يصف البروتوكول الحالي الحقن داخل القناة للنواقل الفيروسية عبر الحلمة لتوصيل الجينات ذات الأهمية إلى الخلايا الظهارية الثديية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الجسم الحي توصيل الجينات إلى الخلايا الظهارية الثديية للفأر من خلال الحقن الثديي داخل القناة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتكون الغدد الثديية للفأر من أشجار الأقنية ، التي تصطف على جانبيها الخلايا الظهارية ولها فتحة واحدة عند طرف كل حلمة. تلعب الخلايا الظهارية دورا رئيسيا في وظيفة الغدة الثديية وهي أصل معظم أورام الثدي. يعد إدخال الجينات ذات الأهمية في الخلايا الظهارية الثديية للفأر خطوة حاسمة في تقييم وظيفة الجينات في الخلايا الظهارية وتوليد نماذج أورام الثدي الثديية للفئران. يمكن تحقيق هذا الهدف من خلال الحقن داخل القناة لناقل فيروسي يحمل الجينات ذات الأهمية إلى شجرة الأقنية الثديية للفأر. يصيب الفيروس المحقون لاحقا الخلايا الظهارية الثديية ، مما يجلب الجينات ذات الأهمية. يمكن أن يكون الناقل الفيروسي فيروسيا عدسيا أو قهقريا أو غديا أو مرتبطا بالفيروس الغدي (AAV). توضح هذه الدراسة كيف يتم تسليم الجين محل الاهتمام إلى الخلايا الظهارية الثديية من خلال الحقن داخل القناة الثديية للفأر لناقل فيروسي. يستخدم الفيروس العدسي الذي يحمل GFP لإظهار التعبير المستقر عن الجين الذي تم تسليمه ، ويستخدم الفيروس القهقري الذي يحمل Erbb2 (HER2 / Neu) لإظهار الآفات المفرطة التنسج اللانمطية التي يسببها الجين الورمي وأورام الثدي.
المقدمة
تلعب الخلايا الظهارية للغدد الثديية دورا رئيسيا في وظيفة هذه الغدد وهي الخلية الرئيسية لسرطان الثدي. غالبا ما تحتاج دراسات بيولوجيا الغدة الثديية وتكوين الأورام إلى توصيل الجينات (الجينات) ذات الأهمية إلى هذه الخلايا. تتكون كل غدة ثديية فأر من شجرة قنوية مبطنة بخلايا ظهارية مع فتحة واحدة عند طرف الحلمة. هذا الهيكل يجعل الخلايا الظهارية الثديية سهلة الوصول إلى النواقل الفيروسية ، والتي يمكن توصيلها إلى تجويف شجرة الأقنية عن طريق الحقن داخل القناة1.
تم استخدام تقنية الحقن داخل القناة الثديية في الأصل للحيوانات الأكبر بكثير مثل الماعز والأرانب والجرذان1. بالنسبة لحيوان أصغر بكثير مثل الف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام الفئران وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية. بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام إناث الفئران FVB / N أو MMTV-tva البالغة من العمر 9-12 أسبوعا. تم الحصول على الفئران تجاريا أو عصاميا (انظر جدول المواد). تم استخدام فيروسات Lenti-EGFP (FUCGW) و RCAS-Erbb2 (Neu). تم إجراء تحضير الفيروس وتحديد العيار بعد التقارير المنشورة سابقا10,12.
1. إعداد حقنة
- قطع إبر المحور المعدني 33 G (انظر جدول المواد) إلى حوالي 1 سم في الطول. قم بتخزين ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم تقديم البيانات التمثيلية هنا لإثبات نجاح الحقن داخل القناة ، والعدوى الفيروسية الناجحة ، وتأثير الجينات التي تم تسليمها على تكوين أورام الثدي. يجب أن تكون كمية الفيروس المحقون مصممة خصيصا لغرض كل تجربة. لتوضيح مدى انتشار إصابة شجرة القناة الثديية ، يجب استخدام كمية كبيرة من الجينات الحاملة للفيروس التي يمكن تصويرها ، مثل GFP. من ناحية أخرى ، لتقليد تكوين الورم العفوي الطبيعي ، يجب استخدام كمية صغيرة من الفيروس الذي يحمل الجين الورمي بحيث يصاب عدد قليل فقط من الخلايا ويتطور إلى آفات سرطانية ، وفي النهاية سرطان غازي ، .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توضح هذه المقالة تقنية الحقن الفيروسي داخل القناة لإدخال الجينات في الخلايا الظهارية الثديية للفأر لنمذجة سرطان الثدي المتقطع. عادة ، يتم حقن الفئران التي لا تقل عن 5 أسابيع أو أكثر بحيث تبدأ عملية الأورام بعد تطور الغدة الثديية. إلى جانب ذلك ، غالبا ما تكون فتحة الحلمة للفئران التي يقل عمرها عن 5 أسابيع صغيرة جدا بحيث لا يمكن حقنها. من ناحية أخرى ، تتدهور حلمات الفئران المسنة جدا في بعض الأحيان ، وقد يفشل الاستئصال في الكشف عن فتحة الأقنية. من المهم أيضا ملاحظة أن حلمات بعض نماذج الورم المعدلة وراثيا أو بالضربة القاضية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن كلا المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور غاري شامنس على تعليقاته المفيدة على هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع (DOD) CDMRP BC191649 (YL) و BC191646 (YL) بالإضافة إلى المعاهد الوطنية للصحة (NIH) CA271498 (YL). يود المؤلفون أن يشكروا المرفق الأساسي لعلم أمراض الثدي المدعوم من SPORE P50CA186784 ، و Cytometry and Cell Sorting Core المدعوم من CPRIT-RP180672 و NIH CA125123 و RR024574 بمساعدة جويل إم سيديرستروم.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأجسام المضادة ل HA | Covance | MMS-101P | التخفيف: 1: 1000 |
| دموع اصطناعية | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| بروموفينول الأزرق | سيجما | B5525 | إشعاع الميكروويف لمدة 45 ثانية عند طاقة عالية 1250 واط فرن ميكروويف |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| المجهر المجسم الفلوري | لايكا | MZ16 FA | |
| FUCGW فيروس العدسات | عصامي | غير متوفر / أ | انظر المرجع # 12 |
| FVB / N | مختبر جاكسون | JAX: 001800 | |
| إبرة هاميلتون | هاميلتون | 91033 | معقمة |
| هاميلتون حقنة | هاميلتون | 201000 | |
| معقم LED مصباح مكبر | Intertek | 3165273 | |
| مقص زنبركي بالتشريح الدقيق | Roboz | RS-5621 | معقم |
| MMTV-tva | عصامي | انظر المرجع # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | عصامي | غير | انظر المرجع # 10 |
| للصيدلة البيطرية | للقوارض | 37.6 مجم / مل كيتامين ، 1.92 مجم / مل زيلازين ، و 0.38 مجم / مل أسيبرومازين |
المراجع
- Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mou....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
