هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يحدد استخدام شظايا الأوعية الدموية الدقيقة المعزولة من القوارض أو الأنسجة الدهنية البشرية كنهج مباشر لهندسة الأنسجة الدهنية الوظيفية ذات الأوعية الدموية البيج.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يحدد استخدام شظايا الأوعية الدموية الدقيقة المعزولة من القوارض أو الأنسجة الدهنية البشرية كنهج مباشر لهندسة الأنسجة الدهنية الوظيفية ذات الأوعية الدموية البيج.
تم التحقيق في الأنسجة الدهنية الحرارية الهندسية (على سبيل المثال ، الأنسجة الدهنية البيج أو البني) كعلاج محتمل للأمراض الأيضية أو لتصميم الأنسجة الدقيقة الشخصية للفحص الصحي واختبار الأدوية. غالبا ما تكون الاستراتيجيات الحالية معقدة للغاية وتفشل في تصوير الخصائص متعددة الخلايا والوظيفية للأنسجة الدهنية الحرارية بشكل كامل. شظايا الأوعية الدموية الدقيقة ، والأوعية الدقيقة الصغيرة السليمة التي تتكون من الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية المعزولة من الأنسجة الدهنية ، تعمل كمصدر ذاتي واحد للخلايا التي تمكن من تكوين الأوعية الدموية والأنسجة الدهنية. توضح هذه المقالة طرقا لتحسين ظروف الاستزراع لتمكين توليد الأنسجة الدهنية ثلاثية الأبعاد والأوعية الدموية والوظيفية الحرارية من شظايا الأوعية الدموية الدقيقة ، بما في ذلك بروتوكولات عزل شظايا الأوعية الدموية الدقيقة من الأنسجة الدهنية وظروف الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة أفضل الممارسات ، وكذلك تقنيات توصيف الأنسجة المهندسة ، ويتم تقديم نتائج العينات من كل من شظايا القوارض والأوعية الدموية الدقيقة البشرية. هذا النهج لديه القدرة على استخدامه لفهم وتطوير علاجات السمنة وأمراض التمثيل الغذائي.
الهدف من هذا البروتوكول هو وصف نهج لتطوير الأنسجة الدهنية البيج الوعائية من مصدر واحد ، يحتمل أن يكون ذاتيا ، جزء الأوعية الدموية الدقيقة (MVF). وقد ثبت أن الأنسجة الدهنية البنية والبيج تعرض خصائص مفيدة تتعلق بتنظيم التمثيل الغذائي. ومع ذلك ، فإن الحجم الصغير لمستودعات الأنسجة الدهنية هذه لدى البالغين يحد من التأثير المحتمل على التمثيل الغذائي الجهازي ، خاصة في الحالات المرضية مثل السمنة أو مرض السكري من النوع 21،2،3،4،5،6،7. هناك اهتمام ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
أجريت هذه الدراسة وفقا لقانون رعاية الحيوان واللوائح التنفيذية لرعاية الحيوان وفقا لمبادئ دليل رعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة تكساس في سان أنطونيو.
ملاحظة: بالنسبة للخطوات الموضحة أدناه ، يتم استخدام ذكور فئران لويس. يجب إجراء تعديلات طفيفة على البروتوكول للإناث ، وكذلك مجموعة جزء الأوعية الدموية الدقيقة للفأر (MVF)29. بالنسبة للبروتوكولات التي تستخدم MVFs البشرية (h-MVFs) ، فإن الخطوات الوحيدة المطلوبة هي إعادة تعليق h-MVFs باتباع بروتوكول الشركة المصنعة ، وإعداد وسائط النمو (1.3) ، وتشكيل الهلاميات المائية الفيبرين (5) ، والزرا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
هناك عدد قليل من الخصائص المورفولوجية المظهرية الرئيسية للأنسجة الدهنية البيج / البني: إنه متعدد العيون / يحتوي على قطرات دهنية صغيرة ، ويمتلك عددا كبيرا من الميتوكوندريا (سبب مظهره "البني" المميز في الجسم الحي) ، في المقابل لديه معدل استهلاك مرتفع للأكسجين / الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ، وهو شديد الأوعية الدموية ، وزاد من امتصاص تحلل الدهون / الجلوكوز المحفز بالأنسولين ، والأكثر شهرة ، يعبر عن مستويات عالية من بروتين الفصل 1 (UCP1) ، وهو بروتين ميتوكوندريا يشارك في التنفس الحراري19,30<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
مجال هندسة الأنسجة الدهنية ذات اللون البني / البيج غير ناضج إلى حد كبير 22،23،24،25،26،27،28 ، مع تطوير الجزء الأكبر من النماذج الدهنية للأنسجة الدهنية البيضاء8،22،31. تتكون الأنسجة الدقيقة ذات اللو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
يتم دعم الدكتور أكوستا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح CA148724 و TL1TR002647. يتم دعم الدكتور غونزاليس بوراس من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، تحت رقم الجائزة F32-0DK122754. تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من قبل المعاهد الوطنية للصحة (5SC1DK122578) وجامعة تكساس في قسم الهندسة الطبية الحيوية في سان أنطونيو. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم إنشاء الأرقام جزئيا باستخدام Biorender.com.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حمض أمينوكابرويك | سيجما ألدريتش | A2504-100G | يضاف في DMEM بتركيز 1 مجم / مل |
| مقص حاد الرأس | فيشر العلمي | 12-000-172 | تعقيم في الأوتوكلاف |
| ألبومين مصل بوفين (BSA) ميليبور | 126575-10 جم | مخفف في PBS إلى 4 مجم / مل و 1 مجم / مل | |
| كولاجيناز من النوع 1 | فيشر NC9633623 العلمي | مخفف إلى 6 مجم / مل في BSA 4 مجم / مل ، هضم الدسم المفروم | |
| ديكساميثازون | AC230302500 علمي حراري | مخفف في الإيثانول بتركيز مخزون 2 مجم / مل | |
| وسادات سفلية يمكن التخلص | منها فيشر سينتاليك | 23-666-062 | لامتصاص السوائل أثناء الجراحة |
| تشريح مقص | فيشر العلمي | 08-951-5 | تعقيم في الأوتوكلاف |
| Dulbecco & prime; s النسر المعدل & رئيس الوزراء ؛ s متوسطة (DMEM) فيشر | 11885092 | علمي | |
| Dulbecco & prime; s النسر المعدل & رئيس الوزراء ؛ s خليط متوسط / مغذي F-12 لحم خنزير (DMEM / F12) | سيجما ألدريتش | D8062 | |
| مصل الأبقار الجنينية ؛ | إضافة 16140089 | فيشر العلمي | في DMEM إلى 20٪ من الحجم. |
| Fibrinogen | سيجما ألدريتش | F8630-25G | قابل للذوبان في DMEM بتركيز 20 مجم / مل ، بروتين موجود في بلازما الدم والمكون الرئيسي لقارورة هيدروجيل |
| ، 250 مل | FB500250 فيشر العلمي | يسمح بهضم الدهون باستخدام مساحة سطح كبيرة | |
| ملقط | فيشر العلمي | 50-264-21 | تعقيم في الأوتوكلاف ، للتعامل مع الأنسجة والمرشحات |
| فورسكولين | سيجما ألدريتش | F6886 | المخفف في الإيثانول بتركيز مخزون 10 ملي مولار |
| تم استخدام Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Human MVFs (hMVFs) المعزولة من ثلاثة مرضى مختلفين (إناث تتراوح أعمارهن بين 52 و 54 و 56 عاما) في الدراسة الحالية. |
| إندوميتاسين | سيجما ألدريتش | I7378 | مخفف في الإيثانول بتركيز مخزون 12.5 ملي مولار |
| الأنسولين من البنكرياس الخنازير | سيجما ألدريتش | I5523 | مخفف في 0.01 نيوتن حمض الهيدروكلوريك بتركيز مخزون 5 مجم / مل |
| NC9023832 علمي MycoZap | Fisher | يضاف في DMEM إلى 0.2٪ وزن / حجم ، الميكوبلازما الوقائية ؛ | |
| بينيسيلين / ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) | إضافة 15140122 | فيشر العلمي | في DMEM إلى 1٪ من الحجم. |
| أطباق بتري ، بوليسترين (100 مم × 15 مم). | فيشر 351029 | العلمية | 3 لإزالة الأوعية الدموية والفرم ، 8 (غطاء) للنقع المسبق للشاشات و 8 (طبق) للاستخدام عند التصفية مع 500 أو 37 ميكرو ؛ شاشات M |
| أطباق بتري ، البوليسترين (35 مم × 10 مم). | فيشر العلمي | 50-202-036 | لعد شظايا |
| محلول ملحي للفوسفات (PBS) | فيشر العلمي | 14-190-250 | مخفف إلى 1x بماء معقم منزوع الأيونات. |
| Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | NC0854141 | علمي فيشر | |
| Rosiglitazone | R0106200MG | علمي | مخفف في DMSO بتركيز مخزون 10 ملي |
| مقص | أدوات العلوم الدقيقة | 14059-11 | 1 للشق الأولي ، 1 لشق البربخ ، 1 لقص الطرف |
| شاشة 37 & micro ؛ M | شركة كارولينا للإمدادات البيولوجية | 652222R | مقطعة إلى مربعات مستديرة مقاس 3 بوصات ومعقمة في أكسيد الإيثيلين ، وانحباس الشظايا وإزالة شظايا صغيرة جدا / خلايا مفردة والحطام |
| شاشة 500 وميكرو ؛ M | شركة Carolina Biological Supply | Company 652222F | مقطعة إلى مربعات مستديرة مقاس 3 بوصات ومعقمة في أكسيد الإيثيلين ، تزيل الشظايا / الحطام الأكبر |
| Hemostat | Fisher Scientific | 12-000-171 | تعقيم في الأوتوكلاف ، لتثبيت الجلد قبل شق |
| مرشح Steriflip 0.22 & mu ؛ m | Millipore | SE1M179M6 | |
| Thrombin | Fisher العلمي | 6051601KU | مخفف في الماء منزوع الأيونات إلى 10 U / مل ، يستخدم كعامل تخثر يحول الفيبرينوجين إلى الفيبرين |
| هرمون الغدة الدرقية (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | مخفف في 1N هيدروكسيد الصوديوم بتركيز مخزون 0.02 ملي مولار |
| الفئران الدهنية المصابة بالسكري (ZDF) - السمنة (FA / FA) أو النحيل (FA / +) الذكور ؛ | نهر تشارلز | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 | تم الحصول عليها من نهر تشارلز (ويلمنجتون ، ماساتشوستس). تم الحصول على الفئران في عمر 4 أسابيع وإطعامها Purina 5008 حتى القتل الرحيم (15-19 أسبوعا من العمر). كانت مستويات الجلوكوز (الدم من الوريد الصافن الجانبي) أكبر من 300 مجم / ديسيلتر في جميع الفئران FA / FA المستخدمة في الدراسة. تم إيواء جميع في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها مع دورة ضوء وظلام مدتها 12 ساعة وتم إطعامها بشكل خاص. |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.