مقالة منهجية

التحقيق في الآثار الوقائية للبلاتيكودين D على مرض الكبد الدهني غير الكحولي في نموذج المختبر الناجم عن حمض النخيل

2.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64816

⸱

ديسمبر 2, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يبحث هذا البروتوكول في الآثار الوقائية للبلاتيكودين D على مرض الكبد الدهني غير الكحولي في نموذج المختبر الناجم عن حمض البالمتيك.

الملخص

يتزايد حدوث مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) بمعدل ينذر بالخطر في جميع أنحاء العالم. يستخدم Platycodon grandiflorum على نطاق واسع كطب عرقي تقليدي لعلاج الأمراض المختلفة وهو غذاء وظيفي نموذجي يمكن دمجه في النظام الغذائي اليومي. أشارت الدراسات إلى أن platycodin D (PD) ، أحد المكونات النشطة الرئيسية في Platycodon grandiflorum ، لديه توافر بيولوجي مرتفع ويخفف بشكل كبير من تقدم NAFLD ، لكن الآلية الأساسية لذلك لا تزال غير واضحة. تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق في التأثير العلاجي لمرض باركنسون ضد NAFLD في المختبر. تمت معالجة خلايا AML-12 مسبقا بحمض البالمتيك 300 ميكرومتر (PA) لمدة 24 ساعة لنمذجة NAFLD في المختبر. بعد ذلك ، تم علاج الخلايا إما بمرض باركنسون أو لم تتلق أي علاج لمرض باركنسون لمدة 24 ساعة. تم تحليل مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام تلطيخ ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلوريسئين (DCFH-DA) ، وتم تحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا بطريقة تلطيخ JC-1. علاوة على ذلك ، تم تحليل مستويات التعبير البروتيني ل LC3-II / LC3-I و p62 / SQSTM1 في محللات الخلية عن طريق النشاف الغربي. وجد أن PD يقلل بشكل كبير من مستويات إمكانات غشاء ROS والميتوكوندريا في المجموعة المعالجة ب PA مقارنة بالمجموعة الضابطة. وفي الوقت نفسه ، زاد PD من مستويات LC3-II / LC3-I وخفض مستويات p62 / SQSTM1 في المجموعة المعالجة ب PA مقارنة بالمجموعة الضابطة. أشارت النتائج إلى أن PD خفف من NAFLD في المختبر عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي وتحفيز الالتهام الذاتي. هذا النموذج في المختبر هو أداة مفيدة لدراسة دور PD في NAFLD.

المقدمة

Platycodon grandiflorus (PG) ، وهو الجذر المجفف ل Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC ، يستخدم في الطب الصيني التقليدي (TCM). يتم إنتاجه بشكل رئيسي في المناطق الشمالية الشرقية والشمالية والشرقية والوسطى والجنوبية الغربية من الصين1. تشمل مكونات PG الصابونين ثلاثي التربينويد ، والسكريات ، والفلافونويد ، والبوليفينول ، والبولي إيثيلين جلايكول ، والزيوت المتطايرة ، والمعادن2. PG لها تاريخ طويل من استخدامها كغذاء ودواء عشبي في آسيا. تقليديا ، تم استخدام هذه العشبة لصنع الدواء ضد أمراض الرئة. يوفر علم الصيدلة الحديث أيضا دليلا على فعالية PG لعلاج الأمراض الأخرى. أظهرت الدراسات أن PG له تأثير علاجي على مجموعة متنوعة من نماذج إصابة الكبد التي يسببها الدواء. المكملات الغذائية من PG أو platycodin المستخلصات يمكن أن تخفف من السمنة التي يسببها النظام الغذائي عالي الدهون والأمراض الأيضية المرتبطة بها3،4،5. يمكن استخدام السكريات من PG لعلاج إصابة الكبد الحادة الناجمة عن LPS / D-GalN في الفئران6. علاوة على ذلك ، فإن الصابونين من جذور PG يحسن من التهاب الكبد الدهني غير الكحولي الناجم عن النظام الغذائي عالي الدهون (NASH)7. علاوة على ذلك ، يمكن أن يعزز platycodin D (PD) ، أحد أهم المكونات العلاجية ل PG ، تعبير مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة وامتصاص البروتين الدهني منخفض الكثافة في خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية (HepG2)8. علاوة على ذلك ، يمكن أن يحفز PD أيضا موت الخلايا المبرمج ويمنع الالتصاق والهجرة والغزو في خلايا HepG2 9,10. وهكذا ، في هذه الدراسة ، يتم استخدام خلايا الورم الكبدي AML-12 في الفأر لبناء نموذج في المختبر ولمزيد من الدراسة للتأثيرات الدوائية والآليات الأساسية لمرض باركنسون في هذا النموذج.

يشير مصطلح مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) إلى مجموعة من أمراض الكبد التي تشمل التنكس الدهني البسيط ، و NASH ، وتليف الكبد ، وسرطان الخلايا الكبدية11. على الرغم من أن التسبب في NAFLD غير مفهوم بشكل كامل ، من نظرية "الضربتين" الكلاسيكية إلى نظرية "الضربات المتعددة" الحالية ، تعتبر مقاومة الأنسولين مركزية في التسبب في NAFLD12،13،14. أظهرت الدراسات أن مقاومة الأنسولين في خلايا الكبد يمكن أن تؤدي إلى زيادة الأحماض الدهنية الحرة ، والتي تشكل الدهون الثلاثية التي تترسب في الكبد وتتسبب في أن يصبح الكبد دهنيا15,16. يمكن أن يؤدي تراكم الدهون إلى السمية الدهنية ، واختلال وظائف الميتوكوندريا الناجم عن الإجهاد التأكسدي ، وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية ، وإطلاق السيتوكين الالتهابي ، مما يؤدي إلى التسبب في مرض وتطور NAFLD17,18. بالإضافة إلى ذلك ، يلعب الالتهام الذاتي أيضا دورا في التسبب في NAFLD ، حيث يشارك في تنظيم حساسية الأنسولين الخلوي ، واستقلاب الدهون الخلوية ، وإصابة خلايا الكبد ، والمناعة الفطرية19،20،21.

تم إنشاء مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية والنماذج الخلوية لتوفير أساس لاستكشاف التسبب في المرض والأهداف العلاجية المحتملة ل NAFLD22,23. ومع ذلك ، لا يمكن للنماذج الحيوانية الفردية تقليد جميع العمليات المرضية ل NAFLD24 بشكل كامل. الاختلافات الفردية بين الحيوانات تؤدي إلى سمات مرضية مختلفة. يضمن استخدام خطوط خلايا الكبد أو خلايا الكبد الأولية في الدراسات المختبرية ل NAFLD أقصى قدر من الاتساق في الظروف التجريبية. يمكن أن يؤدي عدم تنظيم استقلاب الدهون الكبدية إلى مستويات أعلى من تراكم قطرات الدهون في خلايا الكبد في NAFLD25. تم استخدام الأحماض الدهنية الحرة مثل حمض الأوليك وزيت النخيل في النموذج في المختبر لتقليد NAFLD الناجم عن اتباع نظام غذائي غني بالدهون26,27. غالبا ما يستخدم خط خلايا الورم الأرومي الكبدي البشري HepG2 في بناء نماذج NAFLD في المختبر ، ولكن كخط خلية ورمية ، يختلف استقلاب خلايا HepG2 اختلافا كبيرا عن استقلاب خلايا الكبد في ظل الظروف الفسيولوجية العادية28. لذلك ، فإن استخدام خلايا الكبد الأولية أو خلايا الكبد الأولية للفأر لبناء نموذج NAFLD في المختبر لفحص الأدوية أكثر فائدة من استخدام خطوط الخلايا السرطانية. بمقارنة الفحص التآزري لتأثيرات الأدوية والأهداف العلاجية في كل من النماذج الحيوانية ونماذج خلايا الكبد في المختبر ، يبدو أن استخدام خلايا الكبد الفأرية لبناء نموذج NAFLD في المختبر لديه إمكانات تطبيق أفضل.

تتأكسد الأحماض الدهنية الحرة التي تدخل الكبد لإنتاج الطاقة أو تخزن في صورة دهون ثلاثية. بشكل ملحوظ ، الأحماض الدهنية الحرة لها سمية دهنية معينة وقد تحفز الخلل الخلوي وموت الخلاياالمبرمج 12. حمض البالمتيك (PA) هو أكثر الأحماض الدهنية المشبعة وفرة في البلازما البشرية29. عندما تتعرض الخلايا في الأنسجة غير الدهنية لتركيزات عالية من PA لفترة طويلة ، فإن هذا يحفز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ويسبب الإجهاد التأكسدي وتراكم الدهون وحتى موت الخلايا المبرمج30. لذلك ، يستخدم العديد من الباحثين PA كمحفز لتحفيز خلايا الكبد لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، وبالتالي ، بناء نموذج مرض الكبد الدهني في المختبر وتقييم الآثار الوقائية لبعض المواد الفعالة على الخلايا31،32،33،34. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا للتحقيق في الآثار الوقائية لمرض باركنسون على نموذج خلية من NAFLD الناجم عن السلطة الفلسطينية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تستخدم خلايا AML-12 (خط خلايا الكبد الطبيعي للفأر) في الدراسات القائمة على الخلايا. يتم الحصول على الخلايا من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. المعالجة المسبقة لخلايا AML-12 لنمذجة NAFLD في المختبر

  1. الحفاظ على الخلايا في وسائط زراعة الخلايا الطبيعية (DMEM بالإضافة إلى Ham's F12 [1: 1] التي تحتوي على 0.005 مجم / مل من الأنسولين ، و 5 نانوغرام / مل من السيلينيوم ، و 0.005 مجم / مل من الترانسفيرين ، و 40 نانوغرام / مل من ديكساميثازون ، و 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] ، انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2.
  2. بذر الخلايا في 12 لوحة بئر (1 مل / بئر) بكثافة 2.8 × 105 خلايا / بئر.
    ملاحظة: يتم إجراء جميع عمليات هضم الخلايا والتبادل المتوسط في خزانة السلامة الحيوية لتجنب تلويث الخلايا.
  3. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا بعد الحضانة الليلية (~ 10 ساعات) ، ثم اغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من الوسائط الخالية من المصل (لكل بئر).
  4. قسم صفيحة الخلية المكونة من 12 بئرا إلى أربع مجموعات معالجة مختلفة من اليسار إلى اليمين ، بما في ذلك (1) المجموعة الضابطة ، (2) المجموعة المعالجة ب PD ، (3) المجموعة المعالجة ب PA ، و (4) المجموعة المعالجة PA + PD.
    ملاحظة: يتم ترتيب ثلاث نسخ متماثلة من كل مجموعة معالجة تجريبية من أعلى إلى أسفل على نفس لوحة الخلايا المكونة من 12 بئرا.
  5. أضف وسائط زراعة الخلايا العادية (1 مل / بئر) إلى المجموعة الضابطة والمجموعة المعالجة ب PD ، وأضف وسائط زراعة الخلايا العادية (1 مل / بئر) المكملة ب 300 ميكرومتر من PA إلى المجموعة المعالجة ب PA و PA + PD.
  6. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا بعد 24 ساعة من الحضانة ، ثم اغسل الخلايا ب 1 مل من الوسائط الخالية من المصل (لكل بئر) مرتين.
  7. إضافة وسائط زراعة الخلايا العادية (1 مل / بئر) مكملة بمركبة (ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO ، 0.1٪ v / v) إلى المجموعة الضابطة ؛ إضافة وسائط زراعة الخلايا العادية (1 مل / بئر) مكملة ب 1 ميكرومتر PD إلى المجموعة المعالجة ب PD ؛ إضافة وسائط زراعة الخلايا العادية (1 مل / بئر) مكملة ب 300 ميكرومتر PA إلى المجموعة المعالجة ب PA ؛ إضافة وسائط زراعة الخلايا الطبيعية (1 مل / بئر) مكملة ب 300 ميكرومتر PA و 1 ميكرومتر PD إلى المجموعة المعالجة PA + PD.
  8. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة إضافية ، تحقق من التأثيرات الوقائية لمرض باركنسون على الخلايا باستخدام تلطيخ ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلوريسئين 2 ′ (DCFH-DA) (الخطوة 2) ، تلطيخ JC-1 (الخطوة 3) ، والنشاف الغربي (الخطوة 4).
    ملاحظة: تتم جميع عمليات الحضانة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2.

2. قياس التغير في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية

ملاحظة: يتم تقييم مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في الخلايا بناء على مقايسة تلطيخ DCFH-DA.

  1. في نهاية فترة المعالجة (الخطوة 1.8) ، اغسل الخلايا ب 1 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات لكل بئر (1x PBS ، درجة الحموضة 7.4) ثلاث مرات ، ثم قم بتلطيخ الخلايا ب 100 ميكرولتر من 10 ميكرومتر DCFH-DA لكل بئر (انظر جدول المواد). احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: إذا لم يلاحظ أي مضان أخضر واضح بعد 30 دقيقة من الحضانة ، يمكن زيادة وقت حضانة المسبار والخلايا بشكل مناسب (30-60 دقيقة). إذا لوحظ التعرض المفرط لقيمة التألق الأخضر بعد 30 دقيقة من الحضانة ، يمكن تقليل وقت حضانة المسبار والخلايا بشكل مناسب (15-30 دقيقة).
  2. اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS (1 مل / بئر) ثلاث مرات. أضف 1 مل من 1x PBS إلى كل بئر.
  3. ضع اللوحة المكونة من 12 بئرا على مرحلة المجهر (انظر جدول المواد) ، ثم استخدم هدفا 20x لمراقبة مورفولوجيا الخلايا (التكبير: 200x).
  4. التقط ثلاث صور مضان تمثيلية (التكبير: 200x) لكل بئر على المجهر الفلوري باستخدام قناة الفلورسنت الخضراء بطول موجة إثارة يبلغ 480 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 530 نانومتر.
    ملاحظة: يوصى باستخدام قناة الفلورسنت الخضراء ذات الطول الموجي للإثارة 480 نانومتر وطول موجة الانبعاث 530 نانومتر للكشف عن DCFH-DA. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اكتشاف DCFH-DA باستخدام إعدادات المعلمات ل GFP و FITC في المجهر الفلوري35,36.
  5. أخيرا ، قم بمعالجة الصور باستخدام برنامج الحصول على الصور (انظر جدول المواد) ، ثم استخدم برنامج ImageJ لحساب متوسط شدة التألق لكل مجموعة أو نسب المجموعات المختلفة.
    ملاحظة: تم وصف التفاصيل الفنية للمجهر الفلوري وبرنامج Image J المستخدم في أعمال التصوير سابقا37,38.

3. قياس التغير في إمكانات غشاء الميتوكوندريا

ملاحظة: تتم مراقبة التغيرات في إمكانات غشاء الميتوكوندريا بواسطة مقايسة تلطيخ JC-1.

  1. في نهاية فترة العلاج (الخطوة 1.8) ، اغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS لكل بئر ثلاث مرات ، ثم قم بتلطيخ الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول عمل JC-1 5 ميكروغرام / مل (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
    ملاحظة: إذا لم يلاحظ أي مضان أخضر واضح بعد 30 دقيقة من الحضانة ، يمكن زيادة وقت حضانة المسبار والخلايا بشكل مناسب (30-60 دقيقة). إذا لوحظ التعرض المفرط لقيمة التألق الأخضر بعد 30 دقيقة من الحضانة ، يمكن تقليل وقت حضانة المسبار والخلايا بشكل مناسب (15-30 دقيقة).
  2. اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS (1 مل / بئر) ثلاث مرات. أضف 1 مل من 1x PBS إلى كل بئر.
  3. ضع اللوحة المكونة من 12 بئرا على مرحلة المجهر ، ثم استخدم هدفا 20x لمراقبة مورفولوجيا الخلايا (التكبير: 200x).
  4. التقط ثلاث صور فلورية تمثيلية (التكبير: 200x) لكل بئر على المجهر الفلوري باستخدام قناة الفلورسنت الخضراء ذات الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث 485 نانومتر و 535 نانومتر ، على التوالي ، وقناة الفلورسنت الحمراء بأطوال موجية للإثارة والانبعاث تبلغ 550 نانومتر و 600 نانومتر على التوالي.
    ملاحظة: يتم استخدام قناة الفلورسنت الخضراء ذات الطول الموجي للإثارة 485 نانومتر وطول موجة الانبعاث 535 نانومتر للكشف عن مونومر JC-1 ، والذي يتم التعامل معه على أنه ميتوكوندريا غير مستقطبة39،40،41 ، وتستخدم قناة الفلورسنت الحمراء بطول موجة إثارة يبلغ 550 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 600 نانومتر للكشف عن خافت JC-1 ، والتي تعامل على أنها ميتوكوندريا مستقطبة39،40،41.
  5. أخيرا ، قم بمعالجة الصور باستخدام برنامج الحصول على الصور ، ثم استخدم برنامج Image J لحساب متوسط شدة التألق لكل مجموعة أو نسب المجموعات المختلفة.
    ملاحظة: تم وصف التفاصيل الفنية للمجهر الفلوري وبرنامج Image J المستخدم في أعمال التصوير سابقا37,38.

4. قياس مستويات تعبير البروتين ل LC3-II / LC3-I و p62 / SQSTM1

  1. بعد العلاج (الخطوة 1.8) ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (1 مل / بئر) تم تبريده مسبقا عند 4 درجات مئوية.
  2. أضف محلول تحلل RIPA (100 ميكرولتر / بئر) المكمل بالبروتياز وكوكتيل مثبط الفوسفاتيز (1x) (انظر جدول المواد) إلى لوحة 12 بئرا ، وتحلل على الثلج لمدة 5 دقائق.
  3. اجمع الخلية المحللة في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 12000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تحديد تركيز البروتين من المواد الطافية بطريقة BCA باتباع الإجراءات القياسية42.
  4. أضف المخزن المؤقت لتحميل عينة SDS-PAGE (5x ، انظر جدول المواد) إلى طافات الخلية المحللة (نسبة الحجم = 1: 4).
  5. امزجه بواسطة الدوامة (بسرعة عالية لمدة ~ 15 ثانية) ، وقم بتسخين العينات المختلطة عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشويه البروتين.
  6. ضع جل SDS-PAGE 12٪ المجهز جيدا 12٪ في خزان الرحلان الكهربائي ، ثم أضف المخزن المؤقت لعينة SDS (1x) المخفف بالماء النقي للغاية إلى موضع حد الارتفاع.
    ملاحظة: يتم تحضير جل SDS-PAGE باستخدام مجموعة تجارية (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  7. أضف علامة البروتين (5 ميكرولتر / بئر) وعينات (20 ميكروغرام / بئر) إلى آبار مختلفة من جل SDS-PAGE.
  8. اضبط وضع الجهد المستقر على 100 فولت ، وقم بإجراء الرحلان الكهربائي لمدة 80 دقيقة.
  9. بعد الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ، قم بإجراء النقل الكهربائي للبروتينات إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) (0.45 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) بعد التقارير المنشورة سابقا43,44.
  10. بعد النقل الكهربائي للبروتينات ، اغسل غشاء PVDF ب 10 مل من TBST (1x TBS ، 0.1٪ Tween 20) مرتين (5 دقائق / مرة) في شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  11. سد غشاء PVDF مع 5 مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA ، 5٪) في شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  12. اغسل غشاء PVDF ب 10 مل من TBST ثلاث مرات (10 دقائق / وقت). بعد ذلك ، احتضان غشاء PVDF في 5 مل من الأجسام المضادة الأولية المحددة المخففة في المخزن المؤقت المانع ل LC3 (الماوس mAb ، 1: 2,000) ، p62 / SQSTM1 (المشار إليه فيما يلي باسم p62 ، mAb الماوس ، 1: 2,000) ، و β-actin (الماوس mAb ، 1: 2,000) (انظر جدول المواد) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  13. اغسل غشاء PVDF ب 10 مل من TBST ثلاث مرات (10 دقائق / وقت) في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضان غشاء PVDF بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب IgG (HRP) مخفف في حاجز مانع (1: 10,000) (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة ومحمي من الضوء لمدة 2 ساعة.
  14. اغسل غشاء PVDF ب 10 مل من TBST ثلاث مرات (10 دقائق / وقت) في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع غشاء PVDF على الغلاف البلاستيكي ، وأضف كمية مناسبة من محلول عمل ECL (200 ميكرولتر / غشاء) (انظر جدول المواد) ، واحتضانه لمدة 2 دقيقة.
  15. بعد الحضانة ، قم بإزالة حل عمل ECL ، وكشف غشاء PVDF في نظام التصوير لتطوير الصورة. أخيرا ، استخدم برنامج Image J لتحليل القيم الرمادية لكل نطاق.
    ملاحظة: تم وصف التفاصيل الفنية لبرنامج النشاف الغربي والصورة J المستخدم في أعمال التصوير سابقا45,46.

5. التحليل الإحصائي

  1. قدم البيانات من التجارب كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD).
  2. قم بإجراء تحليل الأهمية باستخدام أداة البرنامج الإحصائي الموضحة سابقا47.
  3. احسب الفروق الإحصائية بين المجموعتين باستخدام اختبار t. تعتبر القيمة P التي تقل عن 0.05 ذات دلالة إحصائية: * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، ** P < 0.005.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في الخلايا
تم تحفيز خلايا AML-12 ب 300 ميكرومتر PA لمدة 24 ساعة ، وتم إنشاء نموذج خلية NAFLD. في وقت لاحق ، عولجت الخلايا مع PD لمدة 24 ساعة. تم تمييز الخلايا بمسبار الفلورسنت DCFH-DA ، ولوحظ إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية تحت مجهر مضان. تظهر نتائج تلطيخ DCFH-DA لأنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في الشكل 1. أظهرت النتائج أن PD يمكن أن يقلل بشكل كبير من مستوى أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في الخلايا المحتضنة ب 300 ميكرومتر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أبرزت الدراسات حقيقة أن NAFLD هي متلازمة سريرية مرضية ، تتراوح من الكبد الدهني إلى NASH ، والتي يمكن أن تتطور إلى تليف الكبد وسرطان الكبد51. يعد النظام الغذائي عالي الدهون ونمط الحياة غير النشط من عوامل الخطر النموذجية لمرض الكبد الدهني غير الكحولي. تم بحث كل من العلاجات غير الدوائية والعلاجات الدوائية لعلاج NAFLD51،52،53. ومع ذلك ، لم يتم توضيح التسبب في NAFLD بشكل كامل. تتضمن الطريقة الموصوفة هنا نموذجا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يتم دعم هذا العمل من خلال منح من لجنة تشونغتشينغ للعلوم والتكنولوجيا (cstc2020jxjl-jbky10002 و jbky20200026 و cstc2021jscx-dxwtBX0013 و jbky20210029) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (رقم 2021MD703919).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5٪ BSA حجب العازلةSolarbio ، بكين ، الصينSW3015
AML12 (كبد الفأر ألفا 12) خط الخليةProcell Life Science & شركة التكنولوجيا المحدودة ، الصينAML12
Beyo ECL   ؛ بالإضافة إلىBeyotime ، شنغهاي ، الصينP0018S
خزانة السلامة الحيويةEsco Micro Pte Ltd ، سنغافورةAC2-5S1 A2 & nbsp ؛
cellSensأوليمبوس ، طوكيو ، اليابان1.8
ثقافة حاضنة CO2Esco Micro Pte Ltd ، سنغافورةCCL-170B-8
ديكساميثازونBeyotime ، شنغهاي ، الصينST125
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSolarbio ، بكين ، الصينD8371
DMEM / F12Hyclone ،   ؛ لوجان,  UT,  الولايات المتحدة الأمريكيةSH30023.01
مصل الأبقار الجنينيHyclone ، تاورانجا ، نيوزيلنداSH30406.05
برنامج GraphpadGraphPad Software Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية8.0
HRP الماعز المضاد للفأر IgG (H + L)ABclonal ، ووهان ، الصينAS003
غشاء نقل PVDF كاره للماءMerck ، دارمشتات ، ألمانياIPFL00010
الأنسولين ، ترانسفيرين ، محلول السيلينيوم ، 100 مرة ؛Beyotime ، شنغهاي ، الصينC0341
MAP LC3 & beta ؛ الأجسام المضادةسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةSC-376404
مجموعة فحص إمكانات غشاء الميتوكوندريا مع JC-1Solarbio ، بكين ، الصينM8650
Olympus المجهر المقلوب IX53أوليمبوس ، طوكيو ، اليابانIX53
حمض البالمتيكسيجما ، ألمانياP0500
محلول البنسلين والستربتومايسين (100x)Hyclone,  لوجان,  UT,  الولايات المتحدة الأمريكيةSV30010
Phenylmethanesulfonyl  الفلورايدBeyotime, شنغهاي, الصينST506
محلول الفوسفات المخزنHyclone,  لوجان,  UT,  الولايات المتحدة الأمريكيةBL302A
Platycodin DChengdu Must Bio-Technology Co.، Ltd ، الصينCSA: 58479-68-8
كوكتيل مثبط البروتياز للاستخدام العام ، 100xBeyotime ، شنغهاي ، الصينP1005
علامة البروتينSolarbio ، بكين ، الصينPR1910
مجموعة فحص أنواع الأكسجين التفاعليةSolarbio ، بكين ، الصينCA1410
RIPA  التحلل  BufferBeyotime ، شنغهاي ، الصينP0013E
SDS-Page Gel Quick PreparationBeyotime ، شنغهاي ، الصينP0012AC
SDS-PAGE عازلة تحميل العينة ، 5xBeyotime ، شنغهاي ، الصينP0015
Sigma جهاز طرد مركزيسيجما ، ألمانيا3K15
SQSTM1 / p62 الأجسام المضادةسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةSC-28359
تيكان إنفينيت 200 برو   Tecan Austria GmbH ، النمسا1510002987
WB Transfer Buffer ، 10xSolarbio ، بكين ، الصينD1060
& beta ؛ -Actin Mouse mAbABclonal ، ووهان ، الصينAC004
Kit

المراجع

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480(2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532(2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71(2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834(2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622(2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973(2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479(2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13(2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , Queen's University Belfast. Belfast, Ireland. (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 7, Unit 7.32 (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128(2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87(2012).
  45. Davarinejad, H. Quantifications of western blots with ImageJ. University of York. , Available from: http://www.yourku.ca/yisheng/internal/Protocols/Imagej.pdf (2015).
  46. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590(2014).
  47. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  48. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  49. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  50. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  51. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  52. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  53. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  54. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  55. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  56. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359(2016).
  57. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976(2021).
  58. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459(2018).
  59. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  60. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  61. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  62. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  63. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060(2020).
  64. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  65. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AML 12 DCFH DA JC 1

مقالات ذات صلة