Method Article

تطبيق قياس تدفق الفيرميمتر لتحديد وتحليل ميكروبيوم الأمعاء Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans هو نموذج قوي لفحص المحددات الجزيئية التي تقود تفاعلات الميكروبيوم المضيف. نقدم خط أنابيب عالي الإنتاجية يحدد مستويات الواحد لاستعمار ميكروبيوم الأمعاء جنبا إلى جنب مع الجوانب الرئيسية لفسيولوجيا C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يكون لتكوين ميكروبيوم الأمعاء تأثير كبير على فسيولوجيا المضيف طوال فترة تطور وحياة. يعد قياس التغيرات التركيبية في الميكروبيوم أمرا بالغ الأهمية في تحديد العلاقات الوظيفية بين هذه التغيرات الفسيولوجية. برز Caenorhabditis elegans كنظام مضيف قوي لفحص الدوافع الجزيئية لتفاعلات الميكروبيوم المضيف. بفضل مخطط جسمه الشفاف والميكروبات الطبيعية الموسومة بالفلورسنت ، يمكن بسهولة قياس المستويات النسبية للميكروبات داخل ميكروبيوم الأمعاء لحيوان C. elegans الفردي باستخدام فارز جسيمات كبير. نصف هنا إجراءات الإعداد التجريبي للميكروبيوم ، وجمع وتحليل مجموعات C. elegans في مرحلة الحياة المرغوبة ، وتشغيل وصيانة الفرز ، والتحليلات الإحصائية لمجموعات البيانات الناتجة. نناقش أيضا اعتبارات تحسين إعدادات الفرز بناء على الميكروبات ذات الاهتمام ، وتطوير استراتيجيات بوابات فعالة لمراحل حياة C. elegans ، وكيفية الاستفادة من قدرات الفرز لإثراء مجموعات بناء على تكوين ميكروبيوم الأمعاء. سيتم تقديم أمثلة على التطبيقات المحتملة كجزء من البروتوكول ، بما في ذلك إمكانية قابلية التوسع للتطبيقات عالية الإنتاجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطور تحت تأثير ميكروبي مستمر1. من الميكروبات المتنوعة في البيئة ، يكتسب مضيفو شركاء محددين2 يوسعون قدرات المضيف ويقودون فسيولوجيته وقابليته للإصابة بالأمراض3. على سبيل المثال ، كشفت التحليلات الميتاجينومية لميكروبيوم الأمعاء عن فئات أيضية غنية للجينات الميكروبية التي قد تمنح قدرا أكبر من حصاد الطاقة وتخزينها في الفئران البدينة4 ، والتي يوجد الكثير منها أيضا في ميكروبيوم الأمعاءالبشرية 5. لا تزال هناك حاجة كبيرة لإقامة علاقات سببية وتحديد المحددات الجزيئية لتأثير الميكروبيوم ، على الرغم من إعاقة التقدم بسبب تعقيدات الميكروبيوم وق....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير خليط الميكروبيوم

  1. قم بختم أو إخراج البكتيريا من مخزون مجمد الجلسرين على طبق مرق الليزوجيني (LB) ، أو وسط نمو مناسب ، وتنمو طوال الليل عند درجة حرارة مثالية بناء على السلالات البكتيرية ذات الأهمية (عادة 25 درجة مئوية للميكروبات الطبيعية C. elegans ).
  2. من صفيحة LB ، استخدم مستعمرة واحدة من كل عزل بكتيري (على سبيل المثال ، 12 بكتيريا من مجموعة CeMbio) لتلقيح 800 ميكرولتر من وسط LB في آبار منفصلة من صفيحة بئر عميقة سعة 1 مل. احتضان بين عشية وضحاها في درجة الحرارة المثلى مع الهز عند 250 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع الميكروبات الطبيعية المحددة (على سبيل المثال ، CeMbio) ، ولكن يمكن تعدي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد بوابات السكان البالغين واليرقات
هنا ، تمت زراعة C. elegans L1s المتزامنة على صفيحة NGM المصنفة ب E. coli OP50 (Eco) ، وهو نظام غذائي مختبري قياسي. تم جمع مجموعات C. elegans لتحليل LPS بعد 96 ساعة أو 120 ساعة من النمو عند 20 درجة مئوية (الشكل 2 أ). مخطط نقطي للانقراض (EXT ، وكيل لكثافة الجسم) مقابل وقت الرحلة (TOF ، وكيل لطول الجسم) يخلق سحابتين منفصلتين بصريا من. تمثل كل نقطة واحدا حيث لوحظت قيم EXT و TOF أعلى من البالغين مقارنة باليرقات (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام قياس التدفق الدودي لتوصيف جينات C. elegans ومساراتها ضد استعمار مسببات الأمراض والسمية في العديد من الدراسات21،22. هنا ، يتم تقديم نهج قابل للتعديل عالي الإنتاجية يستخدم C. elegans للتحقيق في كيفية تعديل الميكروبات المعوية لفسيولوجيا مضيفها. بالمقارنة مع الطرق الحالية التي تستخدم وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) أو تسلسل amplicon 16S rRNA9،16،17،23،24.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة DP2DK116645 (إلى BSS) ، وجائزة مؤسسة Dunn التجريبية ومنحة NASA 80NSSC22K0250 (إلى BSS). تم دعم هذا المشروع أيضا من قبل مركز قياس الخلايا وفرز الخلايا في كلية بايلور للطب بتمويل من جائزة دعم المرافق الأساسية CPRIT (CPRIT-RP180672) ، والمعاهد الوطنية للصحة (S10 OD025251 و CA125123 و RR024574) ، ومساعدة جويل إم سيديرستروم ، بالإضافة إلى منحة الأجهزة لمنحة LPS NIH (S10 OD025251). تم توفير بعض السلالات من قبل CGC ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنابيب الطرد المركزي القاعية المخروطية سعة 15 ملVWR10026-076
96 لوحة بئر عميقة (1 مل)AxygenP-DW-11-C
96 لوحة بئر عميقة (2 مل)AxygenP-DW-20-C
96-well Costar لوحةCorning3694
AgarMillipore Sigmaالجراثيم أجار كاف أيضا.
مشعب الشفطV & P علميةVP1171A
التبييضكلوركس
محلول التبييض مزيج التبييض مع 5M هيبوكلوريت الصوديوم 2: 1 (v / v) تصوير
الخلية متعدد الأوضاع قارئBiotekCytation 5البكتيرية OD
قياس الطرد المركزيThermo Scientific  Sorvall Legend XTRل 96 لوحة جيدة وأنابيب مخروطية مجهر
فلورينيكونTiE
ggplot: أدوات برمجة R مختلفة لرسم البيانات.حزمة Rالإصدار 3.3.2
أخذ العينات الآلي للجسيمات الكبيرةBiometricaLP Sampler
اتحاد فارز الجسيمات الكبيرةBiometricaCOPAS Biosorter
LevamisoleFisherAC187870100
Lysogeny Broth (LB) RPIL24066Standard LB وصفات محلية الصنع باستخدام Bacto-tryptone ومستخلص الخميرة وكلوريد الصوديوم هي أيضا كاف.
حل M9 22 ملي مولار KH2PO4 أحادي القاعدة ، 42.3 ملي Na2HPO4 ، 85.6 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي ملي MgSO4
نمو الديدان الخيطية متوسطRPIN81800-1000.01 ملي مولار CaCl2 ، 25 ملي KPO4 درجة الحموضة 6.0 ، 1 ملي ملي MgSO4 مضاف بعد التعقيم.
RStudioGNUالإصدار 1.3.1093
هيبوكلوريت الصوديومSigma-Aldrich5M مجهر ستيريو
NaOH نيكونSMZ745
أطباق بتري معقمة بقطر 10 سم أطباقكورنينج351029
معقمة 12 بئراVWR10062-894
ألواح معقمة 24 بئراVWR10062-896
أطباق بتري معقمة بقطر 6 سمكورنينج351007
تريتون X-100سيجما ألدريتشT8787
قياسي وحدة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow VermimetryGut MicrobiomeCaenorhabditis ElegansMicrobiome QuantificationLarge Particle SorterFluorescent MicrobesGating StrategiesHigh Throughput AnalysisMicrobiome ColonizationHost Microbe Interactions

Related Articles