يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ثقافة ثلاثية الأبعاد للأنسجة الدهنية الحرارية الوعائية من شظايا الأوعية الدموية الدقيقة

2.8K مشاهدات

DOI:

10.3791/64650

فبراير 3, 2023

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يحدد استخدام شظايا الأوعية الدموية الدقيقة المعزولة من القوارض أو الأنسجة الدهنية البشرية كنهج مباشر لهندسة الأنسجة الدهنية الوظيفية ذات الأوعية الدموية البيج.

الملخص

تم التحقيق في الأنسجة الدهنية الحرارية الهندسية (على سبيل المثال ، الأنسجة الدهنية البيج أو البني) كعلاج محتمل للأمراض الأيضية أو لتصميم الأنسجة الدقيقة الشخصية للفحص الصحي واختبار الأدوية. غالبا ما تكون الاستراتيجيات الحالية معقدة للغاية وتفشل في تصوير الخصائص متعددة الخلايا والوظيفية للأنسجة الدهنية الحرارية بشكل كامل. شظايا الأوعية الدموية الدقيقة ، والأوعية الدقيقة الصغيرة السليمة التي تتكون من الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية المعزولة من الأنسجة الدهنية ، تعمل كمصدر ذاتي واحد للخلايا التي تمكن من تكوين الأوعية الدموية والأنسجة الدهنية. توضح هذه المقالة طرقا لتحسين ظروف الاستزراع لتمكين توليد الأنسجة الدهنية ثلاثية الأبعاد والأوعية الدموية والوظيفية الحرارية من شظايا الأوعية الدموية الدقيقة ، بما في ذلك بروتوكولات عزل شظايا الأوعية الدموية الدقيقة من الأنسجة الدهنية وظروف الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة أفضل الممارسات ، وكذلك تقنيات توصيف الأنسجة المهندسة ، ويتم تقديم نتائج العينات من كل من شظايا القوارض والأوعية الدموية الدقيقة البشرية. هذا النهج لديه القدرة على استخدامه لفهم وتطوير علاجات السمنة وأمراض التمثيل الغذائي.

المقدمة

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف نهج لتطوير الأنسجة الدهنية البيج الوعائية من مصدر واحد ، يحتمل أن يكون ذاتيا ، جزء الأوعية الدموية الدقيقة (MVF). وقد ثبت أن الأنسجة الدهنية البنية والبيج تعرض خصائص مفيدة تتعلق بتنظيم التمثيل الغذائي. ومع ذلك ، فإن الحجم الصغير لمستودعات الأنسجة الدهنية هذه لدى البالغين يحد من التأثير المحتمل على التمثيل الغذائي الجهازي ، خاصة في الحالات المرضية مثل السمنة أو مرض السكري من النوع 21،2،3،4،5،6،7. هناك اهتمام ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة وفقا لقانون رعاية الحيوان واللوائح التنفيذية لرعاية الحيوان وفقا لمبادئ دليل رعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة تكساس في سان أنطونيو.

ملاحظة: بالنسبة للخطوات الموضحة أدناه ، يتم استخدام ذكور فئران لويس. يجب إجراء تعديلات طفيفة على البروتوكول للإناث ، وكذلك مجموعة جزء الأوعية الدموية الدقيقة للفأر (MVF)29. بالنسبة للبروتوكولات التي تستخدم MVFs البشرية (h-MVFs) ، فإن الخطوات الوحيدة المطلوبة هي إعادة تعليق h-MVFs باتباع بروتوكول الشركة المصنعة ، وإعداد وسائط النمو (1.3) ، وتشكيل الهلاميات المائية الفيبرين (5) ، والزرا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هناك عدد قليل من الخصائص المورفولوجية المظهرية الرئيسية للأنسجة الدهنية البيج / البني: إنه متعدد العيون / يحتوي على قطرات دهنية صغيرة ، ويمتلك عددا كبيرا من الميتوكوندريا (سبب مظهره "البني" المميز في الجسم الحي) ، في المقابل لديه معدل استهلاك مرتفع للأكسجين / الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ، وهو شديد الأوعية الدموية ، وزاد من امتصاص تحلل الدهون / الجلوكوز المحفز بالأنسولين ، والأكثر شهرة ، يعبر عن مستويات عالية من بروتين الفصل 1 (UCP1) ، وهو بروتين ميتوكوندريا يشارك في التنفس الحراري19,30<.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مجال هندسة الأنسجة الدهنية ذات اللون البني / البيج غير ناضج إلى حد كبير 22،23،24،25،26،27،28 ، مع تطوير الجزء الأكبر من النماذج الدهنية للأنسجة الدهنية البيضاء8،22،31. تتكون الأنسجة الدقيقة ذات اللو.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

يتم دعم الدكتور أكوستا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح CA148724 و TL1TR002647. يتم دعم الدكتور غونزاليس بوراس من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، تحت رقم الجائزة F32-0DK122754. تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من قبل المعاهد الوطنية للصحة (5SC1DK122578) وجامعة تكساس في قسم الهندسة الطبية الحيوية في سان أنطونيو. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم إنشاء الأرقام جزئيا باستخدام Biorender.com.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض أمينوكابرويكسيجما ألدريتشA2504-100Gيضاف في DMEM بتركيز 1 مجم / مل
مقص حاد الرأسفيشر العلمي12-000-172تعقيم في الأوتوكلاف
ألبومين مصل بوفين (BSA) ميليبور126575-10 جممخفف في PBS إلى 4 مجم / مل و 1 مجم / مل
كولاجيناز من النوع 1فيشر NC9633623 العلميمخفف إلى 6 مجم / مل في BSA 4 مجم / مل ، هضم الدسم المفروم
ديكساميثازونAC230302500 علمي حراريمخفف في الإيثانول بتركيز مخزون 2 مجم / مل
وسادات سفلية يمكن التخلصمنها فيشر سينتاليك23-666-062لامتصاص السوائل أثناء الجراحة
تشريح مقصفيشر العلمي08-951-5تعقيم في الأوتوكلاف
Dulbecco & prime; s النسر المعدل & رئيس الوزراء ؛ s متوسطة (DMEM) فيشر11885092علمي
Dulbecco & prime; s النسر المعدل & رئيس الوزراء ؛ s خليط متوسط / مغذي F-12 لحم خنزير (DMEM / F12)سيجما ألدريتشD8062
مصل الأبقار الجنينية   ؛إضافة 16140089فيشر العلميفي DMEM إلى 20٪ من الحجم.
Fibrinogen سيجما ألدريتشF8630-25Gقابل للذوبان في DMEM بتركيز 20 مجم / مل ، بروتين موجود في بلازما الدم والمكون الرئيسي لقارورة هيدروجيل
، 250 ملFB500250 فيشر العلمييسمح بهضم الدهون باستخدام مساحة سطح كبيرة
ملقطفيشر العلمي50-264-21تعقيم في الأوتوكلاف ، للتعامل مع الأنسجة والمرشحات
فورسكولينسيجما ألدريتشF6886المخفف في الإيثانول بتركيز مخزون 10 ملي مولار
تم استخدام Human MVFAdvanced Solutions Life Scienes, LLChttps://www.advancedsolutions.com/microvesselsHuman MVFs (hMVFs) المعزولة من ثلاثة مرضى مختلفين (إناث تتراوح أعمارهن بين 52 و 54 و 56 عاما) في الدراسة الحالية.
إندوميتاسين سيجما ألدريتشI7378مخفف في الإيثانول بتركيز مخزون 12.5 ملي مولار
الأنسولين من البنكرياس الخنازيرسيجما ألدريتشI5523مخفف في 0.01 نيوتن حمض الهيدروكلوريك بتركيز مخزون 5 مجم / مل
NC9023832 علمي MycoZapFisherيضاف في DMEM إلى 0.2٪ وزن / حجم ، الميكوبلازما الوقائية   ؛
بينيسيلين / ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)إضافة 15140122فيشر العلميفي DMEM إلى 1٪ من الحجم.
أطباق بتري ، بوليسترين (100 مم × 15 مم).فيشر 351029العلمية3 لإزالة الأوعية الدموية والفرم ، 8 (غطاء) للنقع المسبق للشاشات و 8 (طبق) للاستخدام عند التصفية مع 500 أو 37 ميكرو ؛ شاشات M
أطباق بتري ، البوليسترين (35 مم × 10 مم).فيشر العلمي50-202-036لعد شظايا
محلول ملحي للفوسفات (PBS)فيشر العلمي14-190-250مخفف إلى 1x بماء معقم منزوع الأيونات.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)NC0854141علمي فيشر
RosiglitazoneR0106200MGعلميمخفف في DMSO بتركيز مخزون 10 ملي
مقصأدوات العلوم الدقيقة14059-111 للشق الأولي ، 1 لشق البربخ ، 1 لقص الطرف
شاشة   37 & micro ؛ M شركة كارولينا للإمدادات البيولوجية652222Rمقطعة إلى مربعات مستديرة مقاس 3 بوصات ومعقمة في أكسيد الإيثيلين ، وانحباس الشظايا وإزالة شظايا صغيرة جدا / خلايا مفردة والحطام
شاشة 500 وميكرو ؛ M شركة Carolina Biological SupplyCompany 652222Fمقطعة إلى مربعات مستديرة مقاس 3 بوصات ومعقمة في أكسيد الإيثيلين ، تزيل الشظايا / الحطام الأكبر
HemostatFisher Scientific12-000-171تعقيم في الأوتوكلاف ، لتثبيت الجلد قبل شق
مرشح Steriflip 0.22 & mu ؛ m MilliporeSE1M179M6
ThrombinFisher العلمي6051601KUمخفف في الماء منزوع الأيونات إلى 10 U / مل ، يستخدم كعامل تخثر يحول الفيبرينوجين إلى الفيبرين
هرمون الغدة الدرقية (T3)Sigma AldrichT2877مخفف في 1N هيدروكسيد الصوديوم بتركيز مخزون 0.02 ملي مولار
الفئران الدهنية المصابة بالسكري (ZDF) - السمنة (FA / FA) أو النحيل (FA / +) الذكور   ؛نهر تشارلزhttps://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611
تم الحصول عليها من نهر تشارلز (ويلمنجتون ، ماساتشوستس). تم الحصول على الفئران في عمر 4 أسابيع وإطعامها Purina 5008 حتى القتل الرحيم (15-19 أسبوعا من العمر). كانت مستويات الجلوكوز (الدم من الوريد الصافن الجانبي) أكبر من 300 مجم / ديسيلتر في جميع الفئران FA / FA المستخدمة في الدراسة. تم إيواء جميع في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها مع دورة ضوء وظلام مدتها 12 ساعة وتم إطعامها بشكل خاص.
تمت تمت حجما

المراجع

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم