-126aa) في مقايسات سحب ضريبة السلع والخدمات. dCTCF (610-818aa) المنصهر مع GST (25kDa) أو GST وحده إما تم التعبير عنه بشكل مشترك في خلايا البكتيريا أو تم تحضينه في المختبر مع Thioredoxin-6xHis-Taged CP190 BTB وتقارب منقى براتنج الجلوتاثيون. يتم عرض ثلاث نسخ مكررة مستقلة لكل فحص. تم تصور البروتينات المنقاة المشتركة باستخدام SDS-PAGE متبوعة بتلوين Coomasie. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.