مقالة منهجية

تصور Mitophagy مع الأصباغ الفلورية للميتوكوندريا والليزوزوم

DOI:

10.3791/64647

⸱

نوفمبر 30, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 3Department of Pharmacy, Shanghai East Hospital, Tongji University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitophagy هي الآلية الأساسية لمراقبة جودة الميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن تقييم الميتوفاجي في الجسم الحي يعوقه عدم وجود مقايسات كمية موثوقة. يظهر هنا بروتوكول لمراقبة الميتوفاجي في الخلايا الحية باستخدام صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية وصبغة الليزوزوم الأحمر الفلوري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا ، كونها مراكز القوة في الخلية ، تلعب أدوارا مهمة في الطاقة الحيوية ، وتوليد الجذور الحرة ، وتوازن الكالسيوم ، وموت الخلايا المبرمج. Mitophagy هي الآلية الأساسية لمراقبة جودة الميتوكوندريا ويتم دراستها بشكل عام باستخدام الملاحظة المجهرية ، ولكن من الصعب إجراء فحوصات الميتوفاجي في الجسم الحي . يعد تقييم الميتوفاجي عن طريق تصوير العضيات الحية طريقة بديلة وضرورية لأبحاث الميتوكوندريا. يصف هذا البروتوكول إجراءات استخدام صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية MitoTracker Green وصبغة الليزوزوم الأحمر الفلورية LysoTracker Red في الخلايا الحية ، بما في ذلك تحميل الأصباغ ، وتصور الميتوكوندريا والليزوزوم ، والنتائج المتوقعة. كما يتم توفير خطوات مفصلة لتقييم الميتوفاجي في الخلايا الحية ، بالإضافة إلى ملاحظات فنية حول إعدادات برنامج المجهر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين على مراقبة الميتوفاجي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه لتحديد الميتوكوندريا والليزوزومات وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي مراكز القوة لجميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا 1,2. بالإضافة إلى إنتاج ATP من خلال الفسفرة التأكسدية ، تلعب الميتوكوندريا دورا حيويا في عمليات أخرى مثل الطاقة الحيوية ، وتوازن الكالسيوم ، وتوليد الجذور الحرة ، وموت الخلايا المبرمج ، والتوازن الخلوي3،4،5. نظرا لأن الميتوكوندريا تولد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من مجمعات متعددة في سلسلة نقل الإلكترون ، يتم تحفيزها باستمرار عن طريق الإجهاد التأكسدي المحتمل ، والذي يمكن أن يؤدي في النهاية إلى تلف هيكلي واختلال وظيفي عندما ينهار نظام الدفاع المضاد للأكسدة 6,7. تم العثور على خلل الميتوكوندريا للمساهمة في العديد من الأمراض ، بما في ذلك الاضطرابات الأيضية ، والتنكس العصبي ، وأمراض القلب والأوعية الدموية8. لذلك ، من الأهمية بمكان الحفاظ على صحة سكان الميتوكوندريا ووظيفتها المناسبة. الميتوكوندريا هي عضيات بلاستيكية وديناميكية للغاية. يتم التحكم في مورفولوجيتها ووظيفتها من خلال آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا ، بما في ذلك التعديلات اللاحقة للترجمة (PTM) لبروتينات الميتوكوندريا ، والتولد الحيوي للميتوكوندريا ، والاندماج ، والانشطار ، والميتوفاجي9،10. ينتج عن انشطار الميتوكوندريا بوساطة البروتين 1 المرتبط بالدينامين (DRP1) ، وهو GTPase من عائلة البروتينات الديناميكية الفائقة ، ميتوكوندريا صغيرة ومستديرة ويعزل الميتوكوندريا المختلة وظيفيا ، والتي يمكن تطهيرها وتحللها بواسطة الميتوفاجي11,12.

Mitophagy هي عملية خلوية تؤدي بشكل انتقائي إلى تحلل الميتوكوندريا عن طريق الالتهام الذاتي ، وعادة ما تحدث في الميتوكوندريا التالفة بعد الإصابة أو الشيخوخة أو الإجهاد. بعد ذلك ، يتم تسليم هذه الميتوكوندريا إلى الليزوزومات للتحلل10. وبالتالي ، فإن الميتوفاجي هي عملية تقويضية تساعد في الحفاظ على كمية ونوعية الميتوكوندريا في حالة صحية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. يلعب دورا حاسما في استعادة التوازن الخلوي في ظل الظروف الفسيولوجية والإجهاد الطبيعية13,14. تتميز الخلايا بآلية ميتوفاجي معقدة ، والتي تسببها إشارات مختلفة من الإجهاد الخلوي والتغيرات التنموية. تصنف المسارات التنظيمية Mitophagy على أنها تعتمد على يوبيكويتين أو تعتمد على المستقبلات15,16 ؛ يتم التوسط في الالتهام الذاتي المعتمد على ubiquitin بواسطة كيناز PINK1 وتجنيد يوبيكويتين ligase Parkin E3 إلى الميتوكوندريا 17,18 ، بينما يتضمن الالتهام الذاتي المعتمد على المستقبلات ربط مستقبلات الالتهام الذاتي بسلسلة ضوء البروتين المرتبطة بالأنابيب الدقيقة LC3 التي تتوسط الميتوفاجي استجابة لتلف الميتوكوندريا19.

المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) هو الطريقة الأكثر استخداما ، ولا يزال أحد أفضل الطرق ، لمراقبة واكتشاف الميتوفاجي20. السمات المورفولوجية للميتوفاجي هي البلعمة الذاتية أو التحلل الذاتي التي تشكلت عن طريق اندماج البلعمة الذاتية مع الليزوزومات ، والتي يمكن ملاحظتها من صور المجهر الإلكتروني21. ومع ذلك ، فإن ضعف المجهر الإلكتروني (EM) هو عدم القدرة على مراقبة العمليات الديناميكية للميتوفاجي ، مثل إزالة استقطاب الميتوكوندريا ، وانشطار الميتوكوندريا ، واندماج البلعمة الذاتية والليزوزومات ، في الخلية الحية20. وبالتالي ، فإن تقييم الميتوفاجي من خلال تصوير العضيات الحية هو طريقة بديلة جذابة لأبحاث الميتوكوندريا. تستخدم تقنية التصوير بالخلايا الحية الموصوفة هنا صبغتين فلوريتين لتلطيخ الميتوكوندريا والليزوزومات. عندما يحدث الميتوفاجي ، فإن الميتوكوندريا التالفة أو الزائدة التي تجتاحها البلعمة الذاتية تكون ملطخة باللون الأخضر بواسطة صبغة الميتوكوندريا ، بينما تلطخ الصبغة الحمراء الليزوزومات. يؤدي اندماج هذه البلعمة الذاتية والليزوزومات ، المشار إليها باسم التحلل الذاتي ، إلى تداخل التألق الأخضر والأحمر وظهوره كنقاط صفراء ، مما يشير إلى حدوث الميتوفاجي22. تحتوي صبغة الميتوكوندريا الخلوية (MitoTracker Green) على مجموعة كلوروميثيل كلوروميثيل معتدلة التفاعل مع الثيول لتسمية الميتوكوندريا23. لتسمية الميتوكوندريا ، يتم تحضين الخلايا ببساطة بالصبغة ، التي تنتشر بشكل سلبي عبر غشاء البلازما وتتراكم في الميتوكوندريا النشطة. يمكن لصبغة الميتوكوندريا هذه تلطيخ الخلايا الحية بسهولة ، وهي أقل فعالية في تلطيخ الخلايا الثابتة أو الميتة بالألدهيد. صبغة الليزوزوم (LysoTracker Red) هي مسبار حمضي فلوري يستخدم لوضع العلامات على العضيات الحمضية وتتبعها في الخلايا الحية. تظهر هذه الصبغة انتقائية عالية للعضيات الحمضية ويمكنها تسمية الخلايا الحية بشكل فعال بتركيزات نانومولية24.

يتم هنا عرض إجراءات استخدام هذه الأصباغ الفلورية في الخلايا الحية ، بما في ذلك تحميل الأصباغ وتصور الميتوكوندريا والليزوزومات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين على مراقبة الميتوفاجي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية. يمكن استخدامه أيضا لتحديد الميتوكوندريا والليزوزومات ، وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة الخلية والمرور

ملاحظة: يتم وصف البروتوكول باستخدام الخلايا الليفية الجنينية للفأر المستزرعة بشكل روتيني (MEFs) كمثال.

  1. خلايا MEF المستنبتة في أطباق زراعة الخلايا 10 سم مع 10 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ومراقبة الخلايا تحت المجهر عند تكبير 100x.
  2. أداء تمرير الخلايا الروتينية.
    1. عندما تصل الخلايا إلى 80٪ -90٪ التقاء (كل 3 أيام) ، اغسل الخلايا ب 2 مل من محلول ملحي مخزن فوسفات Dulbecco (DPBS). ثم أضف 2 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA لمدة دقيقة واحدة لفصل الخلايا ، متبوعا ب 2 مل من DMEM لإيقاف عمل التربسين-EDTA. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 100 × جم لمدة 3 دقائق وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من DMEM.
    2. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي وشرائح غرفة عد الخلايا (انظر جدول المواد) ، ثم قم بتلقيح 1.5 × 106 خلايا في طبق زراعة خلايا جديد 10 سم يحتوي على 10 مل من DMEM.
  3. بالنسبة لفحص الميتوفاجي ، قم بإعداد تعليق خلوي كما في الخطوة 1.2.1. تمييع تعليق الخلية إلى 1 × 105 خلايا / مل في DMEM جديدة.
  4. أضف 2 مل من معلق الخلية المخفف إلى طبق متحد البؤر 20 مم (انظر جدول المواد) وهز طبق الاستزراع في "صليب". احتضان طبق زراعة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.

2. تلطيخ الميتوكوندريا

  1. قم بإزالة حصص محلول المخزون من صبغة الميتوكوندريا الفلورية الخضراء وصبغة الليزوزوم الفلورية الحمراء (انظر جدول المواد) من الفريزر -20 درجة مئوية.
  2. تحضير حلول العمل للأصباغ عن طريق تخفيف حلول المخزون 1: 1000 في DMEM وتخلط جيدا. على سبيل المثال ، أضف 2 ميكرولتر لكل من صبغة الميتوكوندريا 1 mM وصبغة الليزوزوم إلى 2 مل من DMEM للحصول على تركيز عمل قدره 1 ميكرومتر لكلا الصبغتين.
  3. قم بإزالة الوسط من طبق الاستزراع متحد البؤر (الخطوة 1.4). أضف 1 مل من محلول التلوين (المحضر في الخطوة 2.2) لتغطية الخلايا. ضع طبق زراعة الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20-30 دقيقة.

3. التصوير البؤري

  1. قم بإعداد 1 لتر من محلول كريبس هينسليت (KH) (138.2 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 3.7 مللي مول KCl ، 0.25 مللي مول CaCl 2 ، 1.2 مللي متر KH 2 PO 4 ، 1.2 مللي مول MgSO4.7H2 O ، 15 ملي مول جلوكوز ، و 21.85 مللي مول HEPES ؛ الرقم الهيدروجيني النهائي7.4) وتخزينه في 4 درجات مئوية (لمدة تصل إلى شهر واحد).
  2. في يوم التصوير متحد البؤر ، قم بإزالة المخزن المؤقت KH من الثلاجة مسبقا وقم بتسخينه مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة (20 إلى 25 درجة مئوية).
  3. اضبط معلمات برنامج التصوير المجهري متحد البؤر (انظر جدول المواد): بالنسبة لصور الإثارة المزدوجة ، استخدم الإثارة المتسلسلة عند 488 نانومتر و 543 نانومتر ، واجمع الانبعاثات عند 505-545 نانومتر و >560 نانومتر ، على التوالي.
    ملاحظة: اضبط إعدادات التصوير على النحو التالي. وضع المسح الضوئي: الإطار. السرعة: 9; المتوسط: رقم ، 1 ؛ الكسب: 450 إلى 600 ؛ الثقب: 30 إلى 200 ؛ الليزر: <10٪. من الأفضل بدء تشغيل برنامج التصوير أولا ثم تشغيل الليزر 488 نانومتر بالكامل. يجب تشغيل الليزر 543 نانومتر وتثبيته لمدة 3-5 دقائق قبل الاستخدام (الشكل 1 أ).
  4. قم بإزالة وسط الاستزراع الذي يحتوي على الصبغة من الحاضنة (الخطوة 2.3) وأضف 1 مل من محلول KH إلى الطبق.
  5. للحث على الميتوفاجي ، عالج الخلايا بسيانيد الكربونيل -4- (ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) عند 1 ميكرومتر (التركيز النهائي) في محلول KH لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وانتقل على الفور إلى تصوير الخلايا باستخدام المجهر متحد البؤر.
  6. ضع كمية مناسبة من الزيت على الجزء العلوي من عدسة الزيت 63x (انظر جدول المواد). ضع عينة الخلية في مرحلة العينة من المجهر متحد البؤر وحركها مباشرة فوق العدسة الشيئية.
  7. استخدم برنامج التصوير للعثور على العينة بالنقر فوق علامة التبويب تحديد الموقع في الزاوية العلوية اليسرى من واجهة البرنامج (الشكل 1 ب). اختر مجموعة فلاتر خضراء للتجربة.
  8. استخدم مقبض الضبط الخشن للتركيز البؤري بسرعة عن طريق تحريك العدسة الشيئية لأعلى ولأسفل. بعد أن تكون عينة الخلية مرئية بوضوح من خلال العدسة ، ابحث عن منطقة الخلايا المفردة وقم بتركيزها وانقلها إلى مركز مجال الرؤية.
  9. انقر فوق علامة التبويب الاستحواذ في الزاوية اليسرى العليا في واجهة البرنامج للحصول على الصور. حدد فقط قناة 488 نانومتر ودقة الإطار 1024 × 1024 للمعاينة.
  10. انقر فوق علامة التبويب Live في الزاوية اليسرى العليا لبدء الفحص المباشر. اضبط مجال الرؤية على الأكثر حدة واضبط طاقة الليزر عن طريق تحريك شريط التمرير إلى اليسار أو اليمين (الشكل 1 أ). حافظ على إعداد الكسب أقل من 600 لتجنب التعرض المفرط.
  11. اضبط قيمة الثقب على 156 ، واكتسب القيمة إلى 545 ، وقيمة الإزاحة الرقمية إلى 0.
  12. حدد أفضل مجال رؤية ، وتحقق من القناتين (488 نانومتر و 543 نانومتر) ، واختر دقة الإطار 1024 × 1024. انقر فوق Snap للحصول على صور 2D. احفظ الصور التي تم الحصول عليها.
    ملاحظة: صبغة الميتوكوندريا الخضراء لها ذروة إثارة عند 490 نانومتر وذروة انبعاث عند 516 نانومتر. يمكن إثارته باستخدام ليزر 488 نانومتر. صبغة الليزوزوم الحمراء لها ذروة إثارة عند 576 نانومتر وذروة انبعاث عند 590 نانومتر. يمكن إثارته باستخدام ليزر 543 نانومتر.

4. تحليل الصور

  1. افتح الصورة المحفوظة باستخدام ImageJ واستورد الصورة المدمجة فيها.
  2. احسب يدويا عدد النقاط الصفراء في كل خلية ، والتي تشير إلى أن الليزوزوم يبتلع الميتوكوندريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MitoTracker Green عبارة عن صبغة ميتوكوندريا خضراء فلورية قادرة على توطين الميتوكوندريا بدقة. يمكن للصبغة أن تلطخ الخلايا الحية بسهولة وتكون أقل فعالية في تلطيخ الخلايا الثابتة أو الميتة بالألدهيد (الشكل 2). صبغة الليزوزوم الأحمر الفلوري LysoTracker Red قادرة على وضع العلامات على العضيات الليزوزومية الحمضية وتتبعها ويمكنها فقط تلطيخ الخلايا الحية (الشكل 2). يسمح التصوير المجهري متحد البؤر بتصور الميتوكوندريا والليزوزومات الملطخة بالأصباغ المناسبة (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة لتقييم ومراقبة العملية الديناميكية للميتوفاجي في الخلايا الحية ، بما في ذلك البلعمة الذاتية ، والليزوزومات ، والانشطار الميتوكوندريا ، من خلال التلوين المشترك مع الميتوكوندريا الخلوية والأصباغ الليزوزومية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتحديد الميتوكوندريا وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا. يجب حماية كل من الأصباغ المستخدمة في هذه الدراسة من الضوء ، ويجب تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة ، ويجب تخزين الأصباغ في حصص تستخدم مرة واحدة قدر الإمكان. يوصى بإعداد محاليل عمل للأصباغ لتجنب إضافت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFA0105601 ، 2018YFA0107102) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970333،31901044،) ، وبرنامج أستاذ التعيين الخاص في مؤسسات شنغهاي للتعليم العالي (GZ2020008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
عداد الخلايا الآليCountstarIC1000
شرائح غرفة عد الخلاياCountstar12-0005-50
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)Corning10-013-CV
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS)Corning21-031-CVC
طبق ثقافة الخلايا السفلي الزجاجي (طبق متحد البؤر)NEST801002
الصورة J (Rasband ، NIH) المعاهدالوطنية للصحةhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs & ndash ؛ Henseleit (KHB) مخزن مؤقتذاتي الإعداد
LysoTracker RedInvitrogen1818430100 & micro ؛ مول / لتر ، صبغة الليزوزوم الأحمر الفلورسنت
MitoTracker GreenInvitrogen1842298200 & micro ؛ مول / لتر مخزون ، صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية
الفأر الخلايا الليفيةالمعد ذاتيا
(عدسة زيتية 63x)ZEISSZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25٪GibicoCat # 25200056
ZEISS LSM 880 مجهر المسح الضوئي بالليزرمتحد البؤر ZEISSZEISS LSM 880
ZEN برنامج الفحص المجهري 2.1 (متحد البؤر برنامج التصوير المجهري)ZEISSZEN 2.1
محلول الجنينية الهدف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
  2. Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
  3. Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912(2021).
  5. Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
  6. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  7. Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
  8. Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
  9. Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252(2020).
  10. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467(2020).
  11. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  12. Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070(2020).
  13. Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705(2021).
  14. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  15. Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
  16. Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
  17. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  18. Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
  19. Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
  20. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
  21. Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
  22. Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
  23. Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
  24. Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).
  25. Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  26. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  27. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  28. Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
  29. Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
  30. Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
  31. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  32. Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MitoTracker Green LysoTracker Red

مقالات ذات صلة