نصف هنا طريقة محددة زمنيا للتعامل بفعالية مع المسارات التنموية الحرجة في مشيمة الفأر في الجسم الحي. يتم إجراء ذلك من خلال الحقن والتثقيب الكهربائي لبلازميدات كريسبر في مشيمة السدود الحامل في اليوم الجنيني 12.5.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الماوس في الجسم الحي المشيمة المستهدفة كريسبر التلاعب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المشيمة هي عضو أساسي ينظم ويحافظ على نمو الثدييات في الرحم. المشيمة مسؤولة عن نقل العناصر الغذائية والفضلات بين الأم والجنين وإنتاج وتوصيل عوامل النمو والهرمونات. تعد التلاعب الجيني المشيمي في الفئران أمرا بالغ الأهمية لفهم الدور المحدد للمشيمة في تطور ما قبل الولادة. الفئران المعدلة وراثيا المعبرة عن المشيمة لها فعالية متفاوتة ، ويمكن أن تكون الطرق الأخرى لمعالجة الجينات المشيمة بدائل مفيدة. تصف هذه الورقة تقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي مباشرة باستخدام معالجة الجينات كريسبر ، والتي يمكن استخدامها لتعديل التعبير عن الجينات المستهدفة. باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا ، تخضع السدود الحامل لبضع البطن في اليوم الجنيني 12.5 (E12.5) ، ويتم تسليم بلازميد كريسبر بواسطة ماصة زجاجية دقيقة إلى المشيمة الفردية. يتم إلكتروبيد البلازميد على الفور بعد كل حقنة. بعد تعافي السد، يمكن أن تستمر المشيمة والأجنة في النمو حتى التقييم في وقت لاحق. يمكن أن يحدد تقييم المشيمة والنسل بعد استخدام هذه التقنية دور وظيفة المشيمة المحددة زمنيا في التنمية. سيسمح هذا النوع من التلاعب بفهم أفضل لكيفية تأثير علم الوراثة المشيمة ووظيفتها على نمو الجنين وتطوره في سياقات مرضية متعددة.
المقدمة
المشيمة هي عضو أساسي يشارك في نمو الجنين. يتمثل الدور الرئيسي للمشيمة في توفير العوامل الأساسية وتنظيم نقل العناصر الغذائية والفضلات من وإلى الجنين. تتكون مشيمة الثدييات من أنسجة الجنين والأم ، والتي تشكل واجهة الجنين والأم ، وبالتالي ، فإن الوراثة لكل من الأم والجنين تؤثر على الوظيفة1. يمكن أن تؤدي التشوهات الوراثية أو ضعف وظيفة المشيمة إلى تغيير نمو الجنين بشكل كبير. أظهرت الأعمال السابقة أن علم الوراثة المشيمية وتطورها يرتبطان بالتطور المتغير لأنظمة أعضاء معينة في الجنين. على وجه الخصوص ، ترتبط التشوهات في المشيمة بالتغيرات في دماغ الجنين والقلب ونظام الأوعية الدموية2،3،4،5.
يلعب نقل الهرمونات وعوامل النمو والجزيئات الأخرى من المشيمة إلى الجنين دورا رئيسيا في نمو الجنين6. لقد ثبت أن تغيير إنتاج المشيمة لجزيئات معينة يمكن أن يغير النمو العصبي. يمكن أن يزيد التهاب الأم من إنتاج السيروتونين عن طريق تغيير التعبير الجيني الأيضي للتريبتوفان (TRP) في المشيمة ، مما يؤدي لاحقا إلى تراكم السيروتونين في دماغ الجنين7. وقد وجدت دراسات أخرى تشوهات المشيمة جنبا إلى جنب مع عيوب القلب. يعتقد أن التشوهات في المشيمة تساهم في عيوب القلب الخلقية ، وهو أكثر العيوب الخلقية شيوعا لدى البشر8. حددت دراسة حديثة العديد من الجينات التي لها مسارات خلوية مماثلة في كل من المشيمة والقلب. إذا تعطلت ، يمكن أن تسبب هذه المسارات عيوبا في كلا الجهازين9. قد تؤدي العيوب في المشيمة إلى تفاقم عيوب القلب الخلقية. يعد دور علم الوراثة المشيمة ووظيفتها في تطوير نظام أعضاء الجنين المحدد مجالا ناشئا للدراسة.
الفئران لديها المشيمة الدموية وغيرها من ميزات المشيمة البشرية ، مما يجعلها نماذج مفيدة للغاية لدراسة الأمراض البشرية1. على الرغم من أهمية المشيمة ، يوجد حاليا نقص في التلاعب الجيني المستهدف في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يوجد حاليا المزيد من الخيارات المتاحة للضربة القاضية أو الضربات القاضية أكثر من الإفراط في التعبير أو التلاعب باكتساب الوظيفة في المشيمة10. هناك العديد من خطوط التعبير عن الكري المعدلة وراثيا للتلاعب الخاص بالمشيمة ، كل منها في سلالات الأرومة الغاذية المختلفة في نقاط زمنية مختلفة. وتشمل هذه Cyp19-Cre و Ada / Tpbpa-Cre و PDGFRα-CreER و Gcm1-Cre 11،12،13،14. في حين أن جينات التحوير Cre هذه فعالة ، فقد لا تكون قادرة على التلاعب ببعض الجينات في نقاط زمنية محددة. هناك طريقة أخرى شائعة الاستخدام إما للتعبير الجيني عن الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير عن التعبير الوراثي المشيمي وهي إدخال ناقلات الفيروسات العدسية في مزرعة الكيسة الأريمية ، مما يؤدي إلى التلاعب الجيني الخاص بالأرومة الغاذية15,16. تسمح هذه التقنية بتغيير قوي في التعبير الجيني المشيمي في وقت مبكر من التطور. تم استخدام تداخل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي بشكل ضئيل في المشيمة. يمكن إجراء إدخال بلازميدات shRNA بشكل مشابه لتقنية CRIPSR الموضحة في هذه الورقة. وقد تم ذلك في E13.5 لتقليل تعبير PlGF بنجاح في المشيمة ، مع تأثيرات على الأوعية الدموية في الدماغالنسل 17.
بالإضافة إلى التقنيات التي تستخدم في المقام الأول للضربة القاضية أو الضربة القاضية ، يتم إجراء الإفراط في التعبير بشكل شائع مع الفيروسات الغدية أو إدخال بروتين خارجي. التقنيات المستخدمة للإفراط في التعبير لها معدلات نجاح متفاوتة وقد تم إجراؤها في الغالب في وقت لاحق من الحمل. للتحقيق في دور عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGF-1) في وظيفة المشيمة ، تم إجراء نقل جين المشيمة بوساطة غدية للحث على الإفراط في التعبير عن جين IGF-1 18,19. تم إجراء ذلك في وقت متأخر من حمل الفئران على E18.5 عن طريق حقن المشيمة المباشر. لتوفير خيارات إضافية والتحايل على الإخفاقات المحتملة للتلاعبات الجينية المشيمية الراسخة ، مثل فشل تركيبة Cre-Lox ، والسمية المحتملة للفيروسات الغدية ، والآثار غير المستهدفة ل shRNA ، يمكن استخدام معالجة CRISPR المباشرة للمشيمة في الجسم الحي 20،21،22. تم تطوير هذا النموذج لمعالجة عدم وجود نماذج الإفراط في التعبير ولإنشاء نموذج يتسم بالمرونة.
تعتمد هذه التقنية على عمل Lecuyer et al. ، حيث تم استهداف بلازميدات shRNA و CRISPR مباشرة في الجسم الحي إلى مشيمة الفئران لتغيير تعبير PlGF 17. يمكن استخدام هذه التقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي مباشرة باستخدام معالجة كريسبر في نقاط زمنية متعددة. لهذا العمل ، تم اختيار E12.5. نضجت المشيمة عند هذه النقطة وهي كبيرة بما يكفي للتلاعب بها ، مما يسمح بإدخال بلازميد كريسبر معين على E12.5 ، والذي يمكن أن يكون له تأثير كبير على نمو الجنين من منتصف إلى أواخر الحمل23,24. على عكس الأساليب المعدلة وراثيا ، ولكن على غرار التحريضات الفيروسية أو تداخل الحمض النووي الريبي ، تسمح هذه التقنية بالإفراط في التعبير أو الضربة القاضية في نقاط زمنية معينة باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا ، وبالتالي تجنب ضعف المشيمة المحتمل أو الفتك الجنيني من التغييرات السابقة. نظرا لأن عددا قليلا فقط من المشيمة يتلقى البلازميد التجريبي أو الرقابي داخل القمامة ، فإن النهج يسمح بنوعين من الضوابط الداخلية. هذه الضوابط هي تلك التي يتم حقنها وتزويدها بالكهرباء باستخدام بلازميد التحكم المناسب وتلك التي لا تتلقى أي معالجة مباشرة. تم تحسين هذه التقنية لإنشاء تعبير مفرط عن جين IGF-1 في مشيمة الفأر عبر وسيط التنشيط التآزري (SAM) CRISPR Plasmid. تم اختيار جين IGF-1 ، حيث أن IGF-1 هو هرمون نمو أساسي يتم تسليمه إلى الجنين ويتم إنتاجه بشكل أساسي في المشيمة قبل الولادة25,26. ستسمح تقنية كريسبر الجديدة التي تستهدف المشيمة بالتلاعب المباشر للمساعدة في تحديد العلاقة بين وظيفة المشيمة ونمو الجنين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا والامتثال للوائح الفيدرالية وسياسة جامعة أيوا وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية.
1. الحيوانات والتربية
- حافظ على الحيوانات في دورة ضوء النهار لمدة 12 ساعة مع الطعام والماء الإعلاني.
- استخدم إناث الفئران CD-1 الذين تتراوح أعمارهم بين 8-15 أسبوعا. استخدم وجود سدادة جماعية لتحديد E0.5.
- على E0.5 ، إيواء منفردة السدود الحامل.
2. معايرة الماصة الدقيقة
ملاحظة: يجب إجراء معايرة الماصة الدقيقة قبل الجراحة عندما يكون ذلك ممكنا.
- قبل صنع ومعايرة الماصة الدقيقة ، قم بتخفيف جميع البلازميدات إلى التركيز الموصى به (0.1 ميكروغرام / ميكرولتر) في الماء الخالي من DNase. امزج البلازميد مع صبغة Fast Green المخففة بشكل مناسب (1 ميكروغرام / ميكرولتر في PBS) (تركيز البلازميد النهائي: 0.06 ميكروغرام / ميكرولتر).
- اسحب الماصات الدقيقة باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية 10 سم بقطر خارجي 1.5 مم وقطر داخلي 0.86 مم مع مجتذب ماصة دقيقة.
- قطع بعناية طرف micropipette (2-3 مم) مع ملقط معقمة.
- قم بتحميل الماصة الدقيقة في طرف شعري دقيق متصل بحاقن دقيق. تأكد من توصيل الحاقن الدقيق بآلة الحقن المجهري وأن هناك مستويات كافية من النيتروجين لمعايرة الماصة الدقيقة.
- بمجرد توصيل الماصة الدقيقة بالحاقن الدقيق ، قم بتحميلها بمحلول صبغة Fast Green لإجراء المعايرة (1 ميكروغرام / ميكرولتر في PBS). قم بمعايرة الماصة الدقيقة لحقن حجم يبلغ حوالي 3.5 ميكرولتر. أفرغ ("امسح") الماصة الدقيقة استعدادا لتحميل محاليل البلازميد على النحو التالي.
ملاحظة: كل ماصة صغيرة ستكون مختلفة قليلا. لتجنب إتلاف المشيمة أثناء الحقن ، يجب ضبط وقت الحقن بين 0.5-1.5 ثانية. يجب ضبط الضغط بين 1-8.5 رطل / بوصة مربعة. معايرة كل ماصة صغيرة على حدة ؛ إذا تعذر معايرة الماصة الدقيقة ضمن هذه المعلمات ، فلا ينبغي استخدامها.
3. الجراحة (الشكل 1 أ)
ملاحظة: للتحضير ، قم بتنظيف أسطح كل من مناطق التحضير والجراحة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ضع وسادة سفلية ماصة في منطقة التحضير. في منطقة الجراحة ، ضع وسادة تدفئة لأسفل ، ثم ضع وسادة سفلية ماصة فوقها. تعقيم جميع الأدوات قبل الجراحة. يجب أن يكون الوقت الذي يكون فيه السد تحت التخدير أقل من 1 ساعة.
- التخدير
- تطبيق 5 ملغ/ كغ من مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية (ميلوكسيكام) أو مسكن آخر معتمد لدى السد الحامل قبل 30 دقيقة إلى 1 ساعة من الجراحة.
- ضع السد الحامل في غرفة تحريض متصلة بمبخر إيزوفلوران.
- اضبط المرذاذ على 4٪ إيزوفلوران و 3.5 لتر / دقيقة أكسجين.
- بمجرد تأكيد التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم وانخفاض معدل التنفس ، قم بإزالة السد من غرفة الحث إلى منطقة التحضير.
- التحضير للجراحة
- في منطقة التحضير ، ضع السد ضعيفا مع مخروط الأنف.
- قلل المرذاذ إلى 2٪ إيزوفلوران و 3.5 لتر / دقيقة أكسجين أثناء وجود السد في مخروط الأنف.
- حلق بطن السد جيدا وإزالة الفراء الزائد. قم بطلاء البطن المحلوق بمحلول البوفيدون و 70٪ من الإيثانول ثلاث مرات باستخدام أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية. تطبيق الطبقة النهائية من محلول البوفيدون. لمنع جفاف القرنية ، ضع الجل المسيل للدموع الاصطناعي على كلتا عيني السد (الشكل 2 أ ، ب).
- بعد التحضير ، انقل السد مع مخروط الأنف إلى منطقة الجراحة المخصصة.
- بضع البطن الرحمي
ملاحظة: استخدم قفازات معقمة طوال العملية الجراحية. قم بتغيير القفازات في حالة ملامسة أي سطح غير معقم.- في منطقة الجراحة ، ضع السد مستلقا ، وقم بتثبيت مخروط الأنف في مكانه بشريط. اضبط وسادة التدفئة أسفل وسادة الامتصاص على 45 درجة مئوية.
- باستخدام ملقط ومقص ، قم بعمل شق خط الوسط تقريبا 2 سم عبر الجلد. استخدم الملقط لخيمة الجلد ، وقم بعمل شق عمودي في الجلد. بعد ذلك ، قم بعمل شق آخر مماثل الحجم عبر الصفاق لفضح قرون الرحم. باستخدام الملقط ، خيمة الصفاق أثناء عمل شق عمودي (الشكل 2C ، D).
ملاحظة: قد يؤدي عدم وضع الخيمة بشكل صحيح أثناء شق الصفاق إلى شق قاتل في الأمعاء. - تدليك بلطف قرون الرحم من خلال شق عن طريق الضغط على جانبي البطن. افعل ذلك عن طريق توجيه الرحم بعناية بدون أدوات ، باستخدام الأصابع فقط لتجنب الإصابة العرضية. ضعي الرحم المكشوف فوق ستارة جراحية معقمة تغطي بطن السد وحافظي على رطوبته طوال الجراحة باستخدام قطرات من محلول ملحي معقم ، والذي يمكن تسخينه إلى 30 درجة مئوية قبل الاستخدام حسب الحاجة (الشكل 2E ، F).
ملاحظة: يمكن تحديد قرون الرحم كما هو موضح في Wang et al.27. - بمجرد تعرض الرحم ، حدد ثلاثة أزواج من المشيمة للتلاعب.
ملاحظة: يمكن تحديد المشيمة كما وصفها Elmore et al.24. لتحقيق أقصى قدر من بقاء الأجنة ، لا ينبغي علاج أكثر من 6 مشيمات. إذا كان هناك أقل من 12 جنينا ، فلا ينبغي حقن أكثر من 4 مشيمة. اختر مشيمتين متجاورتين بحيث يتلقى أحدهما حقنة تحكم والآخر يتلقى البلازميد التجريبي. يسمح استخدام مشيمتين متجاورتين بمقارنة أفضل للمشيمة في مواقع مماثلة في الرحم ويتيح أيضا زيادة معدل البقاء على قيد الحياة. يتم اختيار أزواج المشيمة المختارة عشوائيا ومتباعدة في جميع أنحاء قرني الرحم (الشكل 1B). - سجل موقع التلاعب بالمشيمة وتنظيم الأجنة داخل قرون الرحم بحيث يمكن التعرف على الأجنة والمشيمة أثناء الجمع ، حيث سيحمل سد واحد كلا من المشيمة / الأجنة المعالجة تجريبيا.
- حقن المشيمة والتثقيب الكهربائي لبلازميد التحكم
ملاحظة: للحفاظ على تقنية التعقيم ، قم بتعقيم المجاذيف الكهربائية والحاقن الدقيق بمعقم بارد قبل الاستخدام. قم بتغيير القفازات في حالة ملامسة أي سطح غير معقم.- باستخدام الماصة الدقيقة المعايرة ، قم بتحميل كمية كافية من بلازميد التحكم المناسب لثلاث حقن. قم بإجراء جميع الحقن على عمق ~ 0.5 مم أفقيا في المشيمة بين النفضية (البيضاء) ومنطقة الوصلات (الأحمر الداكن) (الشكل 3A-F).
- إجراء الحقن في المشيمة السيطرة الثلاثة.
ملاحظة: قم بإجراء جميع حقن البلازميد الضابطة قبل الحقن التجريبية لتجنب التلوث المتبادل للبلازميدات باستخدام الماصة الدقيقة. سيسمح ذلك باستخدام نفس الماصة الدقيقة ، حيث أن تغيير الماصات الدقيقة ووقت المعايرة يزيد بشكل كبير من وقت الجراحة ويقلل من بقاء السد. - إجراء التثقيب الكهربائي للمشيمة المحقونة بالبلازميد في غضون 2 دقيقة من الحقن.
- للتثقيب الكهربائي ، استخدم زوجا من المجاذيف مقاس 3 مم متصلة بآلة التثقيب الكهربائي. لضمان كفاءة دمج كريسبر وصلاحية الأجنة، استخدم إعدادات التثقيب الكهربائي التالية: 2 نبضة، 30 فولت، 30 مللي ثانية نبضة، 970 مللي ثانية نبضة، أحادية القطب.
- بعد الحقن ولكن قبل التثقيب الكهربائي مباشرة ، قم بتغطية أماكن التلامس بمحلول ملحي معقم ، مع تطبيق المحلول الملحي بدقة على المواقع الثلاثة على جدار الرحم والمجاديف بقطارة أو حقنة.
- اضغط برفق على مجاذيف التثقيب الكهربائي على الجوانب الجانبية للمشيمة. ضع مجداف الأنود فوق موقع الحقن والكاثود المقابل مباشرة (الشكل 4A-C).
- اضغط على النبض الموجود على آلة التثقيب الكهربائي ، وانتظر حتى تكتمل النبضتان قبل إزالة مجاذيف التثقيب الكهربائي.
ملاحظة: غالبا ما ترى كمية صغيرة من الرغوة البيضاء بين المجاذيف والمشيمة أثناء النبضات. إذا لم يحدث هذا ، تحقق من الجهد من المجاذيف باستخدام الفولتميتر قبل الاستخدام مرة أخرى. إذا كانت القراءة على الفولتميتر لا تتطابق مع إعداد جهد التثقيب الكهربائي ، فإن المجاذيف لا تعمل.
- حقن المشيمة والتثقيب الكهربائي للبلازميد التجريبي
- اتبع نفس الإرشادات الواردة في الخطوة 3.4.1. إلى الخطوة 3.4.2. باستخدام البلازميد التجريبي بدلا من بلازميد التحكم.
- إجراء التثقيب الكهربائي لجميع المشيمة التجريبية الثلاثة المحقونة في غضون 2 دقيقة من الحقن. يجب أن يتم ذلك بنفس الطريقة التي يتم بها حقن بلازميدات التحكم. اتبع الخطوة 3.4.4. إلى الخطوة 3.4.7.
- الانتهاء من الجراحة
- بمجرد اكتمال معالجة المشيمة ، قم بتدليك قرون الرحم برفق داخل تجويف البطن باستخدام الأصابع فقط (الشكل 5 أ).
- أولا ، قم بإجراء خيوط مفردة مزدوجة العقد على طبقة الصفاق باستخدام خيوط قابلة للذوبان مطلية ومضفرة بطول 45 سم مع سبيكة إبرة 13 مم 3/8c. باعد بين الغرز بمسافة 2-3 مم (الشكل 5 ب).
- بعد خياطة طبقة الصفاق ، قم بخياطة الجلد بخيوط قابلة للذوبان. عقدة ثلاثية الغرز المفردة بمسافة 2-3 مم لضمان عدم تمكن السد من التراجع عن الخياطة (الشكل 5C).
- بمجرد اكتمال الخياطة ، اضبط الأيزوفلوران على 1٪ والأكسجين على 3.5 لتر / دقيقة ، وقم بتطبيق لاصق الأنسجة على الغرز على الجلد (الشكل 5 د).
ملاحظة: لاصق الأنسجة اختياري ولكن يوصى به لمنع إعادة فتح الشق بسبب مضغ السد. - عندما يجف لاصق الأنسجة ، قم بإيقاف تشغيل المرذاذ وإزالة السد من منطقة الجراحة. ضع السد في قفص داعم على ظهره.
4. رعاية ومراقبة ما بعد الجراحة
- اسمح للسد الحامل بالتعافي في قفص نظيف تحت الإشراف لمدة لا تقل عن 30 دقيقة لضمان عدم حدوث مضاعفات فورية للجراحة. راقب حتى يصبح متنقلا بالكامل ويمكن أن ينقلب على قدميه دون مساعدة. منزل منفرد السد بعد الجراحة.
- اتبع الرعاية المؤسسية بعد الجراحة والمراقبة حتى جمع الأجنة. سجل وزن السد ، وراقب الغرز وموقع الشق يوميا.
5. E14.5 جمع المشيمة
- في E14.5 ، قم بتخدير السد بعمق باستخدام كوكتيل الكيتامين / الزيلازين (1 مجم / مل من الكيتامين و 0.1 مجم / مل زيلازين) ، ثم قم بخلع عنق الرحم للسد.
- قم بعمل شق على شكل حرف V في بطن السد بالمقص ، وأزل الرحم. ضعيها على الفور على طبق بتري 5 سم على الثلج. باستخدام ملقط ، قم بإزالة الجنين والمشيمة المقابلة بعناية من الرحم.
ملاحظة: احتفظ بسجل لموقع الجنين والمشيمة المقابلة في قرون الرحم لتحديد أي منها تلقى التلاعب المباشر أثناء الجراحة. - سجل أوزان المشيمة. باستخدام ملقط وشفرات حلاقة خالية من الحمض النووي الريبي ، اقطع المشيمة إلى نصفين أسفل خط الوسط. ضع نصفا في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية. اقطع النصف المتبقي إلى النصف مرة أخرى ، وقم بتخزين الربعين المتبقيين عند -80 درجة مئوية في أنبوبين ، أحدهما مزود بكاشف تخزين الحمض النووي الريبي.
ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة وأنسجة الأم الأخرى من المجموعة عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
6. تحليل التعبير الجيني المشيمي
- استخدم ربع المشيمة المخزنة عند -80 درجة مئوية في كاشف تخزين الحمض النووي الريبي.
- قم بمعالجة المشيمة ل qPCR كما هو موضح في Elser et al. باستخدام طريقة Trizol لعزل الحمض النووي الريبي ، ومقياس الطيف الضوئي لتركيز الحمض النووي الريبي ، ومجموعة تخليق cDNA ، و qPCR مع SYBR Green Master Mix28. بدلا من مجموعة Turbo DNAfree DNA المشار إليها في Elser et al. ، استخدم مجموعة RNAcleanup بعد عزل Trizol RNA للتأكد من أن العينات لا تحتوي على ملوثات28.
ملاحظة: اقرأ ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) ل Trizol ، واستخدمها في غطاء دخان كيميائي. - تقييم إدخال البلازميد لبلازميد التحكم باستخدام بادئات GFP والبلازميد التجريبي باستخدام بادئات BLAST (الاشعال المدرجة في الجدول التكميلي 1). استخدم قيمة التصوير المقطعي المحوسب لتحديد وجود البلازميد.
ملاحظة: قيم التصوير المقطعي المحوسب فوق 35 هي إيجابيات كاذبة ، ويجب اعتبار تلك التي تقل عن 35 فقط مؤشرا إيجابيا على إدخال البلازميد بنجاح. - تقييم تعبير المشيمة IGF-1 الطبيعي لجين التدبير المنزلي 18s (الاشعال المدرجة في الجدول التكميلي 1). استخدم طريقة ddCT لحساب تغير الطي ، ثم احسب تغيير الطي الطبيعي للعينات التجريبية إلى متوسط تغيير الطي لعينات التحكم.
7. تحليل مستوى البروتين المشيمي
- استخدم ربع المشيمة المخزنة عند -80 درجة مئوية. تجانس الأنسجة في محلول عازل مصنوع من 11.5 mM Tris HCl و 5 mM MgCl 2 ومثبط الأنزيم البروتيني 10 mM في diH2O مع درجة حموضة نهائية تبلغ 7.4. استخدم الخالط المحمول والمدقة لتفتيت الأنسجة.
ملاحظة: يجب ألا تتجاوز العينة 10٪ من حجم المخزن المؤقت. - قم بتخفيف العينات المتجانسة في المخزن المؤقت عند 1:12 ، بحيث تكون ضمن النطاق الذي يمكن اكتشافه لمجموعة مقايسة حمض البيسينتشونينيك (BCA). قم بإجراء مقايسة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وحدد البروتين الكلي باستخدام قارئ اللوحة.
- بعد إجراء مقايسة BCA ، قم بتطبيع جميع العينات إلى نفس تركيز البروتين الكلي البالغ 2 مجم / مل ل IGF-1 ELISA ، كما حدث في Gumusoglu et al.29.
- قم بإجراء IGF-1 ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وحدد مستويات بروتين IGF-1 باستخدام قارئ لوحة باستخدام منحنى تركيز قياسي.
8. التحقق المكاني من CRIPSR باستخدام وسم التهجين الفلوري في الموقع
- بعد تثبيت نصفي المشيمة بشكل مناسب في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 1-3 أيام ، انقلها إلى 20٪ سكروز عند 4 درجات مئوية قبل تجميدها في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
- تقسم المشيمة المدمجة في OCT إلى نصفين في كريوستات -20 درجة مئوية إلى أقسام 10 ميكرومتر ، وتضعها على شرائح ليتم تصنيفها. قسم المشيمة إلى نصفين بحيث تكون المناطق الفرعية الثلاث مرئية. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها للتهجين في الموقع .
- قم بإجراء وضع العلامات على التهجين الفلوري في الموقع (FISH) باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة. قم بتهجين شريحة واحدة باستخدام مسبار dCas9-3xNLS-VP64 وشريحة "شقيقة" ثانية من نفس المشيمة باستخدام مسبار Prl8a8.
ملاحظة: يكتشف مسبار dCas9-3xNLS-VP64 وجود بلازميد التعبير المفرط. يسلط مسبار Prl8a8 الضوء على الأرومات الإسفنجية في منطقة الوصلة ، مما يسمح بتحديد المناطق الفرعية للمشيمة. يتم تمييز هذين المجسين على شرائح "شقيقة" منفصلة لتجنب تداخل التألق متعدد القنوات مع التألق الذاتي الأخضر في المشيمة. - قم بتسمية كلا المجسين بصبغة الكشف (Opal 620). بعد الانتهاء من بروتوكول الشركة المصنعة ل FISH ، قم بتطبيق وسيط تركيب DAPI ، وضع غطاء على الشريحة. أغلق غطاء الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
- قم بتصوير الشرائح على مجهر مضان مركب قائم ، وقم بمعالجتها باستخدام برنامج مناسب لمعالجة الصور. هنا ، تم استخدام برنامج CellSens.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نتائج الإجراءات العامة (الشكل 6)
في الدراسة ، كانت هناك ثلاث مجموعات تم التلاعب بها. وشملت هذه المشيمة التي تم حقنها ببلازميد التحكم العام CRISPR Cas9 (Cas9 Control) ، أو بلازميد CRISPR للتحكم في التنشيط (التحكم في الفعل) ، أو بلازميد تنشيط IGF-1 SAM (Igf1-OE). يعتبر Cas9 Control أكثر ملاءمة للبلازميدات بالضربة القاضية ، والتحكم في التنشيط مناسب بشكل أفضل لبلازميدات التعبير الزائد / التنشيط. لتقييم التغيرات في الجدوى الناتجة عن التلاعب بالمشيمة <...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المشيمة هي المنظم الأساسي لنمو الجنين ، وكما لوحظ سابقا ، فإن التغيرات في التعبير الجيني للمشيمة أو وظيفتها قد تؤثر بشكل كبير على نمو الجنين6. يمكن استخدام البروتوكول الموضح هنا لإجراء معالجة مستهدفة في الجسم الحي بتقنية كريسبر لمشيمة الفأر باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا. تسمح هذه التقنية بإنتاجية كبيرة من الأجنة القابلة للحياة والمشيمة المقابلة لها والتي يمكن استخدامها لمزيد من الدراسة (الشكل 6 أ ، ب). سمحت لنا هذه التقنية بالإفراط في التعبي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يقر المؤلفون بمصادر التمويل التالية: R01 MH122435 و NIH T32GM008629 و NIH T32GM145441. يشكر المؤلفون مختبرات الدكتور فال شيفيلد والدكتور كالفن كارتر في جامعة أيوا على استخدام غرفة الجراحة والمعدات الخاصة بهم ، وكذلك الدكتور إريك فان أوترلو والدكتور نانداكومار نارايانان والدكتور ماثيو ويبر لمساعدتهم في الفحص المجهري. كما يشكر المؤلفون الدكتورة سارة ماورير ومايا إيفانز وسريليخا كوندو على مساعدتهم في العمليات الجراحية التجريبية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل أنابيب | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1615-5500 | |
| 4٪ بارافورميلدهايد (PFA) في PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899. AP | |
| 96 لوحة البئر | Cornings | 3598 | لمجموعة BCA |
| الوسادات السفلية الماصة | فيشر Scientific | 14-206-62 | |
| التحكم في التنشيط البلازميد | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-437275 | المياه الخالية من الدناس متوفرة للتخفيف |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | استخدام لتخدير تخليق (cDNA |
| مبخر الغاز | Vetamac | VAD-601TT | VAD المبخر المضغوط |
| جل المسيل للدموع | الاصطناعي Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| مجموعة فحص البروتين BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | القياس الكمي للبروتين |
| Biovortexer | Bellco Glass، Inc. | 198050000 | الخالط الأنسجة المحمول باليد |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | معالجة الصور لصور FISH. |
| جهاز طرد مركزي 5810 | Eppendorf | EP022628168 | لوحة الطرد المركزي |
| الكلوروفورم | الحرارية فيشر العلمي | J67241-AP | عزل الحمض النووي الريبي |
| القطن يميل قضيبات | ProAdvantage | 77100 | تعقيم قبل الاستخدام |
| CRISPR / Cas9 التحكم في البلازميد | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-418922 | المياه الخالية من الدنازيل متوفرة للتخفيف |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| مجهر تشريح | Leica | M125 C | يستخدم لتصوير ما بعد التنظير |
| خيوط قابلة للذوبان | Med Vet International | J385H | |
| الماء المقطر | جيبكو | 15230162 | |
| ملحي مخزن فوسفات Dulbecco (DPBS) | ثيرمو فيشر العلمي | 14190144 | (-) الكالسيوم. (-) المغنيسيوم |
| ECM 830 Electroporator (آلة التثقيب الكهربائي) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | مولد حلاقة كهربائية |
| فقط Wahl | CL9990 | Kent Scientific | |
| Electroporation المجاذيف / Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | مجاذيف قطرها 3 مم ؛ وشملت الأسلاك |
| كاسيت: 250 PK | Grainger | 21RK94 | كاسيت تضمين المشيمة |
| الإيثانول | الحراري فيشر العلمي | 268280010 | |
| علب F-Air | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 مرشح | الأيزوفلوران الزائد |
| صبغة خضراء سريعة FCF | Sigma | F7252-5G | تذوب إلى 1 & مو ؛ جم / مل وفلتر ؛ الحماية من الضوء |
| مقياس ضوئي دقيق قائم على المرشح (قارئ لوحة) | 14377576 | فيشر العلمي | في BCA و |
| ELISA Fallps | VWR | 82027-386 | أطراف دقيقة ، محلول فورمالين مستقيم ، مسنن |
| ، مخزن محايد ، 10٪ | زجاجية من Sigma Aldrich | HT501128 | |
| - زجاج البورسليكات (ماصة دقيقة) | Sutter | B150-86-10 | OD: 1.5 مم ، رقم الهوية: 0.86 مم ، طول 10 سم |
| كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفوتاز (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization |
| buffer وسادة تسخين | Thermotech | S766D | وسادة تسخين رقمية |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | فك مسطح بالكامل ؛ حمام |
| الماء الساخن | فيشر Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa | Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | المياه الخالية من Dnase المتوفرة للتخفيف |
| غرفة الحث | Vetamac | 941443 | لا يوجد حجم لتر محدد |
| مطلوب Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| الحمض | المتساوي / 2-Propoonal | Fisher Scientific | A451-4 |
| الكيتامين حمض الهيدروكلوريك 100 مجم / مل | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2 / كلوريد المغنيسوم | سيجما ألدريتش | 63069-100ML | 1M. عازلة تجانس البروتين |
| MicroAmp&trade ؛ لوحة تفاعل بصرية 384 بئر مع الباركود | فيشر Scientific | 4309849 | لوحات مشفرة غير مطلوبة |
| طرف الشعيرات الدموية | الدقيقة Eppendorf | 5196082001 | متصل ب BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | حامل ماصات من الفولاذ المقاوم للصدأ ، بطول 130 مم ، من 1 إلى 1.5 مم ماصات |
| Microject 1000A (آلة الحقن) | BTX Harvard Device | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming / Brown نوع مجتذب ماصة |
| دقيقة خلاط Microplate (شاكر اللوحة) | scilogex | 822000049999 | |
| الماوس / الفئران IGF-I / IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton و Dickson and Company | 305106 30 Gx 1/2 (0.3 مم × 13 مم) | |
| خزان النيتروجين | Linde | 7727-37-9 | أي غاز خامل |
| غير ستيرويدي مضاد للالتهابات (NSAID) | مختبرات نوربروك المحدودة | NDC 55529-040-10 | Analesgic مثل Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 مم |
| أوبال 620 صبغة الكشف | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | المستخدمة في |
| مركب درجة حرارة القطع المثلى للأسماك (O.C.T) مركب | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | بثورات الأكسجين الطبية |
| الأمريكية Scientific Inc | 14155390 | ||
| محلول Povidone-Iodine ، 5٪ | Avrio Health LP. | NDC 67618-155-16 | |
| الطاقة SYBR & التجارة ؛ استخدام Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | |
| hexamers العشوائية qPCR (الاشعال العشوائية) | استخدام New England Biolabs | S1330S | لتخليق (كدنا |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & المكثف | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | يحتوي على جميع الكواشف المطلوبة للتهجين الفلوري في الموقع. تباع المجسات بشكل منفصل. |
| RNAscope ™ مسبار- mm-prl8a8-C2 | الخلايا المتقدمة | 528641-C2 | |
| RNAscope ™ مسبار- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | الخلايا المتقدمة | 527421 | |
| Roto-Therm | Mini Benchmark | R2020 | فرن جاف لمقص التهجين في الموقع |
| VWR | 82027-578 | مقص تشريح ، طرف حاد ، 4 & sup1 ؛ /؟ | |
| كلوريد الصوديوم (محلول ملحي) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | معقم ، ؛ 0.9٪ |
| سترات الصوديوم ، ملح ثلاثي الصوديوم ، ثنائي هيدرات ، [حامض الستريك ، ثنائي هيدرات ثلاثي الصوديوم] | منتج بحثي دولي | 03-04-6132 | |
| مركز هيدروكسيد الصوديوم 1N ، فيشر كيماويكال | فيشر Scientific | SS277 | بخاري لتجانس البروتين |
| بيلا | B00DPX8UBA | ||
| الستارة الجراحية | المعقمة | Busse 696 | تعقيم قبل الاستخدام |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| غطاء الجراحي زجاج 24x60 | محاقن Leica | 3800160 | |
| BD - Becton و Dickson و Company | 309659 | BD Luer Slip Tip حقنة معقمة ، للاستخدام مرة واحدة ، 1 مل | |
| الحرارة العلمية والتجارة; Invitrogen & Trade ؛ Nanodrop & التجارة ؛ مقياس الطيف الضوئي واحد مع WiFi و Qubit & trade ؛ 4 مقياس الفلور | فيشر العلمي | 13-400-525 | يأتي هذا التكوين مع مقياس الفلور Qubit 4. القياس الكمي الكمومي غير مطلوب. |
| لاصق الأنسجة | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. عازلة تجانس البروتين |
| TRIzol & trade ؛ كاشف | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | عزل الحمض النووي الريبي |
| TSA حزمة العازلة | تشخيص الخلايا المتقدمة | 322810 | تستخدم لتخفيف صبغة الكشف عن Opal 620 |
| F-Circuit | Vetamac | 40200 | المرفقة بملحقات المرذاذ والمبخر |
| مجهر مضان مركب مستقيم | أوليمبوس | BX61VS | يستخدم لتصوير الأسماك |
| Vectorshield مع DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip تصاعد وسائل |
| الإعلام ViiA & trade 7 نظام PCR في الوقت الحقيقي مع 384 بئر | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | هذا للكشف عن كتلة SYBR 384-well. TaqMan و / أو كتل أصغر متوفرة |
| طلاء الأظافر الرطب والبري ، تألق بري ، واقي أظافر شفاف ، لون الأظافر | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg / ml | Anased | 343730_RX |
المراجع
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
- Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735(2018).
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230(2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570(2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756(2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236(2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652(2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44(2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632(2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653(2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909(2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202(2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118(2021).
- Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
