أحدثت تقنيات كريسبر-كاس ثورة في مجال تحرير الجينوم. ومع ذلك ، فإن العثور على تعديل الخط الجرثومي المطلوب وعزله لا يزال يمثل عنق الزجاجة الرئيسي. لذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة قوية لفحص الحيوانات المنوية لأسماك الزرد المحقونة ب F0 CRISPR بسرعة لإجراء تعديلات على الخط الجرثومي باستخدام تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية وهضم التقييد والرحلان الكهربائي الهلامي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فحص الحيوانات المنوية للعزل السريع لتعديلات الخط الجرثومي في الزرد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أحدث ظهور تقنيات CRISPR-Cas nuclease المستهدفة ثورة في القدرة على إجراء تحرير دقيق للجينوم في كل من أنظمة النماذج الراسخة والناشئة. تستخدم أنظمة تحرير الجينوم CRISPR-Cas الحمض النووي الريبي الإرشادي الاصطناعي (sgRNA) لاستهداف نوكلياز داخلي مرتبط ب CRISPR (Cas) إلى مواقع الحمض النووي الجينومية المحددة ، حيث يولد Cas endonuclease كسرا مزدوجا. يؤدي إصلاح فواصل الخيوط المزدوجة بواسطة آليات معرضة للخطأ الجوهري إلى عمليات الإدراج و / أو الحذف ، مما يؤدي إلى تعطيل الموضع. بدلا من ذلك ، يمكن أن يؤدي إدراج متبرعين بالحمض النووي المزدوج أو قليل النيوكليوتيدات أحادية الشريط من الحمض النووي في هذه العملية إلى إدراج تعديلات دقيقة للجينوم تتراوح من تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة إلى العلامات المناعية الصغيرة أو حتى تركيبات البروتين الفلوري الكبيرة. ومع ذلك ، يمكن أن يكون عنق الزجاجة الرئيسي في هذا الإجراء هو العثور على التعديل المطلوب في الخط الجرثومي وعزله. يحدد هذا البروتوكول طريقة قوية لفحص وعزل طفرات الخط الجرثومي في مواقع محددة في Danio rerio (الزرد). ومع ذلك ، قد تكون هذه المبادئ قابلة للتكيف في أي نموذج حيث يمكن جمع الحيوانات المنوية في الجسم الحي .
المقدمة
يعد نظام CRISPR (التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام) / Cas أداة قوية لإجراء طفرات خاصة بالموقع وتحرير الجينوم الدقيق في نظام نموذج Danio rerio (الزرد)1،2،3،4. يتكون Cas-ribonucleoprotein (RNP) من مكونين رئيسيين: Cas endonuclease (عادة Cas9 أو Cas12a) و RNA دليل اصطناعي خاص بالموقع (sgRNA) 5. معا ، يولد Cas-RNP استراحة مزدوجة تقطعت بهم السبل (DSB) في الموضع المطلوب الذي يمكن إصلاحه بواسطة إحدى آليتي الإصلاح الجوهريتين. آلية إصلاح الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) عرضة للخطأ وغالبا ما تؤدي إلى مجم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت هذه الدراسة بما يتماشى مع المبادئ التوجيهية الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبر للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل جامعة تكساس في لجنة أوستن لرعاية واستخدام الحيوان (AUP-2021-00254).
1. تصميم sgRNA لطفرات كريسبر
- الحصول على تسلسل إكسون الذي يحتوي على المواقع المستهدفة.
- صمم دليلا اصطناعيا للحمض النووي الريبي (sgRNA) مع موقع شكل مجاور أولي (PAM) خاص ب Cas endonuclease.
- في حالة المشاركة في حقن بنية مانحة ، صمم sgRNA بحيث يكون موقع القطع المتوقع أقرب ما يمكن إلى التعديلات المطلوبة.
ملاحظة: APE هو برنامج مجاني مع أداة للعثور على مواقع Cas9 sgRNA11
- في حالة المشاركة في حقن بنية مانحة ، صمم sgRNA بحيث يكون موقع القطع المتوقع أقرب ما يمكن إلى التعديلات المطلوبة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تسمح الأساليب التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول بتحديد أسرع لتعديلات الجينوم أو الأليلات الضارة المفترضة من خلال التركيز على تحليل آلاف الجينومات المشتقة من مجموعة الحيوانات المنوية الذكرية المحقونة ب F0. يوضح الشكل 2 كيفية تفسير النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول.
لتوليد طفرات في موضع p2ry12 ، تم حقن أجنة الزرد ذات المرحلة الواحدة ب Cas9 endonuclease و sgRNA الخاص ب p2ry12 (الشكل 2B ، تمييز رمادي). <.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول طريقة للتوصيف السريع لتعديلات الجينوم المفترضة أو الطفرات المستهدفة باستخدام تقنية CRISPR-Cas من خلال التحليل المركز على جينومات الحيوانات المنوية الذكرية F0. يجب أن يكون هذا البروتوكول قابلا للنماذج الحيوانية الأخرى حيث تكون الحيوانات المنوية متاحة بسهولة لأخذ العينات دون القتل الرحيم. ستزيد هذه الطريقة من إنتاجية الفحص للتعديلات المرغوبة وهي مفيدة بشكل خاص لتحديد الأحداث النادرة بوساطة HDR. يعمل هذا النهج أيضا على تقليل عدد التجارب المستخدمة للعثور على تعديل مستقر للخط الجرثومي من خلال تسهيل الفحص ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
نود أن نشكر آنا هيندز في كلية الطب بجامعة واشنطن على جهودها الأولية في الحصول على الحمض النووي الجيني للحيوانات المنوية عالي الجودة باستخدام طريقة الطلقة الساخنة. تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب جائزة (R01AR072009 إلى R.S.G.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مسحوق الاغاروز | فيشر الكواشف الحيوية | BP1356-100 | |
| خزانات التربية | كارولينا بيولوجية ؛ | 161937 | |
| إنزيم تقييد BstNI | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | سلم | |
| ، 100 نقطة أساس & nbsp ؛ | ثرمو علمية | FERSM0241 | |
| dnah10 بناء مانح | Sigma-Aldrich | DNA Oligo في الأنبوب; 0.025 نانومتر, تنقية الملح القياسية, جاف. رابطة الفوسفوروثيوات على المتبرع في أول ثلاث روابط فوسفات على كل من 5' و 3' النهايات (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTCT GGACCGAGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') | |
| dnah10 التمهيدي الأمامي | Sigma-Aldrich | DNA Oligo في الأنبوب ؛ 0.025 نانومتر ، تنقية الملح القياسية ، جافة (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') dnah10 | |
| التمهيدي العكسي ؛ | Sigma-Aldrich | DNA Oligo في الأنبوب؛ 0.025 نانومتر، تنقية الملح القياسية، جاف ('5-AGTAGAGATCACACATCACACA ATACAGC-3') | |
| dnah10 sgRNA الاصطناعية | Synthego | sgRNA الاصطناعي ، التسلسل المستهدف: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Electrophoresis | |
| power | supply Thermo Scientific ؛ | 105ECA-115 | |
| ملقط مرشح | Millipore | XX6200006P | |
| الأسماك (النظام) المياه | عام | n / a | |
| نظام الرحلان الكهربائي للهلام (بما في ذلك إطار الصب والمشط وغرفة الرحلان الكهربائي) ؛ | ثرمو علمية | B2 | |
| هلام ضوء الصور | صبغة جل Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| , 10000X | وعاء زجاجي Invitrogen | S33102 | |
| ، 250 مل & nbsp ؛ | العامة غير | ||
| ، 0.8 لتر & nbsp ؛ | Aquaneering | ZT080 | |
| أنبوب شعري Microcap مع لمبة ، 20 & L | Drummond | 1-000-0020 / CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes ، متنوعة مع نصائح مناسبة | عامة & nbsp ؛ | غير متوفر | |
| ميكروويف | عام | N / A | |
| مياه خالية من Nuclease | Promega | P119-C | |
| مناشف ورقية | Generic | n / A | |
| أنابيب PCR ، 0.2 مل | Bioexpress | T-3196-1 | |
| ملعقة بلاستيكية ، مع ثقوب / فتحات محفورة ؛ | |||
| 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 التمهيدي الأمامي ؛ | Sigma-Aldrich | DNA Oligo في الأنبوب ؛ 0.025 نانومتر ، تنقية الملح القياسية ، جافة (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') | |
| p2ry12 التمهيدي العكسي | Sigma-Aldrich | DNA Oligo في الأنبوب ؛ 0.025 نانومتر ، تنقية الملح القياسية ، جافة (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') ؛ | |
| p2ry12 الاصطناعية sgRNA | Synthego | sgRNA الاصطناعي ، التسلسل المستهدف: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCGG-3'إنزيم | |
| التقييد 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| محلول هيدروكسيد الصوديوم ، 50 ملم & nbsp ؛ | ثرمو علمية | S318; إسفنجة 424330010 | |
| , قطع 1 بوصة × 1 بوصة مع تقسيم بيضاوي صغير | عام | غير | |
| مجهر مجهر | زيس | ستيمي 508 | |
| تاك بوليميراز ماستر ميكس ، 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate ، 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| مناديل ورقية | فيشر Scientific | 06-666 | |
| محلول تريكايين ميثان سولفونات (سينكاين ، MS-222) ، 0.016٪ في مياه السمك (درجة الحموضة 7.0 & plusmn ؛ 0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base ، 1M (مخزن مؤقتا مع حمض الهيدروكلوريك إلى درجة الحموضة 8.0) ؛ | بروميجا | H5131 |
المراجع
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
