يصف هذا البروتوكول الخطوات الرئيسية لتوليد وتوصيف عضويات 3D عن طريق الفم والمريء التي تمثل آفات سرطان الخلايا الطبيعية والأورام والحرشفية الناجمة عن التسرطن الكيميائي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نمذجة سرطان الخلايا الحرشفية الفموية المريئية في عضويات 3D
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ينتشر سرطان الخلايا الحرشفية المريئي (ESCC) في جميع أنحاء العالم ، حيث يمثل 90٪ من جميع حالات سرطان المريء كل عام ، وهو الأكثر فتكا من بين جميع سرطانات الخلايا الحرشفية البشرية. على الرغم من التقدم الأخير في تحديد التغيرات الجزيئية المصاحبة لبدء ESCC وتطوره ، لا يزال تشخيص المريض ضعيفا. إن التعليق التوضيحي الوظيفي لهذه التغييرات الجزيئية هو الخطوة التالية الضرورية ويتطلب نماذج تلتقط السمات الجزيئية ل ESCC ويمكن معالجتها بسهولة وبتكلفة زهيدة للتعليق التوضيحي الوظيفي. الفئران المعالجة بمحاكاة دخان التبغ 4-نيتروكينولين 1-أكسيد (4NQO) تشكل بشكل متوقع ESCC والأورام المريئية. وتجدر الإشارة إلى أن آفات 4NQO تنشأ أيضا في تجويف الفم ، والأكثر شيوعا في اللسان ، وكذلك المعدة الأمامية ، والتي تشترك جميعها في ظهارة الحرشفية الطبقية. ومع ذلك ، لا يمكن التلاعب بهذه الفئران ببساطة لاختبار الفرضيات الوظيفية ، حيث أن توليد نماذج الفئران متساوية المنشأ يتطلب وقتا طويلا وموارد. هنا ، نتغلب على هذا القيد عن طريق توليد عضويات ثلاثية الأبعاد (3D) مشتقة من خلية واحدة من الفئران المعالجة ب 4NQO لتوصيف الفئران ESCC أو الخلايا قبل الورمية خارج الجسم الحي. تلتقط هذه الكائنات العضوية السمات البارزة ل ESCC وأورام المريء ، ويمكن الاستفادة منها بثمن بخس وبسرعة لتشكيل نماذج متساوية المنشأ ، ويمكن استخدامها في تجارب زرع الجينات المتزامنة. نوضح كيفية توليد عضويات 3D من أنسجة المريء العادية ، preneoplastic ، و SCC الفئران والحفاظ على هذه المواد العضوية وحفظها بالتبريد. تطبيقات هذه الكائنات العضوية متعددة الاستخدامات واسعة وتشمل استخدام الفئران المعدلة وراثيا والمزيد من التوصيف عن طريق قياس التدفق الخلوي أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، وتوليد خطوط عضوية متساوية الجينات باستخدام تقنيات كريسبر ، وفحص الأدوية أو زرع الجينات. نعتقد أن الاعتماد الواسع النطاق للتقنيات الموضحة في هذا البروتوكول سيسرع التقدم في هذا المجال لمكافحة العبء الشديد ل ESCC.
المقدمة
سرطان الخلايا الحرشفية المريئي (ESCC) هو أكثر سرطانات الخلايا الحرشفية البشرية فتكا ، بسبب التشخيص المتأخر ومقاومة العلاج وورم خبيث 1,2. ينشأ ESCC من الظهارة الحرشفية الطبقية ، التي تبطن السطح اللمعي للمريء. تتكون الظهارة الحرشفية من خلايا قاعدية تكاثرية وخلايا متمايزة داخل طبقة الخلايا فوق القاعدية. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تعبر الخلايا القاعدية عن علامات مثل p63 و Sox2 و cytokeratin K5 و K14 ، بينما تعبر الخلايا المتمايزة عن K4 و K13 و IVL. الخلايا القاعدية نفسها غير متجانسة وتشمل الخلايا الجذعية المفترضة المحددة بعلامات مثل K153 و CD734. في الاتزان الداخلي، ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تخطيط تجارب الفئران وتنفيذها وفقا للوائح وبموجب البروتوكول الحيواني #AABB1502 ، وتمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كولومبيا. تم إيواء الفئران في مرفق مناسب لرعاية الحيوانات يضمن المعاملة الإنسانية للفئران ويوفر الرعاية البيطرية المناسبة للفئران والتدريب على سلامة المختبرات لموظفي المختبر.
1. علاج الفئران ب 4NQO للحث على آفات المريء IEN و ESCC (النظر في الوقت: حتى 28 أسبوعا)
ملاحظة: لتوليد MEOs تمثل آفات المريء الورمية ، تتعرض الفئران للتسرطن الكيميائي بوساطة 4NQO كما وصفه سابقا Tang et al.14. يتم إنشاء MEOs العادية / غير الو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصف هذا البروتوكول عملية توليد عضويات المريء الفأر (MEOs) من أنسجة المريء الطبيعية أو أنسجة ورم ESCC من الفئران المعالجة ب 4NQO وفقا لنظام علاج محدد يتكون من 16 أسبوعا من 4NQO تدار في مياه الشرب ، تليها فترة مراقبة من 10 أسابيع إلى 12 أسبوعا (الشكل 1). ثم يتم القتل الرحيم للفئران لتشريح اللسان أو أنسجة المريء (الشكل 2 والشكل 3). نصف طريقة لعزل الطبقة الظهارية عن المريء السليم (الشكل 4) لاستخدامها في عزل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك العديد من الخطوات والاعتبارات الحاسمة لتوليد وتحليل MEOs في البروتوكولات الموضحة هنا. لضمان قابلية التكرار والدقة في تجارب MEO ، تعد النسخ المتماثلة البيولوجية والتقنية مهمة. بالنسبة للتكرارات البيولوجية ، فإن اثنين إلى ثلاثة فئران مستقلة تحمل ESCC كافية بشكل عام لكل حالة تجريبية. ومع ذلك ، قد يختلف العدد المناسب من النسخ المتماثلة البيولوجية اعتمادا على المعلمات التي سيتم اختبارها في الدراسات الفردية. على سبيل المثال ، من غير المعروف حاليا مدى اكتشاف المواد العضوية الورمية في وقت مبكر وعدد المرات التي يمكن اكتشافها.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر الموارد المشتركة (قياس التدفق الخلوي ، وعلم الأمراض الجزيئي ، والفحص المجهري البؤري والمتخصص) في مركز هربرت إيرفينغ الشامل للسرطان في جامعة كولومبيا على الدعم الفني. نشكر الدكاترة آلان ديهل وآدم جيه باس وكوك كين وونغ (آليات NCI P01 لسرطان المريء) وأعضاء مختبرات روستي وناكاجاوا على المناقشات المفيدة. تم دعم هذه الدراسة من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة التالية: P01CA098101 (H.N. و A.K.R.) ، R01DK114436 (H.N.) ، R01AA026297 (H.N.) ، L30CA264714 (SF) ، DE031112-01 (F.M.H.) ، KL2TR001874 (F.M.H.) ، 3R01CA255298-01S1 (JG) ، 2L30DK126621-02
(ج.ج.) R01CA266978 (C.L.) و R01DK132251 (C.L.) و R01DE031873 (C.L.) و P30DK132710 (CM و H.N.) و P30CA0....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.05٪ تريبسين-EDTA | ثيرمو فيشر ساینتيف | 25-300-120 | |
| 0.25٪ تريبسين-EDTA | ثيرمو فيشر ساینتفيك | 25-200-114 | |
| 0.4٪ تريبان بلو | ثيرمو فيشر Scientific | T10282 | |
| 1 مل حقنة توبركولين بدون إبرة | BD | 309659 | |
| 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي | الدقيق Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 & micro; مصفاة خلية m | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 مل أنابيب مخروطية | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 & micro ؛ L واسعة التجويف نصائح الماصة الدقيقة | الحرارية فيشر العلمية | 212361A | |
| 21 جرام إبر | BD | 305167 | |
| 24 لوحة بئر | ثيرمو فيشر العلمي | 12-556-006 | |
| 4-نيتروكينولين-1-أكسيد (4NQO) | طوكيو الصناعة الكيميائية | NO250 | |
| 50 مل أنابيب مخروطية | الشكل ثيرمو فيشر Scientific | 12-565-270 | |
| 6 بئر لوحة | ثيرمو فيشر العلمية | 12556004 | |
| 70 & مايكرو ؛ مصفاة خلية m | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9٪ إيثيلين بروبيلين جلايكول | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM / F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco ، Thermo Fisher Scientific | 15290018 | تركيز المخزون 250 & micro ؛ جم / مل ، التركيز النهائي 0.5 & ميكرو ؛ جم / مل |
| 15240062 المضاد الحيوي | المضاد للفطريات الحرارية فيشر العلمي | تركيز المخزون 100x ، التركيز النهائي 1x | |
| B-27 مكمل | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | تركيز المخزون 50x ، التركيز النهائي 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 < / حاضنة فرعية > ، على سبيل المثال Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | أو ما يعادلها |
| الكونتيسة الثانية FL عداد الخلايا الآلي | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | أو ما يعادلها |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning 354235 | تركيز المخزون 50 وحدة / مل ، التركيز النهائي 2.5 &ndash ؛ 5 U / مل | |
| مقص تشريح | VWR | 25870-002 | |
| ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (PBS) | Thermo Fisher | Scientific 14190250 | 1x |
| مصل بقري الجنين (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| ملقط | VWR | 82027-386 | |
| حاوية التجميد | Corning | 432002 | أو ما يعادل |
| الجيلاتين | ثيرمو فيشر العلمي | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | تركيز المخزون 100x ، التركيز النهائي 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | تركيز المخزون 1 م ، التركيز النهائي 10 ملي |
| لوح ساخن / نمام | Corning | PC-420D | أو ما يعادله |
| من المختبر حمام حبة الدروع (أو حمام مائي) | VWR | 89409-222 | أو ما يعادله |
| من توازن المختبر | Ohaus | 71142841 | أو ما يعادله |
| من مستخلص الغشاء القاعدي Matrigel (BME) | Corning | 354234 | |
| أجهزة الطرد المركزي الدقيقة Minispin | Eppendorf | 22620100 أو ما يعادله | |
| رف أنبوب الطرد المركزي | الصغير Southern Labware | 0061 | |
| مكمل N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | تركيز المخزون 100x ، التركيز النهائي 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | تركيز المخزون 0.5 م ، التركيز النهائي 1 ملي |
| متر Parafilm M التفاف | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| كاسيت علم الأمراض | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| مجهر تباين الطور | نيكون | أو ما يعادله | |
| عامل نمو بشرة الفأر المؤتلف (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | تركيز المخزون 500 نانوغرام /& ميكرو ؛ L ، التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل |
| RN وسط مكيف للخلية يعبر عن R-Spondin1 و Noggin (RN CM) | N / A | N / A | متاح من خلال قلب الثقافة العضوية والخلوية عند الطلب ، التركيز النهائي 2٪ |
| Sorval ST 16R جهاز الطرد المركزي | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | أو ما يعادله |
| مثبط التربسين فول الصويا (STI) | MilliporeSigma | T9128 | تركيز المخزون 250 & micro ؛ جم / مل |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | أو ما يعادلها |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | تركيز المخزون 10 ملي متر ، التركيز النهائي 10 & ميكرو ؛ م |
المراجع
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
