Method Article

تطبيق قياس تدفق الفيرميمتر لتحديد وتحليل ميكروبيوم الأمعاء Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans هو نموذج قوي لفحص المحددات الجزيئية التي تقود تفاعلات الميكروبيوم المضيف. نقدم خط أنابيب عالي الإنتاجية يحدد مستويات الواحد لاستعمار ميكروبيوم الأمعاء جنبا إلى جنب مع الجوانب الرئيسية لفسيولوجيا C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يكون لتكوين ميكروبيوم الأمعاء تأثير كبير على فسيولوجيا المضيف طوال فترة تطور وحياة. يعد قياس التغيرات التركيبية في الميكروبيوم أمرا بالغ الأهمية في تحديد العلاقات الوظيفية بين هذه التغيرات الفسيولوجية. برز Caenorhabditis elegans كنظام مضيف قوي لفحص الدوافع الجزيئية لتفاعلات الميكروبيوم المضيف. بفضل مخطط جسمه الشفاف والميكروبات الطبيعية الموسومة بالفلورسنت ، يمكن بسهولة قياس المستويات النسبية للميكروبات داخل ميكروبيوم الأمعاء لحيوان C. elegans الفردي باستخدام فارز جسيمات كبير. نصف هنا إجراءات الإعداد التجريبي للميكروبيوم ، وجمع وتحليل مجموعات C. elegans في مرحلة الحياة المرغوبة ، وتشغيل وصيانة الفرز ، والتحليلات الإحصائية لمجموعات البيانات الناتجة. نناقش أيضا اعتبارات تحسين إعدادات الفرز بناء على الميكروبات ذات الاهتمام ، وتطوير استراتيجيات بوابات فعالة لمراحل حياة C. elegans ، وكيفية الاستفادة من قدرات الفرز لإثراء مجموعات بناء على تكوين ميكروبيوم الأمعاء. سيتم تقديم أمثلة على التطبيقات المحتملة كجزء من البروتوكول ، بما في ذلك إمكانية قابلية التوسع للتطبيقات عالية الإنتاجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطور تحت تأثير ميكروبي مستمر1. من الميكروبات المتنوعة في البيئة ، يكتسب مضيفو شركاء محددين2 يوسعون قدرات المضيف ويقودون فسيولوجيته وقابليته للإصابة بالأمراض3. على سبيل المثال ، كشفت التحليلات الميتاجينومية لميكروبيوم الأمعاء عن فئات أيضية غنية للجينات الميكروبية التي قد تمنح قدرا أكبر من حصاد الطاقة وتخزينها في الفئران البدينة4 ، والتي يوجد الكثير منها أيضا في ميكروبيوم الأمعاءالبشرية 5. لا تزال هناك حاجة كبيرة لإقامة علاقات سببية وتحديد المحددات الجزيئية لتأثير الميكروبيوم ، على الرغم من إعاقة التقدم بسبب تعقيدات الميكروبيوم وقابلية الأنظمة المضيفة للفحص على نطاق واسع.

يوفر الكائن الحي النموذجي C. elegans منصة لتعزيز الفهم الجزيئي للروابط بين الميكروبيوم وفسيولوجيا المضيف. تمتلك C. elegans 20 خلية معوية ذات طبقة مخاطية وهياكل زغبية. تم تجهيز هذه الخلايا بجينات مستقبلات كيميائية وفيرة تستشعر المنتجات الميكروبية وتنتج جزيئات مضادة للميكروبات يحتمل أن تنظم مستعمرات الأمعاء 6,7. أدت هذه البيولوجيا المحفوظة ل C. elegans إلى عدد هائل من الاكتشافات في إشارات المضيف التي تنظم ميكروبات الأمعاء ، بما في ذلك إشارات الأنسولين ، TGF-beta ، و MAP Kinase8،9،10.

تستخدم C. elegans الميكروبات كنظام غذائي للنمو أثناء التطور والميكروبيوم كبالغين. مع الشيخوخة ، قد تتراكم بعض الميكروبات بشكل مفرط في تجويف الأمعاء وتتحول العلاقة بين المضيف والميكروب من التكافل إلى التسببفي المرض 11. في موائلها الطبيعية ، تواجه C. elegans مجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية12,13. كشف تسلسل 16S rDNA من العينات التمثيلية التي تم جمعها في الموائل الطبيعية (الفواكه الفاسدة ، وجذع النبات ، وناقلات) أن الميكروبيوم الطبيعي ل C. elegans تهيمن عليه أربع شعب بكتيرية: Proteobacteria و Bacteroidetes و Firmicutes و Actinobacteria. ضمن هذه التقسيمات يكمن تباين كبير في تنوع وثراء البكتيريا على أساس الموائل12،13،14،15. تم إنشاء العديد من المجتمعات المحددة ، بما في ذلك مجموعات 63 عضوا (BIGbiome) 16 و 12 عضوا (CeMbio) التي تمثل أفضل أجناس الميكروبيوم التي تم إنشاؤها لمجتمع أبحاث C. elegans 17. يمكن أن يكون لكل من الميكروبيوم وسلالات المكونات تأثير متنوع على فسيولوجيا C. elegans مثل حجم الجسم ومعدلات النمو واستجابات الإجهاد9،16،17. توفر هذه الدراسات موارد وأمثلة لتأسيس C. elegans كنموذج لأبحاث الميكروبيوم.

هنا يتم تقديم سير عمل قائم على فارز الجسيمات الكبير (LPS) (الشكل 1) يستخدم نظام C. elegans لقياس تكوين الميكروبيوم والمقاييس الأساسية لفسيولوجيا المضيف على نطاق السكان في وقت واحد. من الجانب الميكروبي ، فإن سير العمل قابل للتكيف لتجميع ميكروبيوم محدد أو ميكروبات مفردة لاختبار متانة ومرونة المجتمع مع زيادة التفاعلات الميكروبية. من جانب المضيف ، يتيح سير العمل فحوصات عالية الإنتاجية لقياس مستويات استعمار الميكروبات الفلورية في الميكروبيوم والقراءات الفسيولوجية للمضيف من حيث التطور وحجم الجسم والتكاثر. مجتمعة ، يتيح نموذج الميكروبيوم C. elegans شاشات عالية الإنتاجية لتحديد المحددات الأيضية والجينية التي تعدل فسيولوجيا المضيف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير خليط الميكروبيوم

  1. قم بختم أو إخراج البكتيريا من مخزون مجمد الجلسرين على طبق مرق الليزوجيني (LB) ، أو وسط نمو مناسب ، وتنمو طوال الليل عند درجة حرارة مثالية بناء على السلالات البكتيرية ذات الأهمية (عادة 25 درجة مئوية للميكروبات الطبيعية C. elegans ).
  2. من صفيحة LB ، استخدم مستعمرة واحدة من كل عزل بكتيري (على سبيل المثال ، 12 بكتيريا من مجموعة CeMbio) لتلقيح 800 ميكرولتر من وسط LB في آبار منفصلة من صفيحة بئر عميقة سعة 1 مل. احتضان بين عشية وضحاها في درجة الحرارة المثلى مع الهز عند 250 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع الميكروبات الطبيعية المحددة (على سبيل المثال ، CeMbio) ، ولكن يمكن تعديله بسهولة للميكروبات الفردية عن طريق النمو في ظل الظروف المناسبة أو أوعية الاستزراع الأخرى (الأنابيب).
  3. تقييم نمو كل ميكروب عن طريق القياس الطيفي. انقل قسمة 20 ميكرولتر إلى 80 ميكرولتر من LB وأضف المحلول إلى صفيحة مسطحة القاع شفافة ذات 96 بئرا. قم بقياس OD600 على قارئ اللوحة.
  4. بعد النمو بين عشية وضحاها ، قم بطرد مركزي صفيحة استزراع البئر العميقة عند 4000 × جم لمدة 10 دقائق لتكسير البكتيريا وإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط باستخدام مشعب شفط 96 بئرا أو ماصة متعددة القنوات.
  5. باستخدام قيم OD600 ، قم بتطبيع تركيز كل ميكروب إلى OD600 نهائي من 1.0 باستخدام وسيط M9 معقم.
  6. في حالة الجمع بين الميكروبات ، حدد كمية الثقافة البكتيرية اللازمة للتجربة وقم بإنشاء مزيج رئيسي من الميكروبيوم عن طريق الجمع بين أحجام متساوية من كل سلالة بكتيرية في أنبوب بحجم كاف (على سبيل المثال ، أنابيب 5 مل أو 15 مل).
  7. حدد 30-50 ميكرولتر من الميكروبات مع OD600 النهائي من 1.0 على مركز كل صفيحة تحتوي على أجار وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) أوالبئر 18. اسمح للميكروبيوم المصنف بالنمو بين عشية وضحاها عند درجة حرارة مثالية (25 درجة مئوية هنا).
    ملاحظة: قم بإعداد ألواح أجار NGM مسبقا وفقا للتعليمات الواردة في Wormbook أو باستخدام مسحوق NGM المخلوط مسبقا18. على سبيل المثال ، تتم إضافة 3 مل من NGM لألواح 12 بئر ، ويضاف 1.5 مل لألواح 24 بئر.

2. إعداد C. elegans متزامن للنمو على الميكروبيوم

  1. تنمو ما يقرب من 100 دودة على ألواح NGM (قطرها 6 سم) المصنفة مع الإشريكية القولونية OP50 ، حتى تصل الديدان إلى مرحلة البلوغ. لأغراض هذا البروتوكول ، تم استخدام سلالة C. elegans N2 ، على الرغم من أنه يمكن بسهولة تكييف البروتوكول مع سلالات الديدان الخيطية الأخرى.
  2. أضف 6 مل من المخزن المؤقت M9 (بالإضافة إلى 0.01٪ تريتون X-100 ؛ M9-TX) إلى اللوحة ، ماصة لأعلى ولأسفل لغسل ما يقرب من 100 دودة بالغة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  3. قم بإعداد محلول التبييض الطازج عن طريق خلط جزأين من المبيض مع جزء واحد من 5 M NaOH.
  4. أجهزة الطرد المركزي للديدان عند 3000 × جم لمدة 30 ثانية لتكوير الديدان. نضح لخفض مستوى الصوت إلى 4 مل ، ثم أضف 2 مل من محلول التبييض.
  5. أغلق الغطاء بإحكام وهز الأنبوب. راقب الديدان البالغة في المحلول تحت مجهر ستيريو بتكبير 10x. عندما تبدأ الأجسام البالغة في التفكك ، عادة بعد 3.5 دقيقة ، تتوقف عن الاهتزاز وأجهزة الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 30 ثانية.
  6. نضح إلى الحد الأدنى من حجم مع ماصة. قم بالتعليق والطرد المركزي ونضح أربع مرات في M9-TX لغسل المبيض.
  7. أعد التعليق في 4-6 مل من M9-TX وضع الأنبوب على دوار طوال الليل ، مما يسمح للبيض بالفقس والمزامنة في مرحلة L1.
  8. في اليوم التالي ، خذ 10 ميكرولتر من ديدان L1 في M9-TX من الأنبوب وأسقطها على طبق بتري نظيف. احسب عدد ديدان L1 الحية تحت مجهر ستيريو عند تكبير إجمالي 20x.
  9. بناء على كثافة L1 ، ماصة الحجم المناسب لإسقاط ~ 50 يرقات L1 متزامنة على حافة الميكروبيوم المصنف لوحات NGM واحتضانها عند 20 درجة مئوية. اسمح للديدان بالنمو حتى العمر المطلوب (اليوم 2 أو اليوم 3 من مرحلة البلوغ).

3. جمع أعداد الديدان لتحليل ميكروبيوم الأمعاء

  1. اغسل الديدان من العشب البكتيري ب 1-2 مل من M9-TX إلى صفيحة معقمة بعمق 2 مل 96 بئرا.
    ملاحظة: بالنسبة للسلالات الميكروبية التي تخلق أغشية حيوية كبيرة ، هز اللوحة بالسائل لمدة 5 دقائق لتفتيت الحطام الميكروبي.
  2. أجهزة الطرد المركزي لوحة البئر العميقة في 300 × غرام لمدة 1 دقيقة لبيليه الديدان, ثم إزالة السائل باستخدام مشعب الاستنشاق.
    ملاحظة: يمكن للمستخدمين استخدام ماصة متعددة القنوات لإزالة السائل يدويا في حالة عدم توفر مشعب شفاط. تأكد من أن أطراف الماصة لا تلمس قاع الآبار لتجنب فقدان عينات الديدان.
  3. أضف 1.8 مل من M9-TX إلى كل بئر من لوحة البئر العميقة باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 1.2 مل. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة أربع مرات لإزالة البكتيريا في السائل.
  4. بعد الغسيل النهائي ، ارفع الحجم في كل بئر إلى 100 ميكرولتر باستخدام مشعب الاستنشاق.
    ملاحظة: لفصل البالغين عن اليرقات باستخدام الجاذبية ، اترك اللوحة على المقعد لمدة 30-60 ثانية ، مما يسمح للديدان البالغة بالغرق في قاع البئر. ثم ، استنشاق اللوحة لإزالة اليرقات من التعليق.
  5. أضف 100 ميكرولتر من 10 مللي متر ليفاميزول في M9-TX إلى كل بئر واترك الديدان تشل لمدة 5 دقائق. بعد معالجة ليفاميزول ، أضف 4٪ من محلول التبييض الموصوف في الخطوة 2.3 إلى كل بئر لمدة دقيقتين لتقليل الكتل البكتيرية ، إذا لزم الأمر. يغسل باستخدام M9-TX مرتين بعد معالجة المبيض ونضح إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر بعد الغسيل الثاني.
  6. نقل الديدان إلى صفيحة مسطحة القاع 96 بئرا تحتوي على 150 ميكرولتر من ليفاميزول 10 مللي متر في M9-TX. حافظ على كثافة الدودة عند 50-100 لكل بئر وقسم الديدان إلى آبار متعددة إذا كان السكان مزدحمين للغاية.

4. إعداد فارز الجسيمات الكبير وأخذ العينات التلقائي

  1. قم بتشغيل ضاغط الهواء والكمبيوتر وأداة LPS. افحص وأفرغ خزان النفايات. ثم أضف 500 مل من المبيض إلى خزان النفايات الفارغ. افحص وأعد ملء الغلاف وخزانات المياه إذا كان الحجم منخفضا. تأكد من أن مجموعة النواة السائلة والبصرية (FOCA) التي تبلغ 250 ميكرومتر في مكانها.
  2. قم بتشغيل جزيئات التحكم لمراقبة الجودة. افتح برنامج أداة LPS. في نافذة البرنامج ، تحقق من تمكين الليزر لتشغيل ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر.
    ملاحظة: من الممكن تخطي الخطوات 4.2-4.5 إذا تم تشغيل جزيئات التحكم خلال الأسبوعين الماضيين ولم يتم تغيير FOCA في ذلك الوقت.
  3. حدد إعداد > التحكم في الجسيمات. حدد لا في المطالبة للانتقال إلى الإعدادات الافتراضية. دوامة جزيئات التحكم (10 مل dH2O و 10 مل جزيئات التحكم في أنبوب مخروطي 50 مل) قبل كل استخدام وتحميلها على منفذ العينة.
  4. عندما تكون جاهزا ، انقر فوق اكتساب لتسجيل 500 حدث. تأكد من أن معدل الحدث يقرأ بين 15-30 حدثا / أحداث.
    ملاحظة: إذا لم يكن معدل الحدث 15-30 حدثا / أحداثا ، فيجب الاتصال بمهندس لضبط إعدادات الماكينة.
  5. فحص معامل الاختلاف (CV) لجميع المعلمات. إذا < السيرة الذاتية 15٪ ، يتم تمرير مراقبة الجودة ويمكن إغلاق برنامج LPS. إذا > CV 15٪ ، فقم بتشغيله مرة أخرى واضبط الميكرومتر باستخدام جزيئات التحكم حديثة الصنع لمحاذاة الليزر مع خلية التدفق.
  6. قم بتوصيل وتشغيل أخذ العينات التلقائي. افتح برنامج أداة أخذ العينات التلقائي. يؤدي هذا إلى فتح جهاز أخذ العينات التلقائي وبرنامج LPS. في نافذة برنامج LPS ، انتقل إلى ملف > تجربة جديدة ثم ملف > نموذج جديد. حدد تمكين الليزر لتشغيل ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر إذا لم يتم ذلك بالفعل.
  7. قم بإنشاء قوالب لمخططات نقاط الاستحواذ باستخدام وقت الرحلة (TOF) والانقراض (EXT) وقنوات الفلورسنت في نافذة برنامج LPS. الحد الأقصى الجيد لالتقاط جميع الديدان هو 8000 ل TOF و EXT. ستختلف المقاييس الفلورية بناء على كل ميكروب. قم بتضمين عينات دودة التحكم المزروعة على ميكروب غير فلوري (على سبيل المثال ، OP50) وكل ميكروب فلوري بمفرده (في حالة خلط الميكروبات) كعناصر تحكم مع كل تجربة.
    1. انقر بزر الماوس الأيمن داخل نص الرسم البياني لتعديل القياس. استخدم التحكم مثل البالغين في اليوم الأول أو L1s المتزامنة (أو السكان محل الاهتمام) للمساعدة في اختيار بوابات TOF و EXT.
  8. في نافذة أخذ العينات التلقائي، حدد Prime. انتقل إلى ملف > افتح البرنامج النصي لتحديد البرنامج النصي المدمج الصحيح ، ثم انقر فوق موافق.
    1. للتحليل فقط، حدد البرنامج النصي باستخدام اكتساب. للفرز ، حدد البرنامج النصي باستخدام Dispense. للاقتناء من لوحات 96 بئرا ، حدد البرنامج النصي مع 96 بئرا ؛ للاقتناء من لوحات 384 بئرا ، حدد البرنامج النصي الذي يحتوي على 384 بئرا. بالنسبة لحجم العينة (40 أو 100 ميكرولتر) ، حدد البرنامج النصي مع وحدة التخزين المقابلة.
  9. انتقل إلى قالب اللوحة في قائمة برنامج أخذ العينات التلقائي لتحديد الآبار المطلوبة للتحليل. قم بتحميل عينات التحكم. بعد تحميل اللوحة على مرحلة أخذ العينات الأتوماتيكية وتثبيتها، اضغط على Run Plate في نافذة أخذ العينات الآلي. احفظ الملف عندما يطلب منك ذلك.
    ملاحظة: يمكن إجراء عينات التحكم والإعدادات باستخدام أنبوب مخروطي سعة 50 مل على منفذ عينة LPS قبل توصيل جهاز أخذ عينات LP.
  10. عند الانتهاء من الاستحواذ ، انقر فوق الزر Store Data في الشريط العلوي في نافذة برنامج LPS واحفظ البيانات مرة أخرى.

5. تحليل ميزات C. elegans ومستويات ميكروبيوم الأمعاء لكل

  1. يتم تخزين البيانات الأولية في ثلاثة أنواع من الملفات: .lmd و .bxr3 و .txt. قم بتحميل الملف النصي المسمى .txt الملف في برنامج R للتحليل. أكمل الخطوات أدناه في R19.
  2. استخدم الحزمة tidyverse20 كإطار عمل للتحليل.
  3. باستخدام الدالة ggplot (المضمنة في tidyverse) ، ارسم بيانات LPS باستخدام قيم TOF كمحور x وقيم EXT كمحور ص. ستظهر قطعة أرض عادية سحابتين من النقاط. تأكد من أن أحدهما قريب من الأصل والمحور السيني ، مما يشير إلى جزيئات أصغر مثل اليرقات والحطام الصغير والمجموعة الثانية من الجسيمات باتجاه الجزء العلوي الأيمن من المخطط وتمثل الديدان الخيطية البالغة.
  4. باستخدام هذا التجميع كدليل ، اختر قيم قطع TOF و EXT المناسبة. قد تختلف البوابات حسب سلالات C. elegans على الميكروبات المختلفة بناء على التغيرات في علم وظائف الأعضاء (على سبيل المثال ، قد تغير المظلمة مقابل الصافية أو التغيرات في نقل البيض معاملات EXT).
  5. استخدم المجموعة الفرعية للوظيفة لفصل البالغين واليرقات بواسطة بوابات TOF و EXT. في المثال هنا ، استخدم إعدادات TOF > 1,200 و EXT > 1,000 لبوابة البالغة.
  6. تحليل مجموعات البيانات الناتجة للاختلافات الإحصائية ؛ استخدم دالة t test في R لهذه التجربة.
    1. لتحديد تأثير الميكروبيوم على الحجم والكثافة البصرية ل C. elegans ، قارن قيم TOF و EXT ، على التوالي ، بين الظروف. TOF هو وكيل لحجم الدودة ويمكن أن يشير إلى التغيرات في معدلات نمو في أوقات محددة. تكون التغيرات EXT أكبر بين نهاية النمو والبلوغ بسبب الضوء المتناثر بواسطة البيض ويمكن استخدامها لتقييم التغيرات في توقيت هذا الانتقال والخصوبة. تقييم نسبة وتوزيعات النسل إذا تم الاحتفاظ بها أثناء التحليلات.
    2. لتحديد التغيرات في مستويات استعمار ميكروبيوم الأمعاء ، قم أولا بتطبيع قيم التألق (على سبيل المثال ، الأعمدة الحمراء أو الخضراء) عن طريق القسمة على قيم TOF الفردية لكل. مع نمو حجم الديدان وتصبح بالغة ، يزداد حجم أمعائها أيضا. يساعد التطبيع على تقليل القطع الأثرية من الاختلافات في توزيعات حجم العينة. استخدم الطبيعية لتقييم التغيرات في استعمار ميكروبيوم الأمعاء عبر الظروف.
      ملاحظة: يمكن العثور على مثال للبيانات الأولية ونصوص R المقابلة في الملف التكميلي 1 JOVE_worm_microbiome.txt والملف التكميلي 2 JOVE_worm_microbiome.r. انظر الشكل 2 والشكل 3 للحصول على مثال تمثيلي لهذه التحليلات للمضيف والميكروبيوم باستخدام اثنين من البكتيريا الفلورية.

6. فرز C. elegans حسب ميزات ميكروبيوم الأمعاء

  1. اجمع مجموعة C. elegans المزروعة على الميكروبات الموسومة بالفلورسنت (على سبيل المثال ، RFP) كما هو موضح في الخطوة 3. يجب وضع الديدان في أنابيب مخروطية سعة 50 مل بحد أدنى 5 مل من العينة. استهدف ما يقرب من 2000 دودة / مل بما في ذلك جميع البالغين والنسل.
    ملاحظة: يمكن القيام بذلك أيضا في لوحة مسطحة القاع 96 بئرا باستخدام جهاز أخذ العينات LP. الحفاظ على كثافة الدودة في 50-100 لكل بئر.
    1. إذا تم استخدام جهاز أخذ عينات LP ، فقم بإيقاف تشغيل جهاز أخذ عينات LP وفصله. أعد توصيل خطوط العينة والتطهير ب LPS قبل الفرز.
  2. افتح برنامج LPS ، وانتقل إلى ملف > تجربة جديدة ثم ملف > نموذج جديد. قم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام TOF على المحور السيني والانقراض على المحور ص. قم بإنشاء مخطط نقطي آخر باستخدام TOF على المحور السيني والأحمر على المحور ص. استخدم نفس مقياس المحور وإعدادات الليزر المستخدمة سابقا. تحقق من تمكين الليزر لتشغيل ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر
    ملاحظة: إذا تم إنشاء هذه المؤامرات مسبقا ، فانتقل إلى ملف > فتح التجربة وملف > فتح نموذج لتحميل الرسوم البيانية.
    1. ضع أنبوب عينة التحكم على منفذ العينة. في مربع الحوار اكتساب/الاستغناء انقر فوق اكتساب. احفظ الملف عندما يطلب منك ذلك. بعد قياس ما يكفي من الديدان لتمييز السكان انقر فوق إجهاض.
      ملاحظة: يجب أن تكون معدلات التدفق حوالي 15-30 حدثا / أحداث. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط تركيزات الدودة لضمان تحليل الفردية أو فرزها لكل قطرة. في LPS ، تمر الديدان عبر مسار الليزر في أوضاع مختلفة (مستقيمة مقابل كرة لولبية أو مثنية). يمكن أن يستغرقوا وقتا مختلفا لتمرير الليزر والكاشف حسب مواقعهم.
    2. في مؤامرة نقطة TOF مقابل الانقراض ، ارسم بوابة حول السكان البالغين. في مخطط TOF مقابل النقطة الحمراء ، ارسم بوابات حول المناطق ذات القيم الحمراء العالية والمنخفضة كمناطق ذات أهمية للديدان البالغة بمستويات مختلفة من استعمار الميكروبيوم. انتقل إلى عرض التسلسل الهرمي للبوابات > وتأكد من إدراج بوابات الفلورسنت ضمن بوابة السكان البالغين. بعد تحسين الإعدادات ، انتقل إلى ملف > حفظ التجربة وملف > حفظ عينة.
      ملاحظة: في المثال هنا ، حدد بناء على بوابات TOF / EXT للبالغين وقم بالفرز في حمامات تظهر إما استعمارا مرتفعا أو منخفضا مع بكتيريا حمراء معبرة عن البروتين الفلوري. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي مجموعة من المعلمات التي تم قياسها بواسطة LPS لتحديد السكان (السكان) موضع الاهتمام.
  3. قبل الفرز ، تأكد من تحميل جهاز التجميع المناسب. لتحميل لوحة 96 بئرا على جهاز التجميع، حدد تحميل اللوحة A > نقل تحت قسم مرحلة النقل في مربع الحوار اكتساب/توزيع للسماح لمرحلة التجميع بالانتقال إلى موضع مهيأ لتحميل لوحة 96 بئرا.
  4. للفرز بالجملة، حدد حجم الأنبوب المناسب وانقر فوق نقل لتحميل أنبوب مخروطي سعة 15 مل أو 50 مل. في قسم الفرز من مربع الحوار اكتساب/توزيع، اختر بوابة الفرز من القائمة المنسدلة للمناطق التي تم إنشاؤها. أدخل عدد الكائنات من المنطقة المحددة للتوزيع على أنبوب تجميع أسفل فوهة خلية التدفق مباشرة. انقر فوق الزر " فرز مجمع " ضمن مربع الحوار "اكتساب/توزيع".
  5. للاستغناء عن لوحة 96 بئرا ، انتقل إلى إعداد لوحات > > لوحات معايرة > لوحة 96 بئر. ثم انتقل إلى عرض قالب اللوحة > ، وحدد الآبار التي سيتم فرز الديدان إليها ، وأدخل عدد الكائنات المراد فرزها في كل بئر ، وحدد المناطق المسورة ذات الأهمية. إذا تم فرز أكثر من منطقة مسورة في نفس اللوحة ، فحدد المربع بوابة كل بئر. انقر فوق موافق لحفظ التغييرات.
  6. بعد تعيين أرقام الفرز والمواقع ، انقر فوق ملء اللوحة أزرار من مربع الحوار الحصول / الاستغناء لبدء الاستغناء عن لوحة 96 بئرا.
    1. قبل ملء اللوحة المكونة من 96 بئرا بالكامل ، قم بإجراء فرز تجريبي لمجموعة فرعية من أو عناصر التحكم في لوحة 96 بئرا وتحليلها باستخدام مجهر مجسم للتأكد من فرز الأعداد المناسبة ومجموعات المرغوبة. بمجرد تأكيد الفرز الدقيق ، كرر الخطوات 6.3-6.6 للعينات التجريبية. انقر فوق الزر Store Data في الشريط العلوي في نافذة برنامج LPS لحفظ البيانات مرة أخرى.
      ملاحظة: يمكن أيضا جمع جميع القياسات (EXT ، TOF ، RFP ، GFP ، إلخ) للحيوانات التي تم فرزها ومقارنتها بتلك التي لم يتم فرزها. يمكن أن يسمح ذلك بتشغيل أوضاع التحليل والفرز في نفس الوقت إذا رغبت في ذلك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد بوابات السكان البالغين واليرقات
هنا ، تمت زراعة C. elegans L1s المتزامنة على صفيحة NGM المصنفة ب E. coli OP50 (Eco) ، وهو نظام غذائي مختبري قياسي. تم جمع مجموعات C. elegans لتحليل LPS بعد 96 ساعة أو 120 ساعة من النمو عند 20 درجة مئوية (الشكل 2 أ). مخطط نقطي للانقراض (EXT ، وكيل لكثافة الجسم) مقابل وقت الرحلة (TOF ، وكيل لطول الجسم) يخلق سحابتين منفصلتين بصريا من. تمثل كل نقطة واحدا حيث لوحظت قيم EXT و TOF أعلى من البالغين مقارنة باليرقات (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام قياس التدفق الدودي لتوصيف جينات C. elegans ومساراتها ضد استعمار مسببات الأمراض والسمية في العديد من الدراسات21،22. هنا ، يتم تقديم نهج قابل للتعديل عالي الإنتاجية يستخدم C. elegans للتحقيق في كيفية تعديل الميكروبات المعوية لفسيولوجيا مضيفها. بالمقارنة مع الطرق الحالية التي تستخدم وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) أو تسلسل amplicon 16S rRNA9،16،17،23،24...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة DP2DK116645 (إلى BSS) ، وجائزة مؤسسة Dunn التجريبية ومنحة NASA 80NSSC22K0250 (إلى BSS). تم دعم هذا المشروع أيضا من قبل مركز قياس الخلايا وفرز الخلايا في كلية بايلور للطب بتمويل من جائزة دعم المرافق الأساسية CPRIT (CPRIT-RP180672) ، والمعاهد الوطنية للصحة (S10 OD025251 و CA125123 و RR024574) ، ومساعدة جويل إم سيديرستروم ، بالإضافة إلى منحة الأجهزة لمنحة LPS NIH (S10 OD025251). تم توفير بعض السلالات من قبل CGC ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنابيب الطرد المركزي القاعية المخروطية سعة 15 ملVWR10026-076
96 لوحة بئر عميقة (1 مل)AxygenP-DW-11-C
96 لوحة بئر عميقة (2 مل)AxygenP-DW-20-C
96-well Costar لوحةCorning3694
AgarMillipore Sigmaالجراثيم أجار كاف أيضا.
مشعب الشفطV & P علميةVP1171A
التبييضكلوركس
محلول التبييض مزيج التبييض مع 5M هيبوكلوريت الصوديوم 2: 1 (v / v) تصوير
الخلية متعدد الأوضاع قارئBiotekCytation 5البكتيرية OD
قياس الطرد المركزيThermo Scientific  Sorvall Legend XTRل 96 لوحة جيدة وأنابيب مخروطية مجهر
فلورينيكونTiE
ggplot: أدوات برمجة R مختلفة لرسم البيانات.حزمة Rالإصدار 3.3.2
أخذ العينات الآلي للجسيمات الكبيرةBiometricaLP Sampler
اتحاد فارز الجسيمات الكبيرةBiometricaCOPAS Biosorter
LevamisoleFisherAC187870100
Lysogeny Broth (LB) RPIL24066Standard LB وصفات محلية الصنع باستخدام Bacto-tryptone ومستخلص الخميرة وكلوريد الصوديوم هي أيضا كاف.
حل M9 22 ملي مولار KH2PO4 أحادي القاعدة ، 42.3 ملي Na2HPO4 ، 85.6 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي ملي MgSO4
نمو الديدان الخيطية متوسطRPIN81800-1000.01 ملي مولار CaCl2 ، 25 ملي KPO4 درجة الحموضة 6.0 ، 1 ملي ملي MgSO4 مضاف بعد التعقيم.
RStudioGNUالإصدار 1.3.1093
هيبوكلوريت الصوديومSigma-Aldrich5M مجهر ستيريو
NaOH نيكونSMZ745
أطباق بتري معقمة بقطر 10 سم أطباقكورنينج351029
معقمة 12 بئراVWR10062-894
ألواح معقمة 24 بئراVWR10062-896
أطباق بتري معقمة بقطر 6 سمكورنينج351007
تريتون X-100سيجما ألدريتشT8787
قياسي وحدة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
  3. Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
  5. Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
  6. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
  7. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
  8. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  9. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  10. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  11. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
  12. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  13. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  16. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  17. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
  19. R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
  20. Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
  21. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  22. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090(2014).
  23. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49(2012).
  24. Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
  25. Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877(2018).
  26. Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
  29. Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow VermimetryGut MicrobiomeCaenorhabditis ElegansMicrobiome QuantificationLarge Particle SorterFluorescent MicrobesGating StrategiesHigh Throughput AnalysisMicrobiome ColonizationHost Microbe Interactions

Related Articles