يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إكس فيفو التوسع والتلاعب الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران في الثقافات القائمة على كحول البولي فينيل

4.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64791

⸱

فبراير 10, 2023

 ,  , 
1MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يظهر هنا بروتوكول لبدء وصيانة وتحليل مزارع الخلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران باستخدام التوسع القائم على كحول البولي فينيل خارج الجسم الحي ، بالإضافة إلى طرق معالجتها وراثيا عن طريق نقل الفيروسات العدسية والتثقيب الكهربائي.

الملخص

تعد الخلايا الجذعية المكونة للدم متعددة القدرات ذاتية التجديد (HSCs) نوعا مهما من الخلايا نظرا لقدراتها على دعم تكون الدم طوال الحياة وإعادة تكوين نظام الدم بأكمله بعد الزرع. تستخدم HSCs سريريا في علاجات زرع الخلايا الجذعية ، والتي تمثل علاجا شافيا لمجموعة من أمراض الدم. هناك اهتمام كبير بكل من فهم الآليات التي تنظم نشاط HSC وتكون الدم ، وتطوير علاجات جديدة قائمة على HSC. ومع ذلك ، فإن الثقافة المستقرة والتوسع في HSCs خارج الجسم الحي كان عائقا رئيسيا في دراسة هذه الخلايا الجذعية في نظام خارج الجسم الحي القابل للتتبع. لقد طورنا مؤخرا نظام استزراع قائم على كحول البولي فينيل يمكنه دعم التوسع طويل الأجل وواسع النطاق في HSCs للفأر القابلة للزرع وطرق تحريرها وراثيا. يصف هذا البروتوكول طرق زراعة ومعالجة HSCs للفأر وراثيا عن طريق التثقيب الكهربائي ونقل الفيروسات العدسية. من المتوقع أن يكون هذا البروتوكول مفيدا لمجموعة واسعة من أخصائيي أمراض الدم التجريبية المهتمين ببيولوجيا HSC وتكون الدم.

المقدمة

يدعم نظام المكونة للدم مجموعة من العمليات الأساسية في الثدييات ، من إمدادات الأكسجين إلى مكافحة مسببات الأمراض ، من خلال أنواع الدم والخلايا المناعية المتخصصة. يلزم إنتاج الدم المستمر (تكون الدم) لدعم توازن نظام الدم ، والذي تدعمه الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs)1. الخلية المكونة للدم الأكثر بدائية هي الخلية الجذعية المكونة للدم (HSC) ، والتي تتمتع بقدرات فريدة على التجديد الذاتي والتمايز متعدد السلالات 2,3. هذه مجموعة خلايا نادرة ، توجد بشكل رئيسي في نخاع العظمالبالغ 4 ، حيث تحدث بتردد واحد فقط لكل 30000 خلية. يعتقد أن HSCs تدعم تكون الدم مدى الحياة وتساعد على إعادة تكوين الدم بعد الإجهاد الدموي. تسمح هذه القدرات أيضا ل HSCs بإعادة تكوين نظام المكونة للدم بالكامل بثبات بعد الزرع في متلقي مشع5. يمثل هذا التعريف الوظيفي ل HSC ويشكل أيضا الأساس العلمي لعلاج زرع HSC ، وهو علاج علاجي لمجموعة من أمراض الدم والمناعة6. لهذه الأسباب ، HSCs هي محور رئيسي لأمراض الدم التجريبية.

على الرغم من التركيز الكبير للبحث ، فقد ظل من الصعب توسيع HSCs خارج الجسمالحي 7 بثبات. لقد طورنا مؤخرا أول نظام استزراع توسع خارج الجسم الحي طويل الأجل للفأر HSCs8. يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى توسيع HSCs القابلة للزرع بمقدار 234-899 ضعفا على مدار 4 أسابيع. بالمقارنة مع النهج البديلة ، كان التغيير الرئيسي في البروتوكول هو إزالة ألبومين المصل واستبداله ببوليمر صناعي. تم تحديد كحول البولي فينيل (PVA) كبوليمر مثالي لمزارع HSC للفأر8 ، والذي تم استخدامه الآن أيضا لاستزراع أنواع الخلايا المكونة للدمالأخرى 9. ومع ذلك ، تم مؤخرا تحديد بوليمر آخر يسمى Soluplus (بوليمر مشترك من البولي فينيل كابرولاكتام - أسيتات - بولي إيثيلين جلايكول) ، والذي يبدو أنه يحسن توسع HSC النسيلي10. قبل استخدام البوليمرات ، تم استخدام ألبومين المصل في شكل مصل بقري جنيني ، أو جزء ألبومين مصل الأبقار V ، أو ألبومين مصل المؤتلف ، ولكن كان لها دعم محدود لتوسيع HSC ودعمت فقط على المدى القصير (~ 1 أسبوع) ثقافة خارج الجسم الحي 7. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن بروتوكولات ثقافة HSC التي تحتفظ ب HSCs في حالة هادئة يمكن أن تدعم وقتا أطول للثقافة خارج الجسم الحي 11,12.

بالمقارنة مع طرق الاستزراع الأخرى ، فإن الميزة الرئيسية للثقافات القائمة على PVA هي عدد الخلايا التي يمكن إنشاؤها وطول الوقت الذي يمكن فيه استخدام البروتوكول لتتبع HSCs خارج الجسم الحي. هذا يتغلب على العديد من الحواجز في مجال أمراض الدم التجريبية ، مثل انخفاض أعداد HSCs المعزولة لكل فأر (بضعة آلاف فقط) وصعوبة تتبع HSCs بمرور الوقت في الجسم الحي. ومع ذلك ، من المهم أن نتذكر أن هذه الثقافات تحفز انتشار HSC ، في حين أن تجمع HSC في الجسم الحي هو في الغالب هادئ في حالة مستقرة13. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن الثقافات انتقائية ل HSCs ، إلا أن أنواع الخلايا الإضافية تتراكم مع الثقافات بمرور الوقت ، ولا تمثل HSCs القابلة للزرع سوى خلية واحدة فقط من كل 34 خلية بعد شهر 1. يبدو أن الخلايا السلفية المكونة للدم النخاعية هي نوع الخلايا الملوثة الرئيسية في ثقافات HSCهذه 8. ومع ذلك ، يمكننا استخدام هذه الثقافات لإثراء HSCs من مجموعات الخلايا غير المتجانسة (على سبيل المثال ، c-Kit + نخاع العظم HSPCs14). كما أنه يدعم النقل أو التثقيب الكهربائي ل HSCs للتلاعب الجيني14،15،16. للمساعدة في تحديد HSCs من مجموعات HSPC المستزرعة غير المتجانسة ، تم تحديد CD201 (EPCR) مؤخرا كعلامة HSC مفيدة خارج الجسم الحي 10،17،18 ، مع HSCs القابلة للزرع تقتصر على CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage- جزء.

يصف هذا البروتوكول طرقا لبدء وصيانة وتقييم ثقافات توسع HSC للفأر القائم على PVA ، بالإضافة إلى بروتوكولات التلاعب الجيني داخل هذه الثقافات باستخدام التثقيب الكهربائي أو نقل ناقل الفيروسات العدسية. من المتوقع أن تكون هذه الطرق مفيدة لمجموعة من أخصائيي أمراض الدم التجريبيين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يجب تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية ، بما في ذلك التربية والقتل الرحيم ، ضمن المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية. تمت الموافقة على التجارب المفصلة أدناه من قبل وزارة الداخلية البريطانية. انظر جدول المواد للحصول على قائمة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد حلول الأسهم

  1. حل الأسهم PVA
    1. خذ 50 مل من الماء عالي الجودة لزراعة الأنسجة في زجاجة زجاجية صغيرة (مناسبة للتعقيم). قم بتسخين الماء حتى يقترب من الغليان في الميكروويف.
    2. تزن 5 غرام من مسحوق PVA وتضاف إلى الماء.
      ملاحظة: يوصى بإذابة 1-5 جم فقط من PVA. قد يؤدي حل كميات أكبر إلى إعادة تكوين غير كاملة.
    3. أغلق الغطاء بإحكام واهتز للخلط. ثم قم بفك الغطاء.
      ملاحظة: كن حذرا عند إعادة الفتح ، حيث قد يتغير الضغط بسبب تغير درجة حرارة الماء.
    4. الأوتوكلاف والسماح لتبرد. أغلق الغطاء بإحكام واهتز للخلط. اصنع القسامات في أنابيب معقمة واحفظها لمدة تصل إلى 3 أشهر عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بإذابة السيتوكينات المجففة بالتجميد في وسط F-12 يحتوي على 1 مجم / مل PVA. إعادة تكوين عامل الخلايا الجذعية إلى 10 ميكروغرام / مل والثرومبوبويتين إلى 100 ميكروغرام / مل لتوليد 1: 1000 سهم. اصنع القسامات في أنابيب معقمة وقم بتخزينها على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، قم بتخزين القسمة في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
    ملاحظة: تجنب إعادة تكوين السيتوكينات في ألبومين مصل الأبقار بسبب التأثير السلبي على توسع HSC للفئران.

2. استخراج نخاع العظم HSC وتخصيب c-Kit +

  1. تشريح عظم الفخذ والنقش والحوض والعمود الفقري من الفئران C57BL / 6 التي تم قتلها رحيما حديثا والتي تبلغ من العمر 8-12 أسبوعا (عن طريق اختناق CO2 و / أو خلع عنق الرحم) ووضع العظام في برنامج تلفزيوني على الجليد.
    ملاحظة: تأكد من تعقيم الأسطح والأدوات بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  2. نظف العظام باستخدام مناديل المهام الحساسة الخالية من النسالة ، وإزالة العضلات والحبل الشوكي ، وأضفها إلى الهاون باستخدام ~ 3 مل من برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: تأكد من تعقيم المدقة والملاط بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم غسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني.
  3. سحق العظام بالمدقة دون طحن لتقليل قوى القص. قم بتفتيت شظايا نخاع العظم الكبيرة التي تم إطلاقها في برنامج تلفزيوني باستخدام إبرة 19 جم متصلة بحقنة سعة 5 مل. انقل تعليق الخلية من خلال مرشح 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  4. بمجرد نقل التعليق ، كرر مع برنامج تلفزيوني جديد حتى يتم تبييض العظام وعدم ظهور النخاع. تهدف إلى حجم نهاية ~ 30 مل لكل ماوس و ~ 50 مل لاثنين من الفئران.
  5. امزج خلايا نخاع العظم ، واجمع 10 ميكرولتر من الخلايا ، وعد باستخدام محلول Türks بتخفيف 1: 10-1: 20 باستخدام مقياس الدم.
    ملاحظة: من المتوقع أن ينتج فأر واحد 2-5 × 108 خلايا نخاع عظمي كاملة.
  6. قم بالدوران عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني بارد (350 ميكرولتر لفأر واحد أو 500 ميكرولتر لفأرين).
  7. أضف 0.2 ميكرولتر من الجسم المضاد لل allophycocyanin (APC) المضاد ل c-Kit لكل 10 ملايين خلية واحتضانها لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  8. أضف 5 مل من برنامج تلفزيوني بارد إلى الخلايا المحتضنة لغسل الأجسام المضادة الزائدة والتصفية من خلال مرشح 50 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
  9. اغسل الأنبوب الأصلي ب 7 مل من برنامج تلفزيوني بارد وانقله عبر الفلتر. في حالة حدوث انسداد في المرشح ، خدش سطح المرشح بطرف P1000.
  10. قم بالدوران عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني بارد (350 ميكرولتر لفأر واحد أو 500 ميكرولتر لفأرين).
  11. أضف 0.2 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة ل APC لكل 10 ملايين خلية واحتضانها لمدة 15 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية. أضف 12 مل من برنامج تلفزيوني معقم لغسل الميكروبيدات الزائدة.
  12. قم بتدوير الخلايا عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وأعد تعليقها في 2 مل من برنامج تلفزيوني بارد. أثناء دوران الخلايا في هذه الخطوة، انتقل إلى الخطوة 2.13.
  13. استعد لتخصيب العمود عن طريق وضع عمود ترشيح مغناطيسي في مغناطيس فاصل عمود مغناطيسي ، مع مرشح 50 ميكرومتر في الأعلى وأنبوب مخروطي 15 مل أدناه.
  14. قم بتشغيل 3 مل من PBS المعقم من خلال مرشح 50 ميكرومتر وعمود الترشيح. بمجرد تشغيل PBS ، مرر تعليق الخلية عبر العمود ، متبوعا بثلاث غسلات من 3 مل من PBS البارد في كل مرة. لكل غسلة ، انتظر حتى يتوقف العمود عن التنقيط قبل إضافة الغسلة التالية.
  15. أخرج العمود من المغناطيس وضعه فوق أنبوب جديد سعة 15 مل. أضف 5 مل من برنامج تلفزيوني بارد ، وقم بتركيب مكبس العمود على العمود ، وقم بإزالة الخلايا عن طريق دفع المكبس.
  16. امزج الخلايا المخصبة ب c-Kit ، واجمع 10 ميكرولتر من الخلايا ، وعد باستخدام محلول Türks بتخفيف 1: 2 باستخدام مقياس الدم. العائد النموذجي من فأر واحد هو 2-5 × 106 خلايا c-Kit + .
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن زرع الخلايا مباشرة في وسائط HSC أو تحضيرها لتنقية فرز الخلايا المنشطة بمضان HSC (FACS).

3. بدء زراعة الخلايا باستخدام HSPCs المخصب ب c-Kit

  1. تحضير وسط جديد (الجدول 1) لعدد الخلايا / الآبار المطلوبة. بذرة 0.5-1 مليون خلية لكل مل ل HSPCs المخصبة ب c-Kit.
  2. قم بتدوير الخلايا المخصبة ب c-Kit وأعد تعليقها في وسط HSC بكثافة الخلية المطلوبة.
  3. انقل الخلايا إلى ألواح مشحونة سطحية مغلفة بالفبرونيكتين أو سالبة ، عند 200 ميكرولتر لكل لوحة 96 بئرا أو 1 مل لكل لوحة 24 بئرا.
  4. ضع الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة مضبوطة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

4. بدء مزارع الخلايا باستخدام HSCs المنقى FACS

  1. قم بإعداد حجم مناسب من صبغة الأجسام المضادة للسلالة الحيوية: 3 ميكرولتر من المزيج الرئيسي (الجدول 2) لكل 10 ملايين خلية ، مخففة 1: 100 في برنامج تلفزيوني.
  2. قم بتدوير الخلايا المخصبة ب c-Kit وأعد تعليقها في بقعة الأجسام المضادة للنسب لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. يغسل ب 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم ويقلب لأسفل عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. تحضير حجم مناسب من بقعة الأجسام المضادة HSC الطازجة (الجدول 3): 300 ميكرولتر لكل 10 ملايين خلية. إلى جانب تلطيخ العينة هذا ، قم بإعداد عينات التحكم في التلوين المناسبة للتعويض والبوابة.
    ملاحظة: اعمل في غطاء زراعة الأنسجة مع إطفاء الضوء عند استخدام الأجسام المضادة المقترنة بالصبغة.
  5. أعد تعليق الخلايا في بقعة الأجسام المضادة HSC واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 90 دقيقة. امزج الخلايا كل 20-30 دقيقة عن طريق النقر لمنع تكوير الخلايا.
  6. يغسل ب 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم ويقلب لأسفل عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. نضح المادة الطافية ، ونفض الحبيبات لتعطيلها ، وأعد تعليقها في برنامج تلفزيوني معقم مع 0.5 ميكروغرام / مل يوديد البروبيديوم (PI).
  8. تحضير وسط طازج (الجدول 1) لعدد الآبار المطلوبة ، ولوحة في الفبرونيكتين أو ألواح سالبة مشحونة سطحية (200 ميكرولتر لكل صفيحة 96 بئر أو 1 مل لكل صفيحة 24 بئر).
  9. قم بإعداد آلة FACS لفرز وفرز CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- HSCs مباشرة في الآبار المحتوية على الوسائط (انظر الشكل 1 لاستراتيجية بوابات FACS القياسية المستخدمة هنا). قم بفرز ما يصل إلى 200 خلية لكل بئر صفيحة 96 بئرا أو ما يصل إلى 1000 خلية لكل بئر صفيحة 24 بئرا.
    ملاحظة: يجب تشغيل آلات FACS بواسطة عالم مدرب. ومن المستحسن أن يتصل المستخدمون بمرفق نظام مراقبة الأصول الميدانية المحلي لمناقشة استراتيجية الفرز هذه إذا لم يكونوا من ذوي الخبرة في عزل نظام مراقبة الأصول الميدانية لمركبات الفرز الخاصة بالماوس.

5. إجراء تغييرات الوسائط

  1. بالنسبة لثقافات الخلايا التي بدأت من الخلايا المخصبة ب c-Kit ، ابدأ تغييرات الوسائط بعد 2 أيام. بالنسبة لمزارع الخلايا التي تبدأ من HSCs المعزولة FACS ، ابدأ تغييرات الوسائط بعد 5 أيام.
  2. قم بإعداد ما يكفي من وسط HSC الطازج المسخن مسبقا (~ 37 درجة مئوية) (الجدول 1) لجميع الآبار.
  3. قم بإزالة اللوحة برفق من حاضنة زراعة الأنسجة.
    ملاحظة: نظرا لأن HSPCs الموجودة على الألواح المشحونة بالسطح السلبي يتم إزعاجها بسهولة أكبر من تلك الموجودة على الفبرونيكتين ، يجب توخي الحذر الشديد عند تغيير الوسط على الألواح المشحونة بالسطح السلبي لتجنب إزعاج مزارع الخلايا.
  4. باستخدام ماصة أو مضخة تفريغ ، قم بإزالة ببطء ~ 90٪ -95٪ من الوسط من الغضروف المفصلي للبئر.
    ملاحظة: تجنب سحب الوسيط من قاعدة البئر ، وإلا ستتم إزالة العديد من الخلايا.
  5. أضف 200 ميكرولتر (لألواح 96 بئرا ؛ 1 مل لألواح 24 بئرا) من الوسط الطازج إلى البئر.
  6. أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الأنسجة.
  7. كرر الخطوات 5.1-5.6 كل 2-3 أيام حتى نقطة النهاية التجريبية.
  8. بالنسبة لمزارع الخلايا التي بدأت باستخدام HSPCs المخصبة ب c-Kit (القسم 3) ، قم بتقسيم الثقافات بنسبة 1: 2-1: 3 بعد ~ 3 أسابيع. بالنسبة لمزارع الخلايا التي بدأت باستخدام HSCs المنقى FACS (القسم 4) ، قم بتقسيم الثقافات بنسبة 1: 2-1: 3 بعد ~ 3 أسابيع وعندما تكون الثقافات متقاربة بنسبة >90٪.
    ملاحظة: يعتمد الجدول الزمني الدقيق على الاهتمامات التجريبية. تم تمييز هذه الثقافات لمدة 4-8 أسابيع8 ، ولكن قد يكون من الممكن أطوال استزراع إضافية.

6. الكهرباء HSPCs مثقف

ملاحظة: هذا البروتوكول مخصص للتثقيب الكهربائي للبروتين النووي الريبي Cas9 / sgRNA (RNP) ، ولكن يمكن تكييفه للتثقيب الكهربائي ل mRNA أو البروتينات الأخرى المؤتلفة. بدء الثقافات مع أعداد كافية من الخلايا من أجل القيام بذلك في النقطة الزمنية التجريبية المطلوبة.

  1. إجراء تغيير متوسط 1 يوم قبل التثقيب الكهربائي ، كما هو موضح في القسم 5.
    ملاحظة: يوصى بزراعة ما لا يقل عن ليلة واحدة قبل التثقيب الكهربائي. ومع ذلك ، يتم استزراع الخلايا عادة لمدة 1-3 أسابيع قبل النقل.
  2. في يوم التثقيب الكهربائي ، قم بإعداد nucleofector. قم بتشغيل الجهاز. على شاشة اللمس ، حدد وحدة X ثم حجم cuvette المستخدم.
  3. قم بإعداد محلول P3 كاف (وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) لمقياس التثقيب الكهربائي (100 ميكرولتر لكل كفيت أو 20 ميكرولتر لكل ميكروكوفيت) والسماح بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة.
  4. قم بإعداد وسط طازج كاف (الجدول 1) لعدد الآبار التي يتم طلاؤها وأضف 500 ميكرولتر من الوسط لبئر صفيحة 24 بئرا أو 100 ميكرولتر من الوسائط إلى بئر صفيحة 96 بئرا.
  5. قم بإذابة sgRNA (المخفف مسبقا إلى 2 ميكروغرام / مل في ماء خال من RNase) على الثلج واخلط 16 ميكروغرام من sgRNA مع 30 ميكروغرام من إنزيم Cas9 (عند 10 ميكروغرام / مل) في أنبوب PCR معقم. قم بتضمين أنبوب PCR إضافي يحتوي على بروتين Cas9 فقط كعنصر تحكم. تخلط عن طريق تحريك الأنبوب ، ثم تدور لفترة وجيزة. احتضان في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في دورة حرارية لتعقيد RNP ، ثم احتفظ بالأنابيب على الجليد.
    ملاحظة: يمكن تقليص هذا خمسة أضعاف في حالة إجراء التثقيب الكهربائي في microcuvettes.
  6. خلط ونقل HSPCs للتثقيب الكهربائي في أنبوب ؛ اجمع 10 ميكرولتر من الخلايا وعد باستخدام محلول Türks بتخفيف 1: 2 باستخدام مقياس الدم.
    ملاحظة: يوصى بالكهرباء 1-5 مليون خلية لكل 100 ميكرولتر كفيت (تم تصغيره خمسة أضعاف للميكروكوفيت).
  7. أدر الخلايا العددية المناسبة في أنبوب سعة 1.5 مل عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح أكبر قدر ممكن من المادة الطافية وإعادة تعليقها ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنواة.
  8. انقل تعليق الخلية على الفور إلى أنبوب PCR الذي يحتوي على RNP المعقد والماصة لأعلى ولأسفل ببطء لخلطها برفق ونقلها إلى كوفيت التثقيب الكهربائي 100 ميكرولتر. أخرج الخليط في الكوفيت ببطء وبحركة سائلة واحدة لتجنب تكوين فقاعات هواء في الكوفيت.
  9. على جهاز الحفر الكهربائي ، حدد موضع الآبار التي يتم تقثقبها بالكهرباء. باستخدام شاشة اللمس ، حدد برنامج نوع الخلية CD34 + أو الإنسان أو اكتب رمز النبض EO100. اضغط على الزر موافق ( OK ) .
  10. نقل cuvettes إلى electroporator. اضغط على زر البدء على شاشة اللمس لبدء التثقيب الكهربائي. مباشرة بعد التثقيب الكهربائي ، أضف 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى كوفيت (100 ميكرولتر في حالة استخدام ميكروكوفيت).
  11. نقل الخلايا بلطف إلى لوحة أعدت والعودة إلى حاضنة زراعة الأنسجة.
  12. بالنسبة للإجراءات التي تستخدم قالب متبرع AAV6 ، أضف الناقل مباشرة بعد نقل الخلايا إلى صفيحة مغلفة بالفبرونيكتين بتركيز 5000 ناقل / خلية.
  13. بعد 6-18 ساعة ، قم بإعداد وسيط جديد وقم بإجراء تغيير متوسط كما هو موضح في القسم 5. بالنسبة لهذا التغيير المتوسط ، قم بإزالة 80٪ -90٪ فقط من الوسيط.
    ملاحظة: تجنب سحب الوسط من قاعدة البئر.
  14. تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد 2 أيام أو أكثر (انظر القسم 8 للحصول على التفاصيل).
  15. استمر في إجراء تغييرات متوسطة كل 2 أيام ، كما هو موضح في القسم 5 ، حتى يتم الوصول إلى نقطة النهاية التجريبية.
    ملاحظة: تعتمد معدلات تحرير CRISPR / Cas9 باستخدام هذه الطريقة بشكل كبير على كفاءة الاستهداف ل sgRNA المصمم. تمت ملاحظة معدلات تحرير تصل إلى 95٪ باستخدام دليل فعال15. تم تفصيل المبادئ التوجيهية لتصميم sgRNA سابقا في مكان آخر19،20.

7. تحويل HSPCs المستنبتة مع ناقل عدسي فيروسي

ملاحظة: بدء مزارع بأعداد كافية من الخلايا ، لإجراء ذلك في النقطة الزمنية التجريبية المطلوبة.

  1. توليد وعيار ناقلات الفيروسات العدسية (اعتمادا على الأهداف التجريبية). ذوبان الجليد ناقلات الفيروسات العدسية على الجليد.
  2. إجراء تغيير متوسط (كما في القسم 5) ؛ ثم ، قم بخلط ونقل HSPCs لنقلها إلى أنبوب. اجمع 10 ميكرولتر من الخلايا وعد باستخدام محلول Türks بتخفيف 1: 2 باستخدام مقياس الدم.
    ملاحظة: يمكن تحويل الخلايا مباشرة بعد الطلاء. ومع ذلك ، يتم استزراع الخلايا عادة لمدة 1-3 أسابيع قبل النقل.
  3. إعادة طلاء الجرعة المطلوبة من الخلايا للنقل (عادة 100000 خلية لكل صفيحة 96 بئرا). بشكل منفصل ، لوحة خلايا التحكم السلبية غير المحولة.
    ملاحظة: في حالة استخدام ألواح مشحونة سطحية سالبة ، انقل الخلايا إلى ألواح مغلفة بالفبرونيكتين لنقل ناقل الفيروسات العدسية.
  4. أضف ناقل عدسي فيروسي إلى كل بئر من الخلايا: أضف 20 وحدة نقل لكل خلية لتحقيق ~ 30٪ كفاءة النقل. ومع ذلك ، حدد جرعة ناقل الفيروس العدسي تجريبيا ، اعتمادا على المتطلبات التجريبية.
    ملاحظة: تأكد من التخلص من ناقلات الفيروسات العدسية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  5. أعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 6 ساعات. بعد ذلك ، قم بإجراء تغيير متوسط كما هو موضح في القسم 5.
    ملاحظة: يحتوي الطافي على فيروس حي. التخلص منها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  6. تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي (على سبيل المثال ، لتعبير GFP) بعد 2 أيام أو أكثر. انظر القسم 8 للحصول على التفاصيل.
  7. استمر في إجراء تغييرات متوسطة كل 2 أيام ، كما هو موضح في القسم 5 ، حتى يتم الوصول إلى نقطة النهاية التجريبية.

8. تحليل التدفق الخلوي لثقافات HSPC

  1. قم بإعداد مزيج من الأجسام المضادة HSC المستنبتة خارج الجسم الحي في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS (الجدول 4). يخزن الخليط في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 1 شهر.
    ملاحظة: اعمل في غطاء زراعة الأنسجة مع إطفاء الأنوار عند استخدام الأجسام المضادة المقترنة بالصبغة.
  2. أضف 2 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة المركزة إلى 50 ميكرولتر من الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام. إلى جانب تلطيخ العينة هذا ، قم بإعداد عينات التحكم في التلوين المناسبة للتعويض والبوابة.
  3. أضف 200-1000 ميكرولتر من PBS تحتوي على 2٪ FBS وأجهزة طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية وأعد تعليقها في 100-500 ميكرولتر من PBS تحتوي على 2٪ FBS و 0.5 ميكروغرام / مل PI.
  4. قم بإعداد مقياس التدفق الخلوي وسجل ما لا يقل عن 10000 خلية حية لكل عينة.
    ملاحظة: يجب تشغيل أجهزة قياس التدفق الخلوي بواسطة عالم مدرب. يجب على المستخدمين الاتصال بمرفق FACS المحلي لمناقشة هذا التحليل إذا لم يكونوا من ذوي الخبرة في قياس التدفق الخلوي.
  5. تصدير البيانات بتنسيق FCS وتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل التدفق الخلوي المناسب. انظر الشكل 2 لاستراتيجية البوابات القياسية المستخدمة هنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بالنسبة لتنقية FACS ل HSCs ، نتوقع أنه داخل نخاع العظم المخصب ب c-Kit ، ~ 0.2٪ من الخلايا هي CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- السكان للشباب (8-12 أسبوعا) C57BL / 6 الفئران (الشكل 1). ومع ذلك ، فمن المحتمل أن الفئران المعدلة وراثيا أو الفئران من مختلف الأعمار تظهر ترددات HSC مختلفة. بعد 4 أسابيع من الثقافة ، نتوقع أن يكون جزء CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage ~ 10٪ (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نأمل أن يوفر هذا البروتوكول نهجا مفيدا للتحقيق في بيولوجيا HSC وتكون الدم وأمراض الدم بشكل عام. منذ التطوير الأولي لطريقة الاستزراع القائمة على PVA لHSCs 8 المنقاة من FACS ، تم توسيع الطريقة. على سبيل المثال ، ثبت أن الطريقة تعمل مع c-Kit المخصب بنخاع العظام ومع الألواح المشحونة بالسطحالسلبي 14. كما تم إثبات توافقه مع التنبيغ والتثقيب الكهربائي14,15. يمكن العثور على التحقق في الجسم الحي من ثقافات HSC و c-Ki...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر نواة قياس التدفق الخلوي WIMM للوصول إلى قياس التدفق الخلوي ، ونواة فحص الفيروسات WIMM لتوليد ناقلات الفيروسات العدسية. تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق كاي كيندال لسرطان الدم ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المعدات< / قوي >
طقم تشريحفيشر العلمي12764416
مقياس الدمأبليتون وودز المحدودةHC002
P3 خلية أولية 4D-Nucleofector X KitLonza V4XP-3024
المدقة والملاطلوازم المختبرات العلمية المحدودةX18000
QuadroMACS فاصلMiltenyi Biotec130-090-976
Materials< / قوي>
5 مل حقنةVWR الدولية المحدودة720-2519
19 G إبرةVWR الدولية المحدودة613-5394
50 مو ؛ مصفاة الخلايا mSysmex04-004-2317
70 & mu ؛ مصفاة الخلية mCorning431751
Kimtech مناديلVWR International Ltd115-2075
LS MACS العمودMiltenyi Biotec130-042-401
Recodes
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 & mu; زIDT 1081058
عامل الخلايا الجذعية المؤتلف للفأر الخالي من PeprotechAF-250-03
خثارة الفأر المؤتلف الخالية منPeprotechAF-315-14
مكافحة الفأر CD117 APC (استنساخ: 2B8) ThermoFisher17-1171-83
مضاد للفأر CD117 BV421 (استنساخ: 2B8)Biolegend105828
مضاد للفأر CD127   ؛ APC / Cy7 (استنساخ: A7R34) Biolegend135040
مضاد للفأر CD127 البيوتين (استنساخ: A7R34)Biolegend135006
مضاد للفأر CD150 PE / Cy7 (استنساخ: TC15-12F12.2) Biolegend115914
مضاد للفأر CD201   ؛ APC (استنساخ: eBio1560) ThermoFisher17-2012-82
مضاد للفأر CD34 FITC (استنساخ: RAM34) ThermoFisher11-0341-85
مضاد للفأر CD4   ؛ APC / Cy7 (استنساخ: RM4-5) Biolegend100526
البيوتين CD4 المضاد للفأر (استنساخ: RM4-5)Biolegend100508
مضاد للفأر CD45R & nbsp ؛ APC / Cy7 (استنساخ: RA3-6B2)Biolegend103224
مضاد للفأر CD45R البيوتين (استنساخ: RA3-6B2) Biolegend103204
مضاد للفأر CD48 BV421 (استنساخ: HM48-1) Biolegend103428
مضاد للفأر CD8 biotin (استنساخ: 53-6.7) Biolegend100704
مضاد للفأر CD8a   ؛ APC / Cy7 (استنساخ: 53-6.7)Biolegend100714
مضاد للفأر Ly6G / Ly6C   ؛ APC / Cy7 (استنساخ: RB6-8C5) Biolegend108424
البيوتين Ly6G / Ly6C المضاد للفأر (استنساخ: RB6-8C5)Biolegend108404
مضاد للفأر Sca1 PE (استنساخ: D7) Biolegend108108
مضاد للفأر Ter119   ؛ APC / Cy7 (استنساخ: TER-119)Biolegend116223
البيوتين Ter119 المضاد للفأر (استنساخ: TER-119) لوحاتBiolegend116204
CellBIND ، 24 بئراCorning3337سالبة مشحونة
بالسطح ، 96-well  ؛Corning3330سالب مشحون بالسطح
مخصص sgRNA الاصطناعية   ؛Synthego ، Sigma Aldrich ، IDTطلب
مصل الأبقار الجنينMerck Life Science UK LimitedF7524-50ML
ألواح مطلية بالفبرونيكتين ، 96 بئرBD Biosciences354409
Ham's F-12 Nutrient MixGibco11765054
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - X (100x)جيبكو51500.056
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتAlfa AesarJ61196. AP
كحول البولي فينيلSigma AldrichP8136
بروبيديوم يوديدإنزو علوم الحياة (المملكة المتحدة) المحدودةEXB-0018
Streptavidin APC / Cy7Biolegend405208
T & uuml; RKS' الحلسيجما ألدريتش109277
فيركونميتلر توليدو المحدودة95015662
صفحات CellBIND مخصص

المراجع

  1. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  2. Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
  3. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
  4. Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
  5. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  6. Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
  7. Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
  8. Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
  9. Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
  10. Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
  11. Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
  12. Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938(2021).
  13. Aal Wilson,, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
  14. Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568(2021).
  15. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686(2021).
  16. Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
  17. Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502(2022).
  18. Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
  19. Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
  20. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
  21. Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
  22. Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مزرعة كحول البولي فينيلاستخلاص نخاع العظامترنسدكشن فيروسي لينتيتقنية التثقيب الكهربائيإثراء c-Kitالفرز الخلوي المنشط بالفلوريةزراعة الخلايا الجذعية
إكس فيفو التوسع والتلاعب الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران في الثقافات القائمة على كحول البولي فينيل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.