هنا ، نصف طريقة للكشف في الوقت الحقيقي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المرتدة (ROS) في أنسجة الأرز في الاستجابة المناعية المرتبطة بالنمط الجزيئي المرتبط بمسببات الأمراض. هذه الطريقة بسيطة وموحدة وتولد نتائج قابلة للتكرار بدرجة كبيرة في ظل ظروف خاضعة للرقابة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف في الوقت الحقيقي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الاستجابة المناعية في الأرز باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أدوارا حيوية في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك استشعار الضغوط اللاأحيائية والحيوية. عند الإصابة بمسببات الأمراض أو التحدي مع المواد الكيميائية المرتبطة بمسببات الأمراض (الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض [PAMPs]) ، يتم تحفيز مجموعة من الاستجابات المناعية ، بما في ذلك انفجار أنواع الأكسجين التفاعلية ، بسرعة في النباتات ، والتي تسمى المناعة التي يسببها PAMP (PTI). انفجار ROS هو استجابة PTI المميزة ، والتي يتم تحفيزها بواسطة مجموعة من أوكسيديز NADPH المترجمة بغشاء البلازما - بروتينات عائلة RBOH. تتكون الغالبية العظمى من أنواع الأكسجين التفاعلية من بيروكسيد الهيدروجين (H2 O2) ، والذي يمكن اكتشافه بسهولة وثبات بواسطة طريقة التلألؤ الكيميائي القائمة على اللومينول. التلألؤ الكيميائي هو تفاعل منتج للفوتون يخضع فيه اللومينول ، أو مشتقه (مثل L-012) ، لتفاعل الأكسدة والاختزال مع أنواع الأكسجين التفاعلية تحت تأثير محفز. تصف هذه الورقة طريقة التلألؤ الكيميائي المحسنة القائمة على L-012 للكشف عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية apoplast في الوقت الفعلي عند استنباط PAMP في أنسجة الأرز. الطريقة سهلة وثابتة وموحدة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة في ظل ظروف خاضعة لرقابة صارمة.
المقدمة
تتكون أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من سلسلة من مشتقات الأكسجين النشطة كيميائيا ، بما في ذلك جذور أنيون الأكسيد الفائق (O2-) ومشتقاته ، وجذور الهيدروكسيل (OH-) ، وبيروكسيد الهيدروجين ، ومنتجات تفاعلات الأكسجين المفردة أو تفاعلات تقليل الأكسدة ، والتي يتم إنتاجها باستمرار في البلاستيدات والبلاستيدات الخضراء ، والميتوكوندريا ، والبيروكسيسومات ، وغيرها من المواقع تحت الخلوية1 . تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية أدوارا مهمة في العديد من العمليات البيولوجية وهي ضرورية لجميع النباتات2،3،4. يختلف الطيف الواسع لوظائف ROS من تنظيم النمو والتنمية إلى إدراك الضغوط اللاأحيائيةوالحيوية 5،6،7،8.
في الجهاز المناعي للنبات ، تدرك المستقبلات الموضعية لغشاء بلازما الخلية النباتية - ما يسمى مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) - الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض الكيميائية المشتقة من مسببات الأمراض (PAMPs). يؤدي هذا التعرف إلى سلسلة من الاستجابات المناعية السريعة ، بما في ذلك تدفق الكالسيوم ، وانفجار ROS ، وشلال MAPK. وبالتالي ، فإن هذه الطبقة من المناعة تسمى المناعة التي يسببها PAMP (PTI). انفجار ROS هو استجابة PTI المميزة ، والتي يتم تطبيق تحديدها على نطاق واسع على الدراسات المتعلقة ب PTI 9,10. يعزى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الناجم عن PAMPs إلى أوكسيديز NADPH المقيم في غشاء البلازما ، أو بروتينات عائلة متجانسة أوكسيديز الانفجار التنفسي (RBOH) ، والتي تنقل الإلكترونات من NADPH الخلوي أو NADH إلى الأكسجين خارج الخلية لإنتاج أكسيد فائق (O 2-) يتم تحويله تلقائيا إلى بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) بواسطةديسموتاز فائقالأكسيد 8 . انفجار ROS الناجم عن PAMP سريع جدا ، ويظهر بعد دقائق قليلة فقط من علاج PAMP ويبلغ ذروته في ~ 10-12 دقيقة. تتكون الغالبية العظمى من جزيئات أنواع الأكسجين التفاعلية من بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O2) ، والذي يمكن اكتشافه بسهولة وثبات باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي.
في التلألؤ الكيميائي ، يتفاعل كاشف التلألؤ الكيميائي مع الأكسجين النشط ، تحت تأثير عامل حفاز ، لإنتاج وسيطة الحالة المثارة. بعد ذلك، تعود الإلكترونات الموجودة في الناتج إلى الحالة الأرضية من خلال الانتقال غير الإشعاعي، وتنبعث منها فوتونات. تشمل كواشف التلألؤ الكيميائي الشائعة اللومينول و L-012 ، مع سيطرة اللومينول على التطبيق11،12،13. ومع ذلك ، يختار المزيد من الباحثين L-012 للكشف عن إنتاج ROS ، نظرا لأن L-012 يتمتع بكفاءة انبعاث ضوء أعلى بكثير في ظل ظروف الأس الهيدروجيني المحايدة أو شبه المحايدة مقارنة باللومينول.
تصف هذه الورقة طريقة التلألؤ الكيميائي المحسنة ، استنادا إلى L-012 ، للكشف في الوقت الفعلي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بعد استنباط PAMPs في أقراص أوراق أنسجة الأرز (Oryza sativa) والغمد. الطريقة المقدمة هنا بسيطة ومستقرة وموحدة ، وقابلة للتكيف بدرجة كبيرة لتلبية الاحتياجات التجريبية المختلفة. البيانات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة قابلة للتكرار بشكل كبير في ظل ظروف خاضعة لرقابة صارمة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: ينطبق البروتوكول على الأنسجة النباتية المختلفة. تم استخدام غمد الأرز وأقراص الأوراق في هذا البروتوكول للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية عند استنباط PAMP. نظرا لأن الاختلافات تنشأ بشكل أساسي بسبب طريقة أخذ العينات ، يتم وصف الإجراءات الشائعة فقط أدناه ، مع ذكر خطوات محددة عند الضرورة.
1. زراعة النبات
- تعقيم بذور الأرز مقشر مع 70 ٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة ، ثم مع 40 ٪ هيبوكلوريت الصوديوم (NaClO) لمدة 1 ساعة. ثم اشطف البذور 5 مرات بالماء المعقم لإزالة الكلور المتبقي.
- طبق البذور بشكل معقم على 1/2 MS وسط (2.37 جم / لتر موراشيج و Skoog (MS) وسط ، 30 جم / لتر سكروز ، 2.1 جم / لتر فيتاجيل ، درجة حموضة 5.7 ، معقم).
- في طريقة غمد الأرز ، قم بطلاء البذور مباشرة في وعاء زجاجي معقم باستخدام وسيط MS.
- في طريقة قرص الأوراق ، قم بطلاء البذور على ألواح MS لمدة 5-7 أيام وزرعها في مصفوفة النمو أو التربة (الشكل 1 أ).
- قم بزراعة الشتلات في غرفة نمو ذات فترة ضوئية مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة.
2. إعداد الأنسجة والمعالجة المسبقة
- غمد الأرز
- قطع الغمد من شتلات الأرز البالغة من العمر 10 أيام إلى شرائح 3 مم بشفرة حلاقة حادة أو شفرة جراحية للمعالجة المسبقة قبل يوم واحد من فحص ROS (الشكل 1 ب).
- ضع خمسة أجزاء غمد في بئر فردي من صفيحة عيار 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من ddH 2 O لمدة 10-12 ساعة ، في الظلام عند 25 درجة مئوية ، مما يسمح بتسرب الأيونات المرتبط بإصابة الجرح وتخفيف الاستجابات الدفاعية (الشكل 2).
ملاحظة: يعد الحرص على إبقاء القطع عموديا لضمان تعرض مساحة سطح القطع المتسقة لمحلول الاستنباط خطوة مهمة للحصول على نتائج قابلة للتكرار بدرجة عالية. حرك المقاطع برفق. لا تقم بإجراء جروح أو جروح إضافية على الأجزاء ، والتي يمكن أن تكون مصدرا لاختلاف البيانات. كمبدأ ، يجب أن يحتوي كل اختبار على خمسة مكررات على الأقل لأن تباين قيمة ROS كبير. كلما زاد عدد النسخ المتماثلة ، زادت موثوقية البيانات.
- قرص الأوراق
- قطع أقراص الأوراق (قطرها 4 مم) من نباتات الأرز التي يبلغ عمرها 4-6 أسابيع باستخدام لكمة خزعة مع مكبس. قم دائما بقص أقراص الأوراق من الثلث الأوسط من الورقة الثانية (مرقمة من الأعلى) من الحارث الرئيسي لتقليل تباين البيانات (الشكل 1C).
- ضع قرص ورقة واحدة في بئر فردي من صفيحة عيار 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من ddH 2 O لمدة 10-12 ساعة للمعالجة المسبقة ، مما يسمح للاستجابات المتعلقة بالجرح بالتخفيف لأنها قد تتداخل مع تحريض أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة PAMPs (الشكل 2).
ملاحظة: قم بتشغيل أقراص الأوراق برفق. لا تقم بعمل جروح أو جروح إضافية على الأقراص في التجربة ، مما قد يؤدي إلى اختلاف البيانات. يحدث تحريض أنواع الأكسجين التفاعلية في الغالب من خلايا الحافة المقطوعة ، حيث أن أسطح أنسجة الأرز (الأوراق أو الأغماد) مغطاة بطبقات كارهة للماء. فقط خلايا الحواف المقطوعة على اتصال بمحلول الاستنباط (راجع قسم المناقشة). - حافظ على جميع أقراص الأوراق عائمة ، مع توجيه السطح المحوري لأعلى ، في آبار صفيحة العيار الدقيق للمعالجة المسبقة للمياه لتجنب الاختلاف المرتبط بجانب الورقة.
الشكل 1: حالة نمو ومراحل شتلات الأرز لأخذ عينات الغمد وأجزاء من غمد الأرز وأوراق الأرز المستخدمة في الفحص. (أ) يمكن أخذ عينات من شتلات الأرز المزروعة على وسط 1/2 MS تحت ظروف معقمة لمدة 10 أيام لفحص أنواع الأكسجين التفاعلية. تم استزراع بذور الأرز المعقمة على وسط 1/2 مللي ثانية ونمت في فترة ضوئية داكنة 12 ساعة / 12 ساعة في قارورة زجاجية شفافة وقطرها 8.5 سم وارتفاعها 15 سم. ب: رسم تخطيطي لأجزاء أخذ عينات من أغماد الأوراق. تم قطع أغماد الأوراق من شتلات الأرز البالغة من العمر 10 أيام. كانت مواضع أغماد الأوراق فوق الجذور وتحت الورقة الأولى. ج: رسم تخطيطي لموضع أخذ عينات من أقراص الأوراق. يمكن قطع أقراص الأوراق من الثلث الأوسط من الورقة الثانية (العد من الأعلى) من الحارث الرئيسي لنباتات الأرز الصحية في أي مرحلة من مراحل النمو. الاختصارات: ROS = أنواع الأكسجين التفاعلية. MS = موراشيج وسكوج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي لإعداد اللوحة لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بخطوط مختلفة من Oryza sativa. المعالجة المسبقة واختبار أنسجة الأرز باستخدام صفيحة 96 بئرا. يمكن أن يكون الخط 1 والخط 2 والخط 3 (حتى ثمانية أسطر على لوحة واحدة) أي مادة ذات أهمية أو أصناف مختلفة أو طفرات أو خطوط معدلة وراثيا. تم تحفيز الأنسجة بمحاليل استنباط مع PAMP (PAMP ، أبيض) أو بدون PAMP (ddH2O ، رمادي) لقياس استجابة ROS. وتجدر الإشارة إلى أنه كلما زاد عدد العينات المراد اختبارها ، زادت الفترة الزمنية بين القراءات. الاختصارات: ROS = أنواع الأكسجين التفاعلية. PAMP = النمط الجزيئي المرتبط بمسببات الأمراض ؛ ddH2O = ماء مقطر مزدوج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. تحضير محلول الاستنباط
- قم بإذابة مسحوق L-012 في محلول مائي 20 mM (6.23 mg / mL) باستخدام ddH2O لعمل محلول المخزون. بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول المخزون باستخدام مخزن مؤقت 50 mM Tris HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) لعمل محلول العمل بالتركيز النهائي 500 ميكرومتر L-012. حافظ على محلول المرق مجمدا وخفف إلى محلول العمل قبل الاستخدام.
- تحضير محلول الاستنباط الذي يحتوي على PAMP و L-012 وبيروكسيديز الفجل (HRP ؛ 10 مجم / مل في ddH2O). للحصول على محلول استنباط 10 مل ، امزج 9.4 مل من محلول 50 مللي مول Tris HCl (pH 7.5) ، و 400 ميكرولتر من محلول L-012 ، و 100 ميكرولتر من HRP ، و 100 ميكرولتر من flg22 (PAMP ؛ 10 mM في ddH2O). للتحكم السلبي ، أضف 100 ميكرولتر من ddH2O بدلا من PAMP.
ملاحظة: احتفظ بمحاليل الاستنباط المعدة في درجة حرارة الغرفة لتجنب الإجهاد البارد لأنسجة الأرز. يمكن أيضا استخدام PAMPs الأخرى للعلاج حسب الحاجة ، مثل الكيتين (20 نانوغرام / مل في التركيز النهائي). نظرا لأن L-012 حساس للضوء ، فقم بتغطية جميع الأنابيب التي تحتوي على محلول L-012 بورق الألمنيوم.
4. بدء تشغيل البرنامج وإعداد البروتوكول باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة المشار إليه (انظر جدول المواد)
ملاحظة: يستغرق إعداد معلمات برنامج قارئ الصفائح الدقيقة بعض الوقت. يوصى بتجهيز الجهاز والبروتوكول (نقرة واحدة للمتابعة) قبل إضافة محلول الاستنباط.
- ابدأ تشغيل البرنامج. انقر على زر التجارب لإنشاء بروتوكول جديد أو استخدام بروتوكول موجود.
- انقر فوق الإجراء في النافذة المنبثقة لإعداد اللوحة. حدد الآبار من اللوحة المراد مراقبتها.
- انقر فوق بدء الحركية لإعداد إجمالي وقت التشغيل والفاصل الزمني للقراءة. اضبط وقت التشغيل على 35 دقيقة أو أكثر، وفقا للمتطلبات التجريبية. للحصول على قراءات بشكل متكرر قدر الإمكان، حدد الحد الأدنى للفاصل الزمني. لوقت التكامل ، اختر 1 ثانية أو أكثر ، اعتمادا على شدة الإشارة.
ملاحظة: يعتمد الفاصل الزمني للقراءة على عدد العينات ومدة تكامل الإشارة. - انقر على التحقق من الصحة | موافق لتأكيد الإعدادات.
- انقر فوق اكتشاف اللوحة الجديدة في النافذة المنبثقة وانتظر حتى يطالب البرنامج بمربع حوار لوحة التحميل. ضع اللوحة المراد اختبارها على الناقل.
- توقف هنا لانتظار إنشاء نظام الاستنباط (في القسم التالي). بمجرد أن يصبح نظام الاستنباط جاهزا ، انقر فوق تشغيل لبدء القراءة.
5. إنشاء نظام الاستنباط وقياس إنتاج ROS في الوقت الفعلي
- قم بإزالة ddH2O بعناية من الآبار التي تحتوي على الأنسجة المعالجة مسبقا ، وتجنب أي تلف أو جفاف للأنسجة.
- استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 200 ميكرولتر من محلول الاستنباط إلى الآبار التي تحتوي على الأنسجة.
- رج العبوة برفق حتى تختلط. انقر فوق تشغيل لبدء الكشف.
ملاحظة: مع علاج PAMP ، تستجيب الأنسجة النباتية وتنتج أنواع الأكسجين التفاعلية بسرعة كبيرة. لذلك ، يقترح معالجة السيطرة السلبية بدون PAMP أولا لتقليل وقت العملية ، عندما تكون هناك علاجات متعددة. تعمل في أسرع وقت ممكن لتقليل تأخير الاستنباط بين العلاجات. كلما كان الوقت أقصر بين إضافة محلول الاستنباط وبدء الكشف ، كان التقاط البيانات التجريبية المهمة أفضل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، نأخذ مادة الأرز كمثال لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية المنتجة بمعالجة flg22. توليد ROS بعد الاستنباط عابر. في الأرز ، تم اكتشاف الزيادة في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية لأول مرة في 1-2 دقيقة ، وبلغت ذروتها في 10-12 دقيقة ، وعادت إلى خط الأساس في ~ 30-35 دقيقة (الشكل 3). مقارنة باختبار التحكم ، حيث كان PAMP غائبا في محلول الاستنباط مما أدى إلى عدم وجود تحريض ROS واضح ، تم إحداث انفجار ROS محدد فقط عندما يحتوي محلول الاستنباط على flg22 ، أو PAMP آخر ، مثل الكيتين. وفي الوقت نفسه ، يمكن ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كان الغرض من هذه الدراسة هو إنشاء طريقة عالية الكفاءة لتحديد إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المبكر استجابة ل PAMP في أنسجة الأرز. توفر هذه الطريقة إجراء موحدا لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية في الوقت الفعلي الناتجة عن أنسجة الأرز المعالجة. هذه الطريقة بسيطة في التشغيل ، منخفضة التكلفة ، واضحة في التكوين ، ومستقلة عن المجموعات التجارية. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحثين دراسة الإنتاج في الوقت الفعلي ل apoplast ROS عندما تتعرض النباتات لضغوط حيوية أو غير أحيائية.
في هذا البروتوكول ، تم اختيار...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة شنغهاي للعلوم الطبيعية (رقم المنحة: 21ZR1429300 / BS1500016) ، جامعة شنغهاي جياو تونغ (برنامج Agri-X ، رقم المنحة: AF1500088/002) ، مركز شنغهاي للابتكار التعاوني للبذور الزراعية (رقم المنحة: ZXWH2150201/001) إلى Jiangbo Fan ، ومن خلال مشروع التعاون الطبي الهندسي لجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم المنحة: 21X010301734) إلى Can Li.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 96 بئر لوحة ميكروتيتر | WHB | WHB-96-01 | |
| الإيثانول المطلق | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2،3-dihydropyrido [3،4-d] pyridazine-1،4-dione، CAS #: 143556-24-5 |
| قارئ Microplate | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | علاء الدين | S101636 | |
| بيروكسيداز من الفجل الحار (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex ؛ | 15110-40 | |
| السكروز | سانجون للتكنولوجيا الحيوية | A502792 | |
| تريس | سانغون A610195 التكنولوجيا الحيوية |
المراجع
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648(2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
