مقالة منهجية

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد للكشف المحدد عن الميكوبلازما الرئوية

DOI:

10.3791/64645

⸱

فبراير 24, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في عدوى الميكوبلازما الرئوية ، يمكن أن تؤدي اختبارات الأمصال إلى نتائج جيدة ، ولكن مع خصوصية منخفضة بسبب التفاعل المتقاطع المناعي. يضمن ELISA الذي يلتقط المستضد الداخلي ، الموصوف في هذه الورقة ، خصوصية عالية للأنواع وقد ثبت أنه اختبار فحص موثوق به للتشخيص الدقيق للمتفطرة الرئوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميكوبلازما الرئوية هي بدائية النواة التي تعاني من نقص جدار الخلية ، والمعروفة أساسا باستعمار الجهاز التنفسي البشري وأنها مستوطنة ، مع ذروة وبائية كل 6 سنوات ، في الأطفال الأكبر سنا والشباب. يمثل تشخيص المتفطرة الرئوية تحديا بسبب الطبيعة السريعة للممرض وإمكانية النقل بدون أعراض. لا يزال التشخيص المختبري لعدوى المتفطرة الرئوية على أساس معايرة الأجسام المضادة في عينات مصل المرضى هو الطريقة الأكثر ممارسة. بسبب المشكلة المحتملة للتفاعل المناعي المتبادل مع استخدام مصل متعدد النسيلة للمتفطرة الرئوية ، تم تطوير مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد (ELISA) لتحسين خصوصية التشخيص المصلي. يتم طلاء صفائح ELISA بأجسام مضادة متعددة النسيلة M. pneumoniae ، يتم تربيتها في الأرانب وتصبح محددة بعد الامتزاز ضد مجموعة من البكتيريا غير المتجانسة التي تشترك في المستضدات مع أنواع M. pneumoniae و / أو من المعروف أنها تستعمر الجهاز التنفسي . ثم يتم التعرف على المستضدات المتماثلة المتفاعلة M. pneumoniae على وجه التحديد من خلال الأجسام المضادة المقابلة لها في عينات المصل. أدى المزيد من التحسين للمعلمات الفيزيائية والكيميائية التي يتعرض لها ELISA لالتقاط المستضد إلى ELISA محدد للغاية وحساس وقابل للتكرار.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميكوبلازما هي من بين أصغر وأبسط بدائيات النوى المعروفة. تتميز بشكل أساسي عن البكتيريا الأخرى بعدم وجود بنية جدار الخلية. وهكذا ، تم تصنيف الميكوبلازما في فئة منفصلة تسمى Mollicutes1. يمنح نقص جدار الخلية مقاومة جوهرية لهذه الكائنات الحية الدقيقة ضد بعض العوامل المضادة للميكروبات وهو مسؤول إلى حد كبير عن تعدد أشكالها. الميكوبلازما لها جينوم صغير وحجم منخفض ، مما يحد من قدراتها الأيضية والاصطناعية الحيوية ويفسر طبيعتها الطفيلية والرمية1.

الميكوبلازما الرئوية هي واحدة من الميكوبلازما التي تصيب الإنسان ويعتقد أنها الأكثر ضراوة2. يستعمر المتفطرة الرئوية الجهاز التنفسي العلوي ، مما يؤدي إلى التهاب رئوي غير نمطي لدى الأطفال والشباب. العلامات السريرية الناتجة عن عدوى المتفطرة الرئوية تشبه الأنفلونزا ، مع الصداع والحمى والسعال3. يتم التوسط في الالتصاق الخلوي للمتفطرة الرئوية بالخلايا المضيفة بواسطة عضية مرفقة بما في ذلك الالتصاق P1 الرئيسي والعديد من البروتينات الملحقة 4,5. قد تحدث المزيد من المظاهر السريرية بسبب الالتهاب الموضعي وتحفيز الجهاز المناعي المضيف الناتج عن الالتزام الحميم للمتفطرة الرئوية بالغشاء المخاطي في مجرى الهواء6. على الرغم من أن الالتهاب الرئوي هو السمة المميزة لعدوى M. pneumoniae ، فقد تم الكشف عن أن العدوى بهذه البكتيريا يمكن أن تكون مسؤولة أيضا عن مجموعة واسعة من المظاهر غير الرئوية في مواقع تشريحية مختلفة مثل الجهاز العصبي المركزي والقلب والجلد والمفاصل7.

كما هو الحال بالنسبة لجميع أنواع الميكوبلازما ، فإن تشخيص المتفطرة الرئوية يمثل تحديا. العلامات السريرية التي تثير الميكوبلازما هي في الغالب غير واضحة وغير مميزة8. نظرا لأنه من الصعب جدا تشخيص عدوى المتفطرة الرئوية بالاعتماد فقط على المظاهر والأعراض السريرية ، فإن الفحص المختبري له أهمية خاصة9. الكشف عن مستعمرات المتفطرة الرئوية عن طريق الثقافة هو الطريقة القياسية الذهبية للتشخيص المناسب. ومع ذلك ، فإن متطلبات النمو السريعة والوقت الطويل اللازم لتقديم نتائج نهائية (1-2 أسابيع) تعقد الثقافة ، وبالتالي تعني أنها نادرا ما تستخدم للتشخيص الروتيني10. تم التحقق من صحة تقنيات تضخيم الحمض النووي من حيث السرعة والكفاءة ، على الرغم من أنها لا تعتبر اختبارات تشخيصية من الدرجة الأولى بسبب تكلفتها العالية نسبيا وعدم توفرها في بعض مرافق الرعاية الصحية. صحيح أن اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل التجارية تستخدم على نطاق واسع لتشخيص عدوى المتفطرة الرئوية ، لكنها لا تزال غير قادرة على استبدال الأمصال. أيضا ، أدى الحدوث المتكرر لكل من النتائج السلبية والإيجابية الخاطئة إلى الحد من استخدام PCR9. وبشكل روتيني، يظل علم الأمصال هو الأكثر ممارسة في المختبرات لتشخيص عدوى المتفطرة الرئوية. تم الإبلاغ عن العديد من مناهج الأمصال لعقود ، مثل الهيماجلوتينين البارد ، واختبار التثبيت المتمم 11 ، واختبار التراص الدموي غير المباشر 12 ، والتألق المناعي13 ، وتقنية ELISA ، التي تم تطبيقها لأول مرة على الأمصال الميكوبلازما في أوائل عام 198014،15،16. واحدة من القضايا الرئيسية التي واجهتها عند إجراء التشخيص المصلي ELISA لعدوى المتفطرة الرئوية هي ردود الفعل المتقاطعة ، مما يقلل بشكل كبير من خصوصية التقنية. تم الإبلاغ سابقا عن امتزاز غير محدد للأمصال البشرية مع مستضدات M. pneumoniae. في الواقع ، قد لا تكون العديد من الأجسام المضادة التي اكتشفتها ELISA في الأمصال البشرية مرتبطة دائما بمستضدات الميكوبلازم 17 ، بسبب القواسم المشتركة بين M. pneumoniae مع بعض البكتيريا18,19 وبعض الأنسجة الحيوانية والبشرية20.

بسبب القراءات الخلفية العالية التي لوحظت في اختبار ELISA التقليدي الذي كان يمارس في المختبر ، كان تفسير النتائج معقدا في كثير من الأحيان ، وبالتالي كان تقديم التشخيص المناسب للمتفطرة الرئوية مهمة صعبة. أثناء مواجهة هذه المشكلة ، اخترنا تحسين M. pneumoniae ELISA عن طريق إزالة التفاعلات غير المحددة لمستضدات M. pneumoniae مع الأجسام المضادة المراد اختبارها. لهذا الغرض ، عملنا على الاستنفاد الانتقائي لمستضدات M. pneumoniae غير المحددة باستخدام تقنية الامتزاز. في الواقع ، فإن الهدف الرئيسي من ELISA الذي يلتقط المستضد هو الكشف على وجه التحديد عن الغلوبولين المناعي الرئوي (Ig) G في عينات المصل البشري. يتكون مفهوم ELISA هذا بشكل أساسي من الالتقاط الانتقائي لمستضدات M. pneumoniae الخاصة ، قبل إضافة عينات المصل البشري. يتم تأمين هذه الانتقائية عن طريق احتضان مستضد M. pneumoniae الخام مع مصل مضاد متعدد النسيلة M. pneumoniae ، يتم إنتاجه في الأرانب في المختبر وجعله خاصا بالأنواع عن طريق الامتزاز ضد مجموعة من البكتيريا غير المتجانسة ، التي تنتمي أو لا تنتمي إلى فئة Mollicutes ، وتشارك المستضدات مع M . pneumoniae الأنواع و / أو المعروف أنها تستعمر الجهاز التنفسي. تم تكرار إجراء الامتزاز ثلاث مرات ، وتم اختبار كفاءته للقضاء على التفاعل المتبادل عن طريق النشاف المناعي. مقايسة ELISA المطورة هي مزيج من الساندويتش و ELISA غير المباشر. باختصار ، يتم طلاء آبار صفيحة ELISA أولا بمصل مضاد متعدد النسيلة خاص ب M. pneumoniae. بعد ذلك ، يضاف مستضد M. pneumoniae ويحبس بين المصل المضاد والأجسام المضادة الموجودة في عينة المصل المراد اختبارها. يتم الكشف عن المركب المناعي المتشكل بواسطة جسم مضاد ثانوي مقترن بالإنزيم (IgG المترافق البيروكسيداز). يتم تصور التفاعلات عن طريق إضافة الركيزة الكروموجينية ، ويتم قياس الامتصاص طيفيا. يتم تقديم ELISA الداخلي هذا بشكل تخطيطي في الشكل 1. أثبت ELISA محلي الصنع فعاليته في الكشف عن عدوى المتفطرة الرئوية على وجه التحديد وهو حاليا أحد أكثر الاختبارات ممارسة في النشاط التشخيصي الروتيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للجوانب الأخلاقية التي وضعتها اللجنة الأخلاقية لمعهد باستور بتونس.

1. خطوات ما قبل ELISA: المتطلبات الأساسية والمعالجة المسبقة

  1. السلالات البكتيرية ووسائط النمو
    ملاحظة: يتم سرد أنواع Mollicutes والبكتيريا المسورة المستخدمة في هذه الدراسة ووسائط نموها في الجدول 1.
    1. نمو أنواع Mollicutes
      1. تلقيح 200 ميكرولتر من مخزون الجلسرين لكل نوع في 1800 ميكرولتر من الوسائط.
      2. تنمو أنواع Mollicutes بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة2-4 أيام حتى يتم ملاحظة تغير في درجة الحموضة (مؤشر الأس الهيدروجيني أحمر الفينول).
      3. قم بتوسيع نطاق الثقافات إلى 10 مل عن طريق إضافة تخفيف 1/10من الثقافة إلى وسائل الإعلام والسماح لها بالنمو مرة أخرى في نفس الظروف.
        ملاحظة: وفقا لعملية التمثيل الغذائي ، تقوم بعض أنواع Mollicutes البشرية (M. pneumoniae و M. genitalium و M. fermentans) بتحمض الوسط بسبب تخمير الجلوكوز ، والبعض الآخر (M. hominis و Ureaplasma) قلوي الوسط عن طريق التحلل المائي للأرجينين أو التحلل المائي لليوريا ، على التوالي. فيما يتعلق بالميكوبلازما الطيرية ، فإن تحمض وسط فراي يدل على وجود M. gallisepticum ، في حين أن قلويته تثبت نمو M. imitans.
      4. انشر 50 ميكرولتر من الثقافات على ألواح أجار لتأكيد نمو البكتيريا. حافظ على صفائح الآجار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 وراقبها بانتظام تحت المجهر لظهور مستعمرات البيض المقلي النموذجية (الميكوبلازما) والمستعمرات الشبيهة بالقنفذ الداكن (Ureaplasmas).
    2. نمو الأنواع غير الرخويات
      1. استزرع البكتيريا غير Mollicutes في 3 مل من الوسائط عند 37 درجة مئوية طوال الليل (تهتز عند 200 دورة في الدقيقة).
      2. قارن تعكر الثقافات مع وسائط التحكم لتأكيد النمو.
      3. قم بتوسيع نطاق الثقافات إلى 10 مل عن طريق إضافة تخفيف 1/100من الثقافة إلى وسائل الإعلام والسماح لها بالنمو مرة أخرى في نفس الظروف.
  2. إعداد المستضد
    1. إعداد مستضد من أنواع Mollicutes
      1. حصاد البروتينات الكاملة (الموجودة في المزارع المؤكدة للمتفطرة الرئوية وأنواع Mollicutes الأخرى) عن طريق الطرد المركزي عند 40000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
      2. تخلص من المادة الطافية واغسل الكريات ثلاث مرات باستخدام 1 مل من محلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4) بواسطة سلسلة من ثلاثة أجهزة طرد مركزي بنفس الظروف.
      3. أعد تعليق كل مستضد في 500 ميكرولتر من PBS.
    2. إعداد مستضد من الأنواع غير Mollicutes
      1. جهاز طرد مركزي للمزارع المزروعة بين عشية وضحاها للبكتيريا غير Mollicutes عند 1500 × جم لمدة 15 دقيقة.
      2. أعد تعليق كل حبيبات بكتيرية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
        ملاحظة: يتم تحديد تركيز البروتين باستخدام طريقة برادفورد الكلاسيكية مع ألبومين مصل الأبقار كمعيار21. يتراوح تركيز البروتين لأنواع Mollicutes عادة بين 0.7-4.8 مجم / مل. بالنسبة للأنواع البكتيرية الأخرى ، يمكن أن يصل تركيز البروتين إلى 20 مجم / مل. يتم تخزين جميع المستضدات في -20 درجة مئوية حتى استخدامها لاحقا.
  3. فحص التفاعل المتبادل عن طريق النشاف المناعي
    1. قم بتحريف البروتينات البكتيرية عن طريق خلط 8 ميكرولتر من كل مستضد مع حجم متساو من المخزن المؤقت للعينة (0.5 M Tris-HCl ؛ درجة الحموضة 6.8 ، 10٪ الجلسرين [v / v] ، 10٪ SDS [w / v] ، و 0.2٪ بروموفينول الأزرق) ، احتضان الخليط عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يتم إجراء تمسخ لتغطية البروتينات ذات الشحنة السالبة وكسر هياكلها الثانوية ، مما يسمح لها بالمرور عبر هلام بولي أكريلاميد وفصلها وفقا لأوزانها الجزيئية.
    2. إخضاع البروتينات المشوهة (100 ميكروغرام بروتين / بئر) للرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) بطريقة ليملي22 مع 12 ٪ جل منفصل و 5٪ جل تكديس. بعد ذلك ، انقل البروتينات كهربائيا إلى غشاء النيتروسليلوز بطريقة Towbin et al.23.
    3. اغمر غشاء النيتروسليلوز في حليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في PBS لمدة 30 دقيقة لسد الأسطح غير المأهولة. احتضان بقع البروتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة باستخدام مصل مضاد للأرانب متعدد النسيلة M. pneumoniae (يتم إنتاجه في معهد باستور بتونس) المخفف إلى 1/200 في PBS-Tween 20 ، ثم مع بيروكسيديز الفجل (HRP) - مترافق مضاد للأرانب IgG المخفف إلى 1/2000 في PBS-Tween 20 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. اغسل الأجسام المضادة غير المنضمة باستخدام PBS واحصل على النتائج عن طريق تعريض ورقة النيتروسليلوز لمحلول الركيزة (4-chloro-1-naphthol، H 2 O2). أوقف التفاعل بإضافة الماء بعد 5-15 دقيقة.
  4. إجراء الامتزاز
    ملاحظة: للقضاء على التفاعلات المتقاطعة بين المصل المضاد متعدد النسيلة M. pneumoniae ومستضدات البكتيريا غير المتجانسة ، يتم استخدام إجراء الامتزاز الذي وصفه سابقا بن عبد المومن وروي24 .
    1. قم بإعداد مجموعة مستضد من 12 بكتيريا غير متجانسة (يشتبه في مشاركة المستضدات مع M. pneumoniae) ، وامزجها في أنبوب طرد مركزي دقيق ، واضبط تركيز البروتين المقابل لنصف المصل المضاد ليتم امتصاصه في التجربة.
      ملاحظة: يختلف الحجم والتركيز بين المقايسات المختلفة. تعتمد هذه الخطوة بشكل أساسي على تركيز الجسم المضاد المراد امتصاصه. على سبيل المثال ، إذا كان تركيز الأجسام المضادة = 3.56 مجم / مل ، فيجب أن يكون تركيز تجمع المستضد (المكون من 12 بكتيريا غير متجانسة) 1.78 مجم / مل (وبالتالي ، حوالي 0.148 مجم من كل مستضد).
    2. قم بالطرد المركزي لخليط المستضد عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واجمع الحبيبات المجمعة ، واحتضانها باستخدام مضاد M. الرئوي IgG لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع التحريض البطيء.
    3. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية واستعادة المادة الطافية (التي تتوافق مع مصل مضاد النسيلة متعدد النسيلة M. pneumoniae ).
      ملاحظة: لضمان خصوصية مصل مضاد M. pneumoniae متعدد النسيلة ، كرر إجراء الامتزاز ثلاث مرات. قبل استخدامه في مقايسة ELISA ، يجب اختبار المصل المضاد متعدد النسيلة M. pneumoniae الممتز عن طريق النشاف المناعي لعدم وجود تفاعلات متقاطعة ضد مجموعة البكتيريا المضمنة.

2. خطوات ELISA: الفحص نفسه

  1. طلاء الصفيحة الدقيقة مع الجسم المضاد للالتقاط
    1. قم بتخفيف الجسم المضاد للالتقاط (M. pneumoniae مضادا متعدد النسيلة ممتزا مسبقا) إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل في محلول 0.1 M كربونات بيكربونات (درجة الحموضة 9.6 ).
    2. قم بتغطية لوحة ELISA المكونة من 96 بئرا بإضافة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف للالتقاط إلى كل بئر.
    3. بعد الحضانة طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة محلول الطلاء واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام محلول الغسيل (التركيب [لكل لتر]: 146.29 جم من كلوريد الصوديوم ، 39.4 جم من Tris-HCl ، 0.2 جم من Thimerosal، و 0.5 مل من Tween 20 ؛ درجة الحموضة 7.3).
  2. حظر
    1. سد الأسطح الملزمة المتبقية للآبار المطلية بإضافة 100 ميكرولتر من محلول الحجب (0.5٪ كازين في PBS) إلى كل بئر.
    2. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإزالة محلول الحجب باستخدام ماصة واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
  3. تطبيق المستضد
    1. أضف كمية متساوية من بروتينات M. pneumoniae الكاملة إلى جميع الآبار المغلفة (10 نانوغرام / بئر).
    2. اسمح للتفاعل أن يحدث لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإزالة الفائض من محلول المستضد واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
  4. تطبيق عينات الاختبار والضوابط
    1. قم بتخفيف عينات الاختبار (الأمصال البشرية) والضوابط (الأمصال المرجعية الإيجابية والسلبية) إلى 1/200 و 1/400 و 1/800 في PBS-Tween 20.
    2. أضف 100 ميكرولتر من العينات المخففة والضوابط في الآبار المناسبة. نفذ كل تفاعل من نسختين. ضع علامة على الآبار التي لا تحتوي على مستضد أو أمصال فارغة.
    3. بعد احتضان اللوحة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محاليل المصل واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
  5. تطبيق الجسم المضاد للكشف عن الإنزيم المترافق
    1. قم بتخفيف الأجسام المضادة للكشف عن الإنزيم ، ومضادات الأرانب المترافقة HRP ، و IgG المضادة للإنسان إلى 1/10,000 في PBS-Tween 20.
    2. ماصة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف المخفف بشكل مناسب لكل بئر.
    3. بعد احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، قم بإزالة الأجسام المضادة للكشف غير المنضمة واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
  6. الكشف وتحليل البيانات
    1. أضف 100 ميكرولتر من محلول كروموجين رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) 3,3 '، 5,5' لتصور ارتباط الجسم المضاد بالمستضد.
    2. اترك اللوحة تتطور لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف (7.5٪ H2SO4) لإيقاف التفاعل الأنزيمي.
    3. اقرأ الامتصاص عند الطول الموجي 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة وقم بفرز النتائج بناء على حساب مؤشر الإيجابية (IP).
      IP = امتصاص المصل المختبر / امتصاص القطع
      IP < 0.7: نتيجة سلبية
      IP = 0.7: يجب تكرار الاختبار في غضون أسبوعين
      IP > 0.7: نتيجة إيجابية
      ملاحظة: يتم تصميم صيغة IP في المختبر ويتم إعداد القيمة 0.7 بعد التحسين. بالنسبة للتفاعلات المكررة ، يتم حساب متوسط قيمة الامتصاص. يتم تحديد التخفيف الأمثل للمصل وتركيز المستضد من خلال طريقة معايرة رقعة الشطرنج ELISA (البيانات غير معروضة). قيمة القطع = OD (الكثافة البصرية) لمصل إيجابي مرجعي (مخفف بنفس تخفيف العينة). يجب أن يكون هذا OD أعلى بثلاث مرات على الأقل من قيمة OD للتحكم السلبي.

3. خطوات ما بعد ELISA: تقييم النتائج والتحقق من صحة الاختبار

  1. يتم تقييم قدرة ELISA الداخلية على تشخيص عدوى المتفطرة الرئوية على وجه التحديد في المرضى الذين تم اختبارهم من خلال البقع المناعية التكميلية باستخدام مستضدات M. pneumoniae والبكتيريا غير المتجانسة لتأكيد إيجابية الأمصال البشرية المختبرة في الأجسام المضادة للمتفطرة الرئوية وسلبيتها في البكتيريا الأخرى المشتبه بها (البيانات غير معروضة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشاط النشاف المناعي لمصل الميكوبلازما الرئوية متعدد النسيلة غير الممتز للبكتيريا غير المتجانسة
التفاعل المتقاطع موجود بالفعل كما هو موضح في نتائج النشاف المناعي (الشكل 2) ومقارنة بالتحكم الإيجابي (الممر 1) ، تتم مشاركة بعض مستضدات M. pneumoniae مع البكتيريا التي تم فحصها. كانت شدة هذه التفاعلات المتقاطعة متغيرة. على سبيل المثال ، أظهرت مستضدات M. gallisepticum و M. imitans أقوى تفاعل مع المصل المضاد <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الورقة وصفا عاما ل ELISA الداخلي الذي تم تطويره بشكل أساسي لضمان فحص محدد ل M. pneumoniae عدوى. يتم توفير تفاصيل حول بروتوكول اختبار ELISA نفسه بالإضافة إلى بعض خطوات المعالجة السابقة واللاحقة. يتم ضمان خصوصية هذا الفحص من خلال تقنية الامتزاز. تم وصف هذا الإجراء سابقا في اختبارات ELISA التي تم تطويرها لتشخيص الإنسان والطيور Mycoplasmas17,24. كما تم استخدامه في فحوصات ELISA لتشخيص الالتهابات البكتيرية الأخرى مثل مرض لايم

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة الصحة التونسية ووزارة التعليم العالي والبحث العلمي التونسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4-كلورو-1-نافتولسيجما-ألدريتشC6788-50 TAB
باكتو ببتونBD211677
باكتو تريبتونBD211705
ألبومين مصل الأبقارسيجما ألدريتشA9647-50 G
عازلة بيكربونات كربوناتسيجما-ألدريتشC3041-50 كاب
الكازينسيجما ألدريتشC7078-1 كجم
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-GlucoseSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO BrothBD255420Frey media
ELISA Plate-ReaderMULTISKAN GO ، Thermo ScientificRef: 51119200
مصل الأبقار الجنينيالجدي العلميFBS-12A
الماعز بيروكسيداز المترافق المضاد للإنسان IgGAbcamab6759
الماعز المضادة للأرانب المقترنة ببيروكسيداز IgGLife Technologies656120
حمض الهيدروكلوريك 37٪Prolab2025.290
بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub>) ، محلول 30٪ScharlauHI01361000
L-argininSigma-AldrichA5006-1KG
مرق رطلأعد في معهد باستور بتونسمقدم من مختبر علم الجراثيم التابع لمعهد باستور بتونس
الميكوبلازما الرئوية < / em> مصل مضاد متعدد النسيلة المنتج في الأرانبأنتج في معهد باستور بتونس تمإنتاج المصل عن طريق تحصين الأرانب في معهد باستور بتونس
نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيدسيجما ألدريتشN7004-10G
Nunc Maxisorp لوحة ميكروتيتر مسطحة القاع 96 بئر  Invitrogen44-2404-21
Penicillin G الصوديوم (1 MIU)PANPHARMA
Phenol redfluka chemika77660
الحليب الخالي من الدسمMP Biomedicals902887
بيكربونات الصوديوم  سيجما ألدريتشS6297-1KG
كربونات الصوديومسيجما ألدريتشS7795-1 كجم
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)نوفاتشيمPS02805
حمض الكبريتيك (H2< / sub>SO4< / sub>) 95-97٪Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
ركيزة TMB (3،3 "، 5،5" محلول رباعي ميثيل بنزيدين)Abcamab142042
قاعدة TrizmaSigma-AldrichT6791-1 كجم
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 ML
مستخلص الخميرة ، مسحوق ،Ultrapure Thermo Scientific   ؛J23547 

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248(2021).
  33. Corning and Falcon Microplates Selection Guide: For Assays and Drug Discovery. Corning Inc. , Available from: https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf (2022).
  34. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  35. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  36. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  37. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة