Method Article

التطور السريع لدوائر تحديد حالة الخلية باستخدام النقل المتعدد

DOI:

10.3791/64793

⸱

February 24th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستغرق الدوائر الجينية المعقدة وقتا طويلا لتصميمها واختبارها وتحسينها. لتسهيل هذه العملية ، يتم نقل خلايا الثدييات بطريقة تسمح باختبار قياسات متكافئة متعددة لمكونات الدائرة في بئر واحد. يحدد هذا البروتوكول خطوات التخطيط التجريبي والنقل وتحليل البيانات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت الدوائر الوراثية للثدييات القدرة على استشعار وعلاج مجموعة واسعة من الحالات المرضية ، لكن تحسين مستويات مكونات الدائرة لا يزال يمثل تحديا ويتطلب عمالة مكثفة. لتسريع هذه العملية ، طور مختبرنا النقل المتعدد ، وهو امتداد عالي الإنتاجية لنقل الثدييات التقليدي. في poly-transfection ، تقوم كل خلية في السكان المنقولين بشكل أساسي بإجراء تجربة مختلفة ، واختبار سلوك الدائرة بأرقام نسخ مختلفة من الحمض النووي والسماح للمستخدمين بتحليل عدد كبير من القياسات المتكافئة في تفاعل وعاء واحد. حتى الآن ، تم إثبات عمليات النقل المتعددة التي تعمل على تحسين نسب الدوائر المكونة من ثلاثة مكونات في بئر واحد من الخلايا. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام نفس الطريقة لتطوير دوائر أكبر. يمكن تطبيق نتائج النقل المتعدد بسهولة للعثور على النسب المثلى من الحمض النووي إلى النقل المشترك للدوائر العابرة أو لاختيار مستويات التعبير لمكونات الدائرة لتوليد خطوط خلايا مستقرة.

هنا ، نوضح استخدام النقل المتعدد لتحسين دائرة مكونة من ثلاثة مكونات. يبدأ البروتوكول بمبادئ التصميم التجريبي ويشرح كيف يبني النقل المتعدد على طرق النقل المشترك التقليدية. بعد ذلك ، يتم إجراء نقل متعدد للخلايا ويتبعه قياس التدفق الخلوي بعد بضعة أيام. أخيرا ، يتم تحليل البيانات عن طريق فحص شرائح بيانات قياس التدفق الخلوي أحادي الخلية التي تتوافق مع مجموعات فرعية من الخلايا ذات نسب مكونات معينة. في المختبر ، تم استخدام poly-transfection لتحسين مصنفات الخلايا ، والتغذية المرتدة وأجهزة التحكم في التغذية الأمامية ، والزخارف ثنائية الاستقرار ، وغيرها الكثير. تعمل هذه الطريقة البسيطة والقوية على تسريع دورات التصميم للدوائر الجينية المعقدة في خلايا الثدييات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم مجال البيولوجيا التركيبية للثدييات بسرعة ، من تطوير أجزاء بسيطة من الإحساس والاستجابة في خطوط الخلايا المستزرعة إلى تحسين الشبكات المعقدة من الجينات لمواجهة تحديات العالم الحقيقي في التشخيص والعلاج1. هذه الدوائر المتطورة قادرة على استشعار المدخلات البيولوجية من ملفات تعريف microRNA إلى السيتوكينات إلى أدوية الجزيئات الصغيرة ، وتنفيذ دوائر المعالجة المنطقية بما في ذلك الترانزستورات ومرشحات تمرير النطاق ومفاتيح التبديل والمذبذبات. كما أظهروا نتائج واعدة في النماذج الحيوانية لأمراض مثل السرطان والتهاب المفاصل والسكري وغيرها الكثير1،2،3،4....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يعمل الجدولان 1 و2 كمرجعين هامين لهذا البروتوكول. يوضح الجدول 1 مقياس الكاشف للتفاعلات ، ويبين الجدول 2 حساب نسبة الحمض النووي لمثال متعدد النقل الموصوف في البروتوكول (النصف العلوي) ولتجربة متابعة محتملة (النصف السفلي).

1. تحضير الخلايا للانتقال

  1. تأكد من أن مزرعة خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK293) متقاربة بنسبة 60٪ -80٪ قبل بدء البروتوكول. للقيام بذلك ، قم بزرع 1 × 106 خلايا في طبق بتري لزراعة الأنسجة 100 مم × 15 مم قبل يومين ، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    ملاحظة: على الرغم من أن بروتوكولنا يركز على خلايا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الشكل 1 ، نقارن النقل المشترك بالنقل المتعدد. في النقل المشترك ، يتم تسليم جميع البلازميدات في نفس مزيج النقل ، مما يؤدي إلى ارتباط كبير بين كمية كل بلازميد تتلقاه أي خلية واحدة (الشكل 1 أ). في حين أن عدد البلازميدات الكلية التي يتم توصيلها إلى كل خلية يختلف اختلافا كبيرا ، فإن مضان البروتينين المراسلين في الخلايا الفردية عبر السكان مرتبط جيدا ، مما يشير إلى أن البلازميدات يتم توصيلهما بشكل مشترك بنسبة ثابتة إلى حد ما. قد تمتص الخلايا المنقولة عددا قليلا أو ك.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحدثت طرق النماذج الأولية السريعة مثل التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) وألواح التجارب والطباعة ثلاثية الأبعاد 3D ثورة في تخصصات الهندسة الميكانيكية والكهربائية والمدنية. إن القدرة على البحث بسرعة من خلال العديد من الحلول الممكنة لتحد معين تسرع بشكل كبير من التقدم في مجال ما. نعتقد أن النقل المتعدد هو تقنية مماثلة للهندسة البيولوجية ، مما يتيح النماذج الأولية السريعة للدوائر الوراثية. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب تقنيات النماذج الأولية السريعة الأخرى تكرارا تسلسليا عمليا لحلول متعددة ممكنة ، في حين أن النقل المتعدد قادر على اس.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RW هو أحد مؤسسي Strand Therapeutics و Replay Bio. قدم RW و RJ براءة اختراع مؤقتة تتعلق بمصنف نوع الخلية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر أعضاء مختبر فايس السابقين الذين قادوا أو ساهموا في تطوير طريقة النقل المتعدد وتطبيقها على مصنفات الخلايا: جيريمي جام وبري دي أندريث وجين هوه. أعضاء مختبر فايس الآخرين الذين ساهموا في مزيد من تطوير / تحسين الطريقة: Wenlong Xu و Lei Wang و Christian Cuba-Samaniego ؛ البروفيسور جوش ليونارد وأعضاء المجموعة ، بما في ذلك باتريك دوناهو وهيلي إدلشتاين ، لاختبار النقل المتعدد وتقديم الملاحظات ؛ والبروفيسور نيكا شكيبا لدعوته هذه المخطوطة وتقديم ملاحظاته. نود أيضا أن نشكر المعاهد الوطنية للصحة [R01CA173712 ، R01CA207029 ، P50GM098792] ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم [1745645]؛ منحة دعم مركز السرطان (الأساسية) [P30CCA14051 ، جزئيا] من المعهد الوطني للسرطان والمعاهد الوطنية ل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 مل أنابيب مخروطية Corning FalconThermoFisher Scientific14-959-53A
طبق بتري 24 بئرأي شركة من اختيارها(غير معرق ، معقم ، RNase ، DNase ، DNA وخالية من البيروجين)
ألبومين مصل البقرNEBB9000S
الطرد المركزيأي شركة من اختيارهاقادرة على تعريض أنابيب الصقر سعة 15 مل إلى 300 RCF
الكونتيسة 3 عداد الخلايا الآليThermoFisher ScientificAMQAX2000
الكونتيسة غرفة عد الخلايا شرائحThermoFisher ScientificC10228
Cytoflowحزمةhttps://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#  ؛
DMEMVWR10-013-CVاستخدم الوسائط الصحيحة لنوع الخلية
EDTA ThermoFisher Scientific03690-100ML
مصل الأبقار الجنينيSigma AldrichF4135
خلاياHEK ATCCCRL-1573استخدم نوع الخلية ذات الصلة لتجاربك. تميل خلايا HEK إلى التعدي بكفاءة عالية.
خلايا HeLaATCCCRL-12401استخدم نوع الخلية ذي الصلة لتجاربك.
محسن Lipofectamine 3000 و P3000ThermoFisher ScientificL3000001استخدم الكاشف الصحيح لنوع الخلية ؛ كاشف التعداء والمحسن
LSRFortessa مقياس التدفق الخلويBD BiosciencesN / A
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسيةجيبكو11140050
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 1.5 ملأي شركة من اختيارها
Opti-MEMThermoFisher Scientific31985070مصل متوسط مخفضة
محلول ملحيمخزن فوسفات ThermoFisher Scientific70011044
حبات معايرة قوس قزحSpherotechURCP-100-2H
أزيد الصوديومSigma AldrichS2002
TrypsinVWR25-053-CI
البرامج غير التجارية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
  2. Sayeg, M. K., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Poly TransfectionGenetic CircuitsCell State IdentificationMammalian CellsFlow CytometryCo TransfectionDNA Ratio OptimizationFluorescent ReportersCell ClassifierSynthetic Biology

Related Articles