يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الثقافة طويلة الأجل لالتهاب Caenorhabditis elegans الفردي على الوسائط الصلبة لمراقبة التألق الطولي والتدخلات البعيدة

2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64682

⸱

ديسمبر 2, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لزرع الديدان الخيطية الفردية المعزولة على وسائط صلبة لتتبع المعلمات الفسيولوجية مدى الحياة والقياس الكمي الفلوري. يتضمن نظام الاستزراع هذا حاجزا من حمض النخيل حول آبار دودة واحدة لمنع الحيوانات من الفرار ، مما يسمح باستخدام التدخلات المكروهة ، بما في ذلك البكتيريا المسببة للأمراض والضغوطات الكيميائية.

الملخص

تستخدم Caenorhabditis elegans على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الشيخوخة. تتمثل الممارسة القياسية في دراسات الشيخوخة C. elegans في استزراع مجموعات من الديدان على وسائط نمو الديدان الخيطية الصلبة (NGM) ، مما يسمح بجمع البيانات على مستوى السكان بكفاءة للبقاء على قيد الحياة والأنماط الظاهرية الفسيولوجية الأخرى ، وأخذ العينات الدورية من المجموعات الفرعية لتحديد كمية العلامات الحيوية الفلورية. تتمثل القيود المفروضة على هذا النهج في عدم القدرة على (1) تتبع الديدان الفردية بمرور الوقت لتطوير مسارات العمر للأنماط الظاهرية ذات الأهمية و (2) مراقبة المؤشرات الحيوية الفلورية مباشرة في سياق بيئة الاستزراع. تستخدم مناهج الاستزراع البديلة الاستزراع السائل أو الموائع الدقيقة لمراقبة الحيوانات الفردية بمرور الوقت ، وفي بعض الحالات بما في ذلك القياس الكمي للتألق ، مع المفاضلة بين بيئة الاستزراع تختلف سياقا عن NGM الصلب. WorMotel هو جهاز متعدد الآبار دقيق الصنع تم وصفه سابقا لزراعة الديدان المعزولة على NGM الصلب. يتم الاحتفاظ بكل دودة في بئر يحتوي على NGM صلب محاط بخندق مملوء بكبريتات النحاس ، وهو طارد ملامس ل C. elegans ، مما يسمح بالمراقبة الطولية للحيوانات الفردية. نجد كبريتات النحاس غير كافية لمنع الديدان من الفرار عند تعرضها لتدخلات مكروهة شائعة في أبحاث الشيخوخة ، بما في ذلك تقييد النظام الغذائي والبكتيريا المسببة للأمراض والعوامل الكيميائية التي تحفز الإجهاد الخلوي. يتم تشكيل الأجهزة متعددة الآبار أيضا من polydimethylsiloxane ، والتي تنتج قطعا أثرية عالية الخلفية في التصوير الفلوري. يصف هذا البروتوكول نهجا جديدا لاستزراع الديدان المستديرة المعزولة على NGM الصلبة باستخدام صواني البوليسترين الدقيقة المتاحة تجاريا ، والمصممة أصلا لكتابة مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) ، مما يسمح بقياس البقاء على قيد الحياة ، والأنماط الظاهرية الفسيولوجية ، والتألق عبر العمر. يمنع حاجز حمض النخيل الديدان من الفرار ، حتى في وجود ظروف مكروهة. يمكن لكل طبق استزراع ما يصل إلى 96 حيوانا ويتكيف بسهولة مع مجموعة متنوعة من الظروف ، بما في ذلك القيود الغذائية ، والحمض النووي الريبي ، والمواد المضافة الكيميائية ، وهو متوافق مع الأنظمة الآلية لجمع بيانات العمر والنشاط.

المقدمة

C. elegans هي كائن نموذجي قوي للبحث في علم الوراثة ، والبيولوجيا الخلوية ، والبيولوجيا الجزيئية ، لأنها يمكن استزراعها بسهولة في المختبر ، ولها وقت وعمر جيل قصير ، وتشترك في درجة عالية من تماثل البروتين مع الثدييات ، ولها بنية جسم شفافة تسمح في الجسم الحي بتصور البروتينات والأصباغ الفلورية1. نتيجة للاستخدام طويل الأمد ل C. elegans كنظام نموذجي رئيسي في مجموعة من المجالات ، بما في ذلك علم الأحياء التنموي والشيخوخة ، فإن نموها وتطورها مفهومان جيدا ، وقد تم تسلسل جينومها بالكامل ، وتم إنشاء مجموعة من الأدوات الوراثية القوية ، بما في ذلك مكتبات تغذية RNAi على مستوى الجينوم والآلاف من السلالات الطافرة والمحورة وراثيا. تاريخيا ، تزرع C. elegans كمجموعات على وسائط نمو نيماتودا أجار صلبة (NGM) ، ويتم تقييم الأنماط الظاهرية يدويا إما عن طريق الملاحظة المباشرة أو عن طريق التصوير والتحليل النهائي. يستخدم المجهر الفلوري لالتقاط مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية الجزيئية باستخدام الأصباغ أو علامات الفلورسنت المعبر عنها وراثيا في C. elegans الفردية. يتضمن التصوير بالفلورسنت عادة تثبيت أو شله على شرائح تحتوي على وسادات أغاروز رقيقة ، وهو أمر غازي وغالبا ما يكون مميتا. كما أنه ينطوي على استخدام المواد الكيميائية ، مثل ليفاميزول أو أزيد الصوديوم ، والتي يمكن أن تتداخل مع العملية الجزيئية محل الاهتمام 2,3. تسمح هذه الأساليب مجتمعة بجمع بيانات مستعرضة على مستوى السكان عبر مجموعة واسعة من الأنماط الظاهرية ، ولكنها لا تسمح بتتبع الحيوانات الفردية بمرور الوقت.

في السنوات الأخيرة ، ظهرت عدة طرق لزراعة C. elegans المعزولة ، مما يسمح للباحثين بالتقاط التغيرات الديناميكية في الأنماط الظاهرية الفسيولوجية والجزيئية للحيوانات بمرور الوقت باستخدام تقنيات التصوير الجديدة. إحدى فئات نهج ثقافة C. elegans هي أجهزة الموائع الدقيقة ، بما في ذلك WormFarm4 ، وشريحة Nemalife5 ، وشريحة "السلوك" بواسطة Chronis et al.6 ، من بين العديد من الأجهزة الأخرى7،8،9. ترتبط بهذه الطرق الاستزراع القائمة على السائل ، والتي تستخدم لوحات متعددة الآبار لتوصيف الديدان الفردية أو المجموعات الصغيرة بمرور الوقت10,11. توفر الموائع الدقيقة وأنظمة الصفائح الدقيقة قياسات كمية ممتازة لاستجابات النمط الظاهري في C. elegans وصولا إلى واحد ، لكن بيئة الاستزراع تمثل قيدا رئيسيا. تم الانتهاء من الغالبية العظمى من الأبحاث السابقة في C. elegans ، لا سيما في مجال الشيخوخة ، على وسائط صلبة قائمة على أجار. تتسبب الثقافة السائلة في سباحة C. elegans بشكل مستمر وتمثل سياقا بيئيا متميزا يمكن أن يغير البيولوجيا الأساسية. على سبيل المثال ، الحيوانات المستزرعة في الوسائط السائلة قد غيرت بشكل كبير محتوى الدهون والتعبير الجيني - خاصة بالنسبة للجينات المشاركة في الاستجابة للإجهاد - بالنسبة للحيوانات المستزرعة على NGM12،13 الصلبة القائمة على أجار. تتضمن فئة بديلة من طرق التصوير أحادية الحيوان أجهزة polydimethylsiloxane (PDMS) التي تعزل الحيوانات الفردية على وسائط صلبة ، في محاولة لمحاكاة البيئة القياسية التي تعاني منها الديدان المستزرعة على NGM الصلب في ثقافة المجموعة على ألواح بتري. WorMotel هو جهاز PDMS مكون من 240 بئرا مصمم لتربية الحيوانات الفردية على وسائط صلبة. يتم ملء كل بئر ب NGM معدل باستخدام أغاروز منخفض الذوبان بدلا من الآجار وبذره بالأغذية البكتيرية ، مما يخلق بيئة وسائط صلبة مماثلة لنظام الاستزراع الأكثر شيوعا باستخدام ألواح بتري. جدران البئر مستديرة ، مما يسمح بتصوير كل بغض النظر عن موقعه في البئر (تجنب الحجب البصري الذي يسببه بالقرب من جدار في لوحة متعددة الآبار). تستخدم كبريتات النحاس في خندق ضيق يحيط بكل بئر كرادع لإبقاء الحيوانات في آبارها14,15. يتمثل أحد قيود هذا النهج في أن كبريتات النحاس غير فعالة في منع الديدان من الفرار عند وجود ظروف بيئية مكروهة ، بما في ذلك القيود الغذائية أو البكتيريا المسببة للأمراض أو المواد الكيميائية التي تحفز الإجهاد الخلوي (مثل الباراكوات).

النظام الثاني الذي يستخدم الوسائط الصلبة هو Worm Corral ، الذي يستخدم هيدروجيل لإنشاء بيئة صغيرة محكمة الغلق لكل دودة على شريحة ، مما يسمح بمراقبة طويلة الأجل للحيوانات المعزولة بشكل فردي16. أحد القيود الرئيسية هو أن الحيوانات يجب أن تكون مغلقة في البيئة كبيض ، مما يتطلب استخدام الحيوانات العقيمة لمنع التكاثر ، وقصر العلاجات الدوائية على تطبيق واحد. يمكن إجراء تجارب دوائية متعددة الجرعات في WorMotel إما عن طريق إجراء جولات متعددة من التعرض قبل نقل الديدان إلى الجهاز أو عن طريق إضافة أدوية إضافية موضعيا إلى الآبار أثناء التجربة ؛ ومع ذلك ، في الحالة الأخيرة ، يصعب تحديد جرعة التعرض الفعلية بعد إضافة دواء إضافي إلى بئر موجود بدقة وتعتمد على مدى سرعة تحلل الدواء. يعد كل من WorMotel و Worm Corral ممتازين لتصوير برايتفيلد أو دارك فيلد لالتقاط المعلومات المتعلقة بالنشاط وفسيولوجيا الحيوان (مثل النمو والتطور). في حين يمكن استخدام هذه الأنظمة لمراقبة التألق ، في تجربتنا ، فإن PDMS المستخدمة لإنشاء تقنيات التصوير الأخرى أحادية الدودة عرضة لتشكيل فقاعات دقيقة ، والتقاط الجسيمات ، وغيرها من التشوهات الصغيرة التي تولد القطع الأثرية الفلورية غير المنتظمة التي تتداخل مع التصور الفلوري المتسق والقياس الكمي ، خاصة في نطاق الانبعاثات ل GFP ، الفلوروفور الأكثر شيوعا المستخدم في أبحاث C. elegans. حتى الآن ، يعتمد التصوير الفلوري الحي للحيوانات الفردية C. elegans بطريقة طولية بشكل أساسي على أجهزة الموائع الدقيقة17.

هنا ، نصف طريقة جديدة لزراعة C. elegans الفردية على وسائط صلبة متوافقة مع كل من التدخلات المكروهة والتصوير الفلوري المباشر. يشبه هذا النهج في المفهوم تقنيات التصوير الأخرى أحادية الدودة ، باستثناء أنه يتم استبدال شريحة PDMS المصبوبة خصيصا بصواني دقيقة من البوليسترين متاحة تجاريا تم تطويرها في الأصل لمقايسات السمية الخلوية الدقيقة (وتسمى أيضا صواني Terasaki)18. تتميز هذه الصواني الدقيقة بآبار يمكن ملؤها بالوسائط الصلبة وبذرها بالأغذية البكتيرية ، مما يحاكي عن كثب البيئة التي تعاني منها الحيوانات في ظل منهجية استزراع NGM الصلبة القياسية. كل بئر محاط بحاجز مكروه من حمض النخيل بدلا من كبريتات النحاس. يستخدم حمض البالمتيك بشكل شائع لمنع الديدان من الفرار من الوسائط الصلبة ، باستخدام ثقافة المجموعة القياسية على ألواح بتري في التجارب التي تواجه فيها الديدان بيئة مكروهة مثل القيود الغذائية أو التعرض لضغوط كيميائية. تنتج الصواني الدقيقة أيضا خلفية فلورية بسيطة ومتسقة ، مما يسمح بالتصوير الفلوري للحيوانات مباشرة في بيئة الاستزراع الخاصة بهم. لا يسمح نظام الاستزراع الجديد القائم على الأجار الصلب أحادي الحيوان بتتبع الحيوانات الفردية طوال الحياة ومراقبة النمو والتطور والنشاط والعمر فحسب ، بل إنه متوافق أيضا مع الفحص المجهري الفلوري المباشر. نظرا لأنه يمكن تصوير الديدان دون شلل أو تثبيت ، يمكن قياس المؤشرات الحيوية الفلورية في الجسم الحي طوليا في الحيوانات الفردية المتبقية على وسائط الاستزراع الخاصة بها ، مما يسمح بملاحظة التغيرات الديناميكية على مدى عمر كل. يتوافق نظام الثقافة هذا أيضا مع الأنظمة الآلية من الجيل الحالي لتتبع العمر الافتراضي والمقاييس الصحية الأخرى14,19. نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لزراعة C. elegans الفردية في هذا النظام القائم على microtray ، ومناقشة المزالق المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، ومناقشة المزايا والقيود المتعلقة بالأنظمة الأخرى ، وعلى وجه الخصوص ، بروتوكول WorMotel15 المحدث والمحسن.

تتكون كل بيئة استزراع دودة واحدة من صينية صغيرة مثبتة داخل صينية قياسية أحادية البئر باستخدام محول مخصص مطبوع 3D (الشكل 1A). تمتلئ الآبار بوسائط نمو نيماتودا الأغاروز منخفضة الذوبان (lmNGM) ، وتزرع بالبكتيريا المركزة كمصدر للغذاء ، وتحيط بها طبقة حمض النخيل لمنع الديدان من الفرار (الشكل 1 ب). تمتلئ المسافة بين microtray وجدران لوحة البئر الواحد ببلورات الماء المشبع للحفاظ على الرطوبة (الشكل 1B). يتم تطبيق طلاء منظف على غطاء الدرج لمنع التكثيف. تتم إضافة دودة واحدة إلى كل بئر ، ويتم إغلاق صينية البئر الواحدة باستخدام Parafilm للحفاظ على الرطوبة والسماح بتبادل الأكسجين. يمكن تحضير ما يصل إلى ستة صواني دقيقة بشكل معقول بالتوازي من قبل باحث واحد ممارس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. وصفات

ملاحظة: قم بإعداد حلول المخزون قبل البدء في تحضير لوحة الدرج الدقيق.

  1. حلول المخزون لوسائط نمو نيماتودا الأغاروز منخفضة الذوبان (lmNGM)
    1. تحضير 1 M K 2 HPO4 عن طريق إذابة 174.18 جم من K2HPO4 في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات المعقم في زجاجة سعة 1 لتر. الأوتوكلاف الحل في 121 درجة مئوية ، 15 رطل / بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. تحضير 1 M KPi (درجة الحموضة 6.0) عن طريق إذابة 136.09 جم من KH2HPO4 في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات المعقم في زجاجة 1 لتر. قم بمعايرة المحلول باستخدام 1 M K2HPO4 لتحقيق الرقم الهيدروجيني 6.0. الأوتوكلاف الحل في 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة وتخزينه في RT.
    3. تحضير 1 M CaCl 2 عن طريق إذابة 73.5 g من CaCl2 في 500 mL من الماء منزوع الأيونات المعقم في زجاجة سعة 500 mL. الأوتوكلاف الحل في 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة وتخزينه في RT
    4. تحضير 1 M MgSO 4 عن طريق إذابة 123.25 g من MgSO4 في 500 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في زجاجة 500 مل. الأوتوكلاف الحل في 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة وتخزينه في RT.
    5. تحضير 3 M كلوريد الصوديوم ل lmNGM: في زجاجة نظيفة 100 مل ، امزج 100 مل من الماء عالي النقاء و 18.20 جم من كلوريد الصوديوم. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة.
    6. قم بإعداد 5 مجم / مل من الكوليسترول عن طريق الجمع بين 2.5 جم من الكوليسترول و 275 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ و 25 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في زجاجة كهرمانية سعة 500 مل. الأوتوكلاف الحل في 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة وتخزينه في RT.
    7. تحضير 50 mM fluorodeoxyuridine (FUdR) عن طريق إذابة 0.1231 g من FUdR في 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في أنبوب مخروطي 15 mL. استخدم حقنة 10 مل وفلتر 0.22 ميكرومتر لتعقيم المحلول. القسمة 1 مل من المحلول في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    8. تحضير 50 مجم / مل كاربينيسيلين عن طريق إذابة 500 مجم من الكاربينيسيلين في 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. استخدم حقنة 10 مل وفلتر 0.22 ميكرومتر لتعقيم المحلول. القسمة 1 مل من المحلول في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    9. تحضير 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) عن طريق إذابة 2.38 جم من IPTG في 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في أنبوب مخروطي 15 مل. استخدم حقنة 10 مل وفلتر 0.22 ميكرومتر لتعقيم المحلول. القسمة 1 مل من المحلول في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    10. تحضير 100 ملغم / مل من الأمبيسلين عن طريق إذابة 1 غرام من الأمبيسلين في 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في أنبوب مخروطي 15 مل. استخدم حقنة 10 مل وفلتر 0.22 ميكرومتر لتعقيم المحلول. القسمة 1 مل من محلول الأمبيسلين 100 مجم / مل في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة وتخزين الأنابيب عند -20 درجة مئوية.
  2. تحضير وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) للصيانة العامة ل C. elegans
    1. لعمل 50 طبقا ، قم بإذابة 10 جم من باكتو أجار ، و 1.5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.25 جم من باكتو بيبتون في 486 مل من الماء عالي النقاء في دورق سعة 1 لتر. تعقيم الوسط عن طريق تعقيمه على دورة سائلة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    2. بعد الأوتوكلاف ، اترك الوسط يبرد إلى 55 درجة مئوية. ثم أضف 12.5 مل من 1 M KPi ، و 500 ميكرولتر من 1 M MgSO4 ، و 500 ميكرولتر من 1 M CaCl2 ، و 500 ميكرولتر من 5 مجم / مل كوليسترول إلى المحلول.
    3. باستخدام تقنية معقمة ، صب 10 مل من الوسط المحضر في الخطوة 1.2.2 في كل لوحة 60 مم (إجمالي 50). اترك الألواح مع الوسائط لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى تتصلب. ماصة 300 ميكرولتر من المستنبتة البكتيرية المزروعة طوال الليل على مركز اللوحة واترك اللوحة على المقعد. اسمح للثقافة أن تجف وتنمو أكثر سمكا لمدة 1-2 أيام. قم بتخزين ألواح NGM هذه مع البكتيريا في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  3. تحضير خليط lmNGM
    1. في دورق Erlenmeyer سعة 250 مل ، امزج 2 g من الأغاروز منخفض الذوبان ، و 0.25 g من الببتون ، و 1 mL من 3 M NaCl ، و 99 mL من الماء عالي النقاء. الأوتوكلاف الحل عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة.
    2. قسمة 10 مل من lmNGM في أنابيب الاختبار وتغطيتها ب Parafilm لمنع فقدان السائل. قم بتغطية الأنابيب واتركها تبرد وتصلب.
  4. تحضير 85 ملليمتر كلوريد الصوديوم للأغذية البكتيرية: في زجاجة 100 مل ، امزج 515.61 مجم من كلوريد الصوديوم واملأ ما يصل إلى 100 مل بالماء عالي النقاء. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة.
  5. قم بإعداد بلورات بولي أكريلاميد الممتصة للماء عن طريق إذابة 1 جم من البوليمر فائق الامتصاص من النوع S في 150 مل من الماء عالي النقاء في زجاجة ضغط قابلة للتصفيق. قطع الطرف لضمان حجم توزيع مناسب. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة ، يغطى بورق القصدير ، ويهز لخلط البلورات.
  6. قم بإعداد محلول منظف من خلال الجمع بين 3 مل من 100٪ Tween-20 مع 7 مل من الماء عالي النقاء في قنينة مخروطية سعة 15 مل.
  7. تحضير 5 ملغ / مل من الكوليسترول عن طريق الجمع بين 2.5 غرام من الكوليسترول ، 275 مل من 100 ٪ EtOH ، و 25 مل من الماء عالي النقاء في زجاجة 500 مل.
  8. تحضير محلول عمل حمض النخيل
    1. طحن 500 ملغ من حمض النخيل الصلب في هاون ومدقة والجمع بينه مع 15 مل من توين -20 في قارورة مخروطية 50 مل. تخلط عن طريق الدوامة ، إذابة أكبر عدد ممكن من البلورات.
    2. أضف 17.5 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ودوامة المحلول لإذابة أكبر قدر ممكن من حمض البالمتيك.
    3. أضف 17.5 مل من الماء عالي النقاء والدوامة بدقة. سخني المحلول برفق في حمام حبة على حرارة 80 درجة مئوية حتى يذوب حمض البالمتيك تماما. قد يترسب بعض حمض البالمتيك أثناء التبريد.
  9. تحضير مرق الليزوجيني (LB) عن طريق خلط 20 جم من مسحوق LB في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات في دورق 1 لتر أو أكبر. قسمة 500 mL من المرق إلى كأسين 500 mL. الأوتوكلاف المرق على حرارة 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة. تخزين المرق المعدة في RT.
  10. تحضير ألواح أجار مرق الليزوجيني (LB)
    1. امزج 10 جم من مسحوق LB و 7.5 جم من Bacto agar في 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في قارورة سعة 1 لتر. الأوتوكلاف المحلول على دورة سائلة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 30 دقيقة.
    2. إذا رغبت في ذلك ، أضف مضادات حيوية اختيارية (500 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين) بعد تبريد الوسائط المعقمة إلى 55 درجة مئوية. باستخدام تقنية معقمة ، اصنع ألواح أجار LB عن طريق صب 20 مل من الوسائط في كل لوحة 100 مم (إجمالي 25). قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية.

2. إعداد مجموعة من الديدان المتزامنة مع العمر

  1. قم بإعداد مجموعة من الديدان المتزامنة مع العمر والتي تكون جاهزة للإضافة إلى microtray في مرحلة اليرقات 4 (L4). بدلا من ذلك ، يمكن إضافة الديدان في أي مرحلة من مراحل الحياة (يجب استبعاد FUdR من وسائط microtray إذا تمت إضافة الديدان في مرحلة نمو أبكر من L4 لمنع توقف النمو).
    ملاحظة: يجب إكمال هذه الخطوة قبل يومين من إضافة الديدان إلى microtray إذا كانت مرحلة الحياة المستهدفة في بداية التجربة هي L4. يمكن ضبط توقيت التزامن للسماح للديدان بالوصول إلى مرحلة الحياة المطلوبة.
  2. يمكن أن تؤثر درجة الحرارة على العمر. للحصول على نتائج متسقة ، استخدم ألواح NGM القياسية (انظر القسم 1) للحفاظ على C. elegans عند 20 درجة مئوية ، ونقل الديدان إلى أطباق طازجة إذا نفدت من الطعام البكتيري.
  3. من لوحات المخزون مع العديد من الديدان البالغة الشابة ، استخدم نهجا قياسيا لتوليد مجموعة سكانية متزامنة مع العمر ، وأكثرها شيوعا تبييض20 أو وضعبيض محدد بوقت 21.
  4. اعزل البيض وأضفه إلى طبق NGM المرقط بالبكتيريا. في حالة استخدام C. elegans من النوع البري ، سوف يفقس البيض ويشكل الديدان ، ليصل إلى مرحلة اليرقات L4 في 2 أيام.

3. تحضير ثقافة البكتيريا

  1. في اليوم السابق لبدء التجربة ، قم بتلقيح مصدر الغذاء البكتيري المطلوب. تحضير ~ 5 مل من الثقافة البكتيرية لكل لوحة.
    ملاحظة: يمكن تحضير الخط البكتيري حتى 1 شهر مقدما وتخزينه عند 4 درجات مئوية لمصدر غذاء الإشريكية القولونية .
    1. قم بتحريك البكتيريا للمستعمرات الفردية على صفيحة أجار LB من مخزون الجلسرين المجمد.
    2. قم بزراعة الثقافة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    3. تلقيح مرق LB السائل مع مستعمرة واحدة لكل تلقيح.
    4. يهز في ~ 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.

4. تطبيق طلاء حمض النخيل على microtray

ملاحظة: يعمل حمض البالمتيك كحاجز مكروه لمنع هروب الحيوانات من الآبار الفردية. يتم تطبيق الطلاء على السطح السفلي بالكامل للدرج الصغير ، باستثناء الأسطح الداخلية للآبار. يضاف النيستاتين إلى حمض النخيل للتخفيف من التلوث الفطري. يمكن إكمال هذه الخطوة قبل 1 يوم من بدء التجربة إذا رغبت في ذلك.

  1. اضبطي حمام الخرزة على 80 درجة مئوية لإتاحة الوقت للتسخين المسبق.
  2. مباشرة قبل الاستخدام ، قم بتخصيص 1 مل من محلول عمل حمض البالمتيك لكل ميكروصينية في حاوية معقمة منفصلة (عادة ما تكون قارورة مخروطية سعة 15 مل) وأضف 4 ميكرولتر من 10000 وحدة / مل نيستاتين لكل 1 مل من محلول حمض البالمتيك قبل التسخين.
  3. رش داخل وخارج microtray مع الإيثانول (70 ٪ أو أكثر) للتشبع والتخلص من الإيثانول الزائد.
    ملاحظة: يجب أن يتبخر الإيثانول المتبقي أثناء المعالجة في التشابك مع الأشعة فوق البنفسجية (الخطوة 4.4).
  4. استخدم رابط متشابك للأشعة فوق البنفسجية لتعقيم الدرج الدقيق (التعليمات التالية مخصصة للرابط المتشابك للأشعة فوق البنفسجية المستخدمة في هذه الدراسة):
    1. ضع الدرج الصغير والغطاء في التشابك للأشعة فوق البنفسجية بشكل منفصل (على سبيل المثال ، لا تضع الأغطية على الألواح ، لأن الأشعة فوق البنفسجية لا تخترق البلاستيك).
    2. أغلق الباب وقم بتشغيل رابط الأشعة فوق البنفسجية.
    3. اضغط على الوقت، وأدخل 20 دقيقة، ثم اضغط على ابدأ.
    4. بعد 20 دقيقة ، اقلب اللوحة والغطاء وكرر الخطوات 4.2.2-4.2.3.
    5. أثناء ارتداء القفازات ، ضع الأغطية على الدرج الصغير لمنع التلوث بعد التعقيم.
  5. امزج محلول عمل حمض البالمتيك جيدا عن طريق الدوامة والتقليب.
  6. ضع القارورة المخروطية سعة 15 مل مع محلول عمل حمض البالمتيك في حمام الخرزة واترك أي بلورات مرئية تذوب تماما قبل الاستخدام.
  7. ضع الدرج الصغير على الحافة المحيطة بحمام الخرزة مع وضع الأغطية لمدة ~ 2 دقيقة للإحماء.
  8. قم بإزالة غطاء الدرج الدقيق. أضف ببطء 200 ميكرولتر من محلول عمل حمض البالمتيك عبر الجدار الخلفي (الجانب الطويل) من الدرج الصغير. استبدل الأغطية واترك الدرج الصغير يجلس على حمام الخرز لمدة 2-3 دقائق للسماح لمحلول حمض البالمتيك بالاستقرار عبر قاع الدرج الصغير.
    ملاحظة: في حين أن الجزء السفلي الكامل من الدرج الصغير لن يكون مطليا بالكامل حتى الخطوة 4.10 ، يجب أن ينتشر المحلول بالتساوي على أكثر من نصف السطح السفلي. إذا لم ينتشر محلول حمض النخيل بالتساوي ، فقم بتشغيل دوامة أو محرك اهتزازي بالقرب من الدرج الصغير. سيوفر هذا كمية صغيرة من الاهتزاز يمكن أن تساعد في السماح لمحلول حمض النخيل بالانتشار بسهولة أكبر. حافظ على أغطية الميكروصينية في مكانها للتخفيف من التلوث.
  9. كرر الخطوة 4.8.
    ملاحظة: يجب تغطية ما يقرب من نصف أو أكثر من قاع الدرج الدقيق بشكل واضح بحمض البالمتيك السائل.
  10. قم بتدوير الدرج الصغير 180 درجة وكرر الخطوتين 4.8 و 4.9 على الجانب الآخر من الدرج.
    ملاحظة: سيتم تغطية الجزء السفلي من صينية Terasaki بطبقة رقيقة من محلول حمض النخيل فقط بعد إضافة الحجم المجمع الكامل إلى كلا الجانبين (الخطوتان 4.9 و 4.10). قد تكون هناك حاجة إلى خليط حمض البالمتيك أكثر أو أقل اعتمادا على تحضير الخليط ودرجة الحرارة وعوامل أخرى. بشكل عام ، سيكون ما بين 400 إلى 800 ميكرولتر من خليط حمض النخيل كافيا لتغطية الجزء السفلي بالكامل من الدرج الصغير. بمجرد تغطية الجزء السفلي من microtray بشكل واضح ، لا ينبغي إضافة حمض النخيل الإضافي ، لأن هذا يمكن أن يلوث الآبار.
  11. جفف الدرج في صندوق تجفيف معقم أو غطاء تدفق رقائقي لمدة 1 ساعة على الأقل مكشوفة. بدلا من ذلك ، أكمل هذه الخطوة في اليوم السابق لتحميل الألواح (القسم 5) ، وقم بتجفيف الدرج الصغير مع الغطاء عند RT لمدة 16 ساعة على الأقل.

5. تحميل الدرج الصغير بوسائط نمو النيماتودا منخفضة الذوبان (lmNGM)

ملاحظة: تستخدم هذه الطريقة NGM القياسي الممزوج بالأغاروز منخفض الذوبان بدلا من الأجار المعتاد. يمكن أن يبدأ الأجار في الهلام عند 45 درجة مئوية. عند العمل مع الأحجام الصغيرة اللازمة لملء آبار الدرج الصغير ، غالبا ما تسد NGM القائمة على أجار طرف الماصة و / أو تنتج أسطح بئر غير مستوية بسبب التبلور السريع. يبدأ NGM باستخدام الأغاروز منخفض الذوبان في الهلام عند ~ 28 °C ، مما يسمح بسهولة سحب الوسائط المنصهرة وتشكيل أسطح الآبار المسطحة باستمرار. قم بإعداد lmNGM في نفس اليوم الذي سيتم فيه وضع الديدان على الدرج الصغير. في حالة تحضير الدرج الدقيق باستخدام lmNGM ، والبذر بالبكتيريا ، وتحميل C. elegans في نفس اليوم ، تأكد من أن الحيوانات في العمر المطلوب أو بالقرب منه قبل البدء في هذه المجموعة من الخطوات.

  1. ضع حوض ماصة في حمام خرز 80 درجة مئوية للتدفئة.
  2. قم بإذابة خليط أولي واحد سعة 10 مل lmNGM لكل صينية دقيقة يتم تحضيرها (الخطوة 1.1) في الميكروويف لمدة ~ 30-45 ثانية.
    1. ضع أنابيب اختبار الخلط المسبق lmNGM في دورق سعة 200 مل ، مكشوفا حتى لا تنقلب.
    2. بعد ~ 10-15 ثانية ، أو عندما يبدأ الخليط الأولي lmNGM في الفقاعات ، أوقف الميكروويف مؤقتا ، واسكب الخليط الأولي lmNGM في دورق معقم سعة 200 مل ، واستأنف الميكروويف.
    3. توقف مؤقتا حسب الحاجة لمنعه من الغليان ، وقم بالدوران للخلط.
    4. توقف عن الميكروويف بمجرد أن يتحول كل lmNGM إلى سائل بدون قطع.
      ملاحظة: تكفي حصة واحدة سعة 10 مل لملء ما مجموعه 192 بئرا (صينيتان صغيرتان).
  3. تحضير lmNGM بإضافة المكونات التالية بالترتيب المدرج إلى أغاروز الذوبان المنخفض الدافئ (الأحجام لكل 10 مل من الأغاروز منخفض الذوبان): 250 ميكرولتر من 25 مللي مول KPi (درجة الحموضة 6) ، 10 ميكرولتر من 1 M CaCl2 ، 10 ميكرولتر من 1 M MgSO4 ، و 10 ميكرولتر من 5 ملغ / مل من الكوليسترول
    1. إذا كان الباحث يخطط لفحص الحيوانات البالغة بمرور الوقت ويحتاج إلى منع التكاثر ، أضف أيضا 10 ميكرولتر من 50 mM FUdR.
    2. في حالة إجراء تجربة تغذية RNAi باستخدام سلالة HT115 RNAi E. coli الشائعة وبلازميدات RNAi المرتبطة بها ، أضف أيضا 5 ميكرولتر من 50 مجم / مل كاربينيسيلين (لاختيار بلازميد RNAi) و 12 ميكرولتر من 1 mM IPTG (للحث على التعبير عن الحمض النووي الريبي المزدوج الشريط من بلازميد RNAi).
      ملاحظة: يمكن تضمين إضافات إضافية اعتمادا على المضادات الحيوية الانتقائية والمواد الكيميائية الأخرى اللازمة لمصدر الغذاء المطلوب. يمكن أيضا إضافة الأدوية أو الضغوطات الكيميائية إلى lmNGM في هذه المرحلة. يحتوي NGM و lmNGM على نفس التركيز النهائي لكلوريد الصوديوم ولكنهما يختلفان في كيفية إضافة كلوريد الصوديوم إلى الوسائط. بالنسبة ل NGM ، تتم إضافة كل كلوريد الصوديوم أثناء إعداد الوسائط (الخطوة 1.2). بالنسبة ل lmNGM ، يضاف جزء من كلوريد الصوديوم أثناء تحضير الوسائط (الخطوة 5.3) وجزء مع الطعام البكتيري (القسم 6). ينبع سبب هذا التغيير من حجم الوسائط الصغير في كل بئر microtray. إن إضافة 5 ميكرولتر من البكتيريا المركزة المعلقة في LB إلى بئر يحتوي على 20 ميكرولتر من الوسائط سيغير بشكل كبير التركيب الغذائي للوسائط (عن طريق إضافة مكونات LB بحجم مماثل). لتجنب ذلك ، يتم إعادة تعليق البكتيريا بدلا من ذلك في محلول كلوريد الصوديوم لإزالة مكونات LB مع منع الإجهاد التناضحي على البكتيريا. يتم تقليل كلوريد الصوديوم المضاف إلى الوسائط وفقا لذلك لحساب الملح المضاف إلى البكتيريا.
  4. صب lmNGM في حوض ماصة دافئة.
  5. مع وجود الدرج الصغير على سطح الطاولة ، ماصة 20 ميكرولتر من lmNGM في كل صينية ميكروصينية. قم بتغطية الدرج الصغير عند إعادة ملء الماصة لتقليل التلوث.
    ملاحظة: هذه الخطوة أسهل مع ماصة التكرار الإلكترونية.

6. بذر الآبار الدقيقة بالأغذية البكتيرية

ملاحظة: 5 ميكرولتر من 10x من الطعام المركز من ثقافة ملقحة بين عشية وضحاها كافية لإطعام C. elegans واحدة طوال عمرها الافتراضي.

  1. نقل البكتيريا من ثقافة بين عشية وضحاها إلى قارورة مخروطية 50 مل.
  2. أجهزة الطرد المركزي في ~ 3500 × ز لمدة 20 دقيقة.
  3. إزالة الطاف. أعد تعليق مزرعة البكتيريا بتركيز 10x (حجم 1/10 من المستنبت الأصلي) بمحلول كلوريد الصوديوم 85 مللي مول.
  4. قبل إضافة البكتيريا إلى الآبار ، افحص الدرج الدقيق بصريا للتأكد من احتواء lmNGM الصلب بالكامل داخل كل بئر. إذا كان أي lmNGM معلقا على جانب البئر ، فقم بكشط lmNGM الزائد بطرف ماصة. يمكن أن تتسبب هذه الوسائط الزائدة في دخول الطعام إلى حمض النخيل إذا لم يتم تطهيره.
  5. ماصة بعناية 5 ميكرولتر من 10x ثقافة بكتيرية مركزة على سطح lmNGM في كل بئر. حاول تجنب السماح لثقافة البكتيريا بالمرور على جانب البئر وفي حمض النخيل ، لأن هذا سيجذب الديدان لمغادرة البئر.
  6. اترك الصواني الدقيقة تجف في صندوق تجفيف معقم أو غطاء تدفق رقائقي لمدة ~ 35 دقيقة. تحقق كل ~ 5 دقائق واحرص على عدم الإفراط في الجفاف. قم بإزالتها عندما تكون بعض الآبار رطبة قليلا بشكل واضح ، حيث ستجف الآبار أكثر أثناء إضافة الديدان الخيطية.

7. إحاطة كل درج دقيق داخل لوحة بئر واحدة

ملاحظة: في هذا القسم ، يتم تثبيت microtray داخل لوحة قياسية أحادية البئر باستخدام ملحق مخصص مطبوع 3D ومحاط ببلورات ممتصة للماء. ثم يتم إغلاق لوحة البئر الواحدة وإغلاقها باستخدام Parafilm. يسمح ذلك بتبادل الأكسجين مع منع التلوث والحفاظ على رطوبة كافية لمنع lmNGM من الجفاف على مدار تجارب متعددة الأسابيع (يمكن أن تستمر تجارب عمر الدودة من 6 إلى 8 أسابيع في حالة فحص الطفرات الممتدة للعمر أو الظروف البيئية). أثناء التحضير ، تأكد من تغطية اللوحة كلما لم تتم إضافة شيء نشط لتقليل التلوث البكتيري أو الفطري.

  1. تعقيم لوحة بئر واحدة ومحول 3D المطبوعة والغطاء عن طريق غمس كل في محلول التبييض 10٪. شطف جيدا بماء DI المعقم. جفف بالمسح باستخدام مسح المهام.
  2. رش لوحة البئر الواحدة والمحول المطبوع 3D والغطاء بمحلول إيثانول 70٪ أو أكثر وامسحه بمسح المهمة. دع أي إيثانول متبقي يجف في الهواء.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الأشعة فوق البنفسجية بعد التبييض والإيثانول بنفس المعلمات مثل microtray ، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 4.4.
  3. ضع الملحق المعقم المطبوع 3D في لوحة بئر واحدة معقمة.
  4. تعقيم الجزء الخارجي من microtray المعدة عن طريق رشها مع 70 ٪ من الإيثانول.
  5. ضع الدرج الصغير في المحول المطبوع 3D في لوحة البئر الواحدة.
  6. تخلص من غطاء الدرج الصغير.
  7. قم بتوزيع بلورات الماء بحرية أعلى الملحق المطبوع 3D بين الجدار الخارجي للدرج الصغير والجدار الداخلي للوحة البئر الواحدة.
  8. أضف الديدان على الفور (القسم 8) أو أغلق الدرج الصغير لاستخدامه في اليوم التالي. أغلق غطاء الدرج واستخدم قطعة واحدة من Parafilm للف الجوانب الأربعة لإغلاق الدرج الصغير. كرر خطوة الختم مع Parafilm مرتين أخريين لما مجموعه ثلاث طبقات.
  9. بعد إغلاق الدرج الصغير ، اتركه على المقعد في RT لمدة تصل إلى 4 أيام قبل إضافة الديدان (القسم 8).

8. إضافة الديدان إلى microtray

ملاحظة: يمكن إضافة دودة واحدة يدويا إلى كل بئر عن طريق نقل الحيوانات من مجموعات الديدان المتزامنة مع العمر (القسم 2) باستخدام معول البلاتين. نقل الحيوانات فقط في مرحلة الحياة المطلوبة. إذا استغرقت عملية النقل أكثر من 1 ساعة ، يمكن أن يجف lmNGM في آبار microtray. يمكن أن يؤدي نقل مجموعات من 10 إلى 20 دودة في وقت واحد إلى تسريع هذه الخطوة ، ولكن الأمر يتطلب بعض الممارسة لإطلاق واحد فقط لكل بئر باستمرار.

  1. أضف نيماتودا واحدة لكل بئر بمجرد وصولها إلى مرحلة الحياة المطلوبة.
  2. ضع الغطاء مرة أخرى فوق الدرج الصغير عند التقاط الديدان من لوحة المصدر لتقليل التلوث.

9. الانتهاء من إعداد بيئة الثقافة للاستخدام على المدى الطويل

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات أدناه لضمان بقاء الوسائط والديدان الموجودة في الدرج الدقيق رطبة طوال مدة التجربة.

  1. أضف ~ 40 ميكرولتر من محلول المنظف إلى غطاء لوحة بئر واحدة واستخدم مسح المهام لتغطية الغطاء بالتساوي. سيمنع هذا الطلاء التكثيف بمرور الوقت بمجرد إغلاق اللوحة. استخدم مناديل مهام إضافية لنشر محلول المنظف حتى لا يتم تشويه الرؤية من خلال الغطاء (يستغرق هذا عادة حوالي منديلتين للمهمة).
  2. افحص بلورات الماء للتأكد من أنها مستوية مع الحافة العلوية للصينية الدقيقة ولا تفيض. إذا لزم الأمر ، أضف أو أزل بلورات الماء إلى اللوحة.
  3. باستخدام الطريقة التالية ، لف الدرج ب Parafilm (ثلاث قطع في المجموع) للتأكد من أن ختم Parafilm سيستمر على المدى الطويل.
    1. قم بتمديد القطعة الأولى من Parafilm قليلا لتغطية جانبي الدرج.
    2. قم بتمديد القطعة الثانية من Parafilm قليلا وقم بتغطية الجوانب المتبقية من الدرج.
    3. قم بتمديد القطعة الأخيرة من Parafilm ولف الجوانب الأربعة للدرج بالكامل ، مع تغطية القطعتين الأولى والثانية من Parafilm. يمكن أن تظل الدرج الدقيق المختوم بشكل صحيح رطبا لمدة ~ 2 أشهر.
      ملاحظة: راقب سلامة Parafilm كل 1-2 أسابيع طوال التجربة ، واستبدلها حسب الحاجة.
    4. امسح الجزء العلوي من الدرج بمسح المهام ، رطبا بنسبة 70٪ من الإيثانول ، لإزالة أي بصمات أصابع.
  4. قم بتسمية لوحة البئر الواحدة باستخدام الشريط. الدرج الصغير جاهز الآن للتصوير والتخزين طويل الأجل لمراقبة الديدان بمرور الوقت. بين جلسات التصوير ، احتفظ بالدرج عند 20 درجة مئوية. يمكن فتح الدرج الدقيق وإعادة إغلاقه عدة مرات لجرعات الدواء أو الإجراءات الأخرى ، ولكن يجب تقليله لمنع التلوث وفقدان الرطوبة.

10. تصوير الديدان الفردية في آبار microtray

ملاحظة: الغرض من هذا البروتوكول هو تقديم وصف تفصيلي لكيفية تحضير بيئة زراعة الدرج الدقيق. بمجرد تحضيرها وتعبئتها بالديدان ، يمكن استخدام بيئات استزراع الدودة المفردة الدقيقة لمراقبة العديد من الأنماط الظاهرية طوليا باستخدام التقنيات الموضوعة للاستزراع القياسي على ألواح بتري. يوفر القسم التالي إرشادات أساسية لقياس بعض الأنماط الظاهرية الشائعة. يجب إجراء التصوير الفلوري في مجهر مستقيم. يتم تقليل انكسار الضوء من خلال صينية Terasaki في غرفة مظلمة.

  1. فترة الحياة: قم بقياس العمر الافتراضي عن طريق النقر برفق على جانب أو أعلى اللوحة أو تسليط ضوء أزرق ساطع على اللوحة ومراقبة كل. سجل حيوانا "ميتا" إذا لم يتحرك في غضون ثوان قليلة. كرر هذه المهمة كل 1-3 أيام حتى تموت جميع الديدان.
    ملاحظة: تتوافق بيئة زراعة microtray مع الأنظمة التي تعمل على أتمتة جمع الصور وتحليلها لتقدير العمرالافتراضي 14,19.
  2. الفحص المجهري القياسي: قم بإجراء تصوير برايت فيلد (أو الحقل المظلم) على الآبار الفردية أو على الدرج بأكمله باستخدام كاميرا أو ماسح ضوئي عالي الدقة. يمكن استخدام بيانات التصوير هذه لمجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية ، بما في ذلك حجم الحيوان22،23،24 ، والتطور 25 ، والنشاط 14،19 ، والعمر.
  3. الفحص المجهري الفلوري: قم بإجراء التصوير الفلوري على الآبار الفردية إما يدويا أو باستخدام نظام منصة آلية. تتوافق الأدراج أحادية البئر مع محولات الألواح القياسية متعددة الآبار. يتم تقليل الإشارة إلى الضوضاء إذا تم وضع الجهاز في صندوق أسود الجدران.
    ملاحظة: نظرا لأن الديدان يتم تصويرها بينما تظل حرة في الزحف ، فإن نظام الاستزراع هذا مناسب تماما للتصوير منخفض الدقة لالتقاط مضان الجسم بالكامل وتوطين الأنسجة الخشنة للفلوروفور. يتطلب التصوير عالي الدقة والتكبير عادة تجميد الحيوانات لمنع الحركة. في حين أنه يجب أن يكون من الممكن تطبيق عامل شلل موضعيا (على سبيل المثال ، أزيد الصوديوم أو ليفاميزول) على كل بئر والمضي قدما في التصوير عالي الدقة ، فإن هذا من شأنه أن يحول دون القياسات المتكررة لنفس الدودة في نقاط زمنية لاحقة. كما أن نظام الثقافة ، كما هو موضح ، لا يقصد به أن يكون مقلوبا ، مما يمنع استخدام أنظمة المجهر المقلوبة.
    1. إذا لم يتم استخدام برايتفيلد لقياس العمر الافتراضي وتم التقاط التألق فقط ، فقم بقياس العمر يدويا. ترك الضوء الأزرق (المستخدم لإثارة GFP) على الدودة لمدة 5 ثوان سيدفع الحيوان إلى التحرك. إذا لم يتحرك الحيوان في غضون 5 ثوان ، فاعتبر الحيوان ميتا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن استخدام بيئة استزراع الدودة المفردة القائمة على microtray الموصوفة هنا لمراقبة مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية ، بما في ذلك العمر الافتراضي والعمر الصحي والنشاط والحركة وشكل الجسم وهندسة الزحف والتعبير عن المؤشرات الحيوية الفلورية المعبر عنها وراثيا في الحيوانات الفردية بمرور الوقت. يتوافق نظام زراعة microtray مع تحليل العمر الافتراضي من خلال التسجيل اليدوي أو جمع الصور وتحليل التصوير النهائي. كما هو الحال مع الثقافة القياسية على لوحات بتري21 ، يمكن تسجيل الديدان يدويا على أنها ميتة أو حية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا ، نصف نظام ثقافة جديد يتكيف مع الصواني الدقيقة ، التي تم تطويرها في الأصل لمقايسات كتابة أنسجة مستضد كريات الدم البيضاء البشرية ، للسماح بعزل وتوصيف C. elegans المفردة بمرور الوقت في بيئة وسائط صلبة تشبه السياق NGM القائم على أجار وهو المعيار في أبحاث C. elegans. هذا النظام متوافق مع مجموعة متنوعة من التدخلات ، بما في ذلك تقييد النظام الغذائي ، والعلاج الدوائي الخارجي ، والتحدي مع الضغوطات الكيميائية أو البيئية ، و RNAi. كما يسمح بالمراقبة الطولية للمؤشرات الحيوية الفلورية في الجسم الحي في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يذكر المؤلفون أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل NIH R35GM133588 إلى G.L.S. ، ومنحة تدريب NIHT32GM008659 إلى L.E. ، وجائزة محفز الأكاديمية الوطنية الأمريكية للطب إلى G.L.S. ، وصندوق مبادرة التكنولوجيا والبحوث في ولاية أريزونا الذي يديره مجلس حكام أريزونا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إدراج تيراساكي المطبوعة ثلاثية الأبعاد شركةطباعة مخصصةRobot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		FDM الطباعة ، حجم الفوهة 0.6 مم باستخدام أنظمة AirClean القياسية PLA بالإضافة إلى خيوط
AirClean AC624LF غطاء دخان التدفق الصفحي العموديفيشر ساينتفيك36-100-4376
باكتو الببتونالحراريالعلمي 211677
CaCl2< / sub> Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans< / em> N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2سلالة Wildtype
CarbenicillinGoldbioC-103-25
CholesterolICN Biomedicals Inc101380<
em>Escherichia coli< / em> OP50 مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50الغذاء المختبري القياسي ل C. elegans< / em>
EthanolMilliporeex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR  Research Products InternationalF10705-1.0
بلورات المياه المرطبة تقنيات البوليمرM2 نوع Sنوع S بوليمر فائق الامتصاص
الأيزوبروبيل ß ؛ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBioI2481C100
K2< / sub>HPO4< / sub>Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155مناديل مهمة
مرق LB ، LennoxBD Difco240230
كاميرا Leica K5 sCMOS أحادية اللونLeica Microsystems11547112
Leica M205 FCA مجهر ستيريو الفلورسنتLeica Microsystems10450826
منتجات أبحاث الاغاروز منخفضة الذوبانالدوليةA20070-250.0
MgSO4 فيشر كيميكالM-8900
كلوريد الصوديومفيشر الكواشف الحيويةBP358-1
Nunc OmniTray لوحة أحادية البئر264728علمية حرارية
نيستاتينسيجماN1538
حمض البالمتيكأكروس العضوية129700010
المناشف الورقية365374
Parafilm MParafilm16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075الأشعة فوق البنفسجية
صواني تيراساكي (لامدا)One Lambda151431
Thermolyne Dri-bathThermolyneDB28125
Tween   ؛الحرارة العلميةJ20605-AP
المهنية على مستوى الساحل

المراجع

  1. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
  2. Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
  3. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
  4. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  5. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  6. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  7. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
  8. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  9. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340(2019).
  10. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496(2011).
  11. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745(2011).
  12. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30(2017).
  13. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).
  14. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  15. Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  16. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  17. Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
  18. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  19. Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  21. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  22. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142(2013).
  23. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).
  24. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437(2014).
  25. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
  26. Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570(2015).
  27. Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
  28. Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الثقافة طويلة الأجل لالتهاب Caenorhabditis elegans الفردي على الوسائط الصلبة لمراقبة التألق الطولي والتدخلات البعيدة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.