مقالة منهجية

الترسيب المناعي للكروماتين في نظام نموذج Cnidarian Exaiptasia diaphana

2.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64817

⸱

مارس 17, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Red Sea Research Center (RSRC), Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 2KAUST Environmental Epigenetics Program (KEEP), Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين (X-ChIP) مقابل علامة الهستون H3K4me3 للكائن النموذجي Exaiptasia diaphana . يتم تأكيد خصوصية وفعالية الفحص من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتسلسل الجيل التالي. يتيح هذا البروتوكول زيادة التحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي في شقائق النعمان البحرية E. diaphana.

الملخص

تنظم تعديلات هيستون ما بعد الترجمة (PTMs) والتعديلات اللاجينية الأخرى إمكانية وصول الكروماتين للجينات إلى آلية النسخ ، مما يؤثر على قدرة الكائن الحي على الاستجابة للمحفزات البيئية. تم استخدام الترسيب المناعي للكروماتين إلى جانب التسلسل عالي الإنتاجية (ChIP-seq) على نطاق واسع لتحديد ورسم خرائط تفاعلات البروتين والحمض النووي في مجالات علم التخلق وتنظيم الجينات. ومع ذلك ، فإن مجال علم التخلق cnidarian يعوقه عدم وجود بروتوكولات قابلة للتطبيق ، ويرجع ذلك جزئيا إلى السمات الفريدة للكائنات الحية النموذجية مثل شقائق النعمان البحرية التكافلية Exaiptasia diaphana ، التي يعيق محتواها المائي العالي وكميات المخاط الطرق الجزيئية. هنا ، يتم تقديم إجراء ChIP متخصص ، مما يسهل التحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي في تنظيم الجينات E. diaphana . تم تحسين خطوات الربط المتقاطع واستخراج الكروماتين من أجل الترسيب المناعي الفعال ثم التحقق من صحتها عن طريق إجراء ChIP باستخدام جسم مضاد ضد علامة الهستون H3K4me3. في وقت لاحق ، تم تأكيد خصوصية وفعالية مقايسة ChIP من خلال قياس الإشغال النسبي ل H3K4me3 حول العديد من مواقع الجينات المنشطة بشكل أساسي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتسلسل الجيل التالي لتحليل النطاق على نطاق الجينوم. يسهل بروتوكول ChIP المحسن هذا لشقائق النعمان البحرية التكافلية E. diaphana التحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي المشاركة في استجابات الكائنات الحية للتغيرات البيئية التي تؤثر على cnidarians التكافلية ، مثل الشعاب المرجانية.

المقدمة

يسلط تقرير عام 2022 الصادر عن الهيئة الحكومية الدولية المعنية بتغير المناخ (IPCC) الضوء على أنه على الرغم من تزايد الوعي وجهود التخفيف ، فإن موجات الحر البحرية المتزايدة الكثافة والمتكررة تعرض الشعاب المرجانية لخطر كبير من التبييض واسع النطاق والوفيات الجماعية خلال العقود القادمة1. من أجل إبلاغ جهود الحفاظ على الشعاب المرجانية واستعادتها ، يتم التحقيق في الآثار الحالية والمتوقعة للظروف البيئية المتغيرة على الكائنات البحرية القاعية على مستويات بيولوجية متعددة لفهم الآليات الأساسية للاستجابة والقدرة على الصمود2.

ويعد توافر أدوات التحري التي تنطبق على الكائنات القاعية أمرا بالغ الأهمية لمواجهة هذا التحدي، ويتطلب تطوير هذه الأدوات جهدا نشطا لنقل المعارف والتكنولوجيات القائمة في ميادين أخرى إلى الكائنات البحرية3. يتم تخفيف العقبات التي تحول دون العمل مع العديد من الأنواع المرجانية جزئيا باستخدام أنظمة نموذجية ، مثل شقائق النعمان البحرية Exaiptasia diaphana (يشار إليها عادة باسم Aiptasia)4. من السهل نسبيا الاحتفاظ بشقائق النعمان البحرية سريعة النمو والتكافلية اختياريا في ظروف المختبر ، وتتكاثر جنسيا ولا جنسيا ، وتفتقر إلى الهيكل العظمي لكربونات الكالسيوم5. يسهل الجينوم المرجعي المفتوحالوصول 5 من E. diaphana استخدام الطرق اللاجينية التي تتطلب التسلسل. ومع ذلك ، فإن ميزات مثل المحتوى المائي العالي ، وإنتاج المخاط ، وكميات الأنسجة المنخفضة لكل فرد تشكل تحديات أمام إنشاء بروتوكولات قابلة للتكرار ، وبالتالي الحد من الأبحاث اللاجينية على E. diaphana وغيرها من cnidarians مع ميزات مماثلة.

يمكن للتعديلات اللاجينية أن تغير النمط الظاهري دون تغيير تسلسل النوكليوتيدات الجينومية للكائن الحي عن طريق تنظيم العمليات المرتبطة بالكروماتين6. يتم التحقيق في التنظيم اللاجيني Cnidarian في الغالب في سياقات التاريخ التطوري والتنمية7،8،9،10 ، إنشاء التكافل وصيانته11،12،13 ، والاستجابة للتغيرات البيئية14،15. على وجه التحديد ، لوحظت اختلافات في أنماط مثيلة الحمض النووي ، والتي تنطوي في معظم الحالات على إضافة مجموعة ميثيل إلى قاعدة السيتوزين ، استجابة للظروف البيئية المتغيرة مثلالاحترار 13 وتحمض المحيطات16. كما ثبت أن أنماط مثيلة الحمض النووي قابلة للتوريث بين الأجيال ، مما يؤكد دور علم التخلق في التأقلم المرجاني مع الضغوطات البيئية17. بالمقارنة مع مثيلة الحمض النووي ، كانت هناك دراسات قليلة نسبيا حول منظمات جينية مهمة أخرى ، مثل الحمض النووي الريبي غير المشفر11،18،19 ، أو عوامل النسخ9،10 ، أو تعديلات هيستون بعد الترجمة (PTMs) في cnidarians20. إن التحقيق في البروتينات المرتبطة بالحمض النووي يتطلب بشكل خاص لأن الطرق المتاحة تتطلب الوصول إلى جينوم مرجعي للكائن الحي للدراسة وهي مكلفة بسبب أحجام العينات الكبيرة والأجسام المضادة عالية الخصوصية اللازمة3. مع وجود مجموعة واسعة من المجموعات الكيميائية التي تشكل PTMs في بقايا هيستون محددة ، فإن فهم المناظر الطبيعية لتعديل الكروماتين في cnidarians ، خاصة في سياق الضغوط البيئية الوشيكة ، لا يزال يمثل تحديا كبيرا.

الهدف من هذا العمل هو تعزيز التحقيق في PTMs هيستون ، ومتغيرات الهستون ، والبروتينات الأخرى المرتبطة بالكروماتين في cnidarians من خلال تقديم بروتوكول الترسيب المناعي للكروماتين الأمثل (ChIP) لنموذج المرجان E. diaphana (البروتوكول الأصلي بواسطة Bodega et al.21). يمكن دمج ChIP مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتوصيف تفاعلات البروتين والحمض النووي الخاصة بالموقع أو تسلسل الجيل التالي (NGS) لرسم خريطة لهذه التفاعلات عبر الجينوم بأكمله. بشكل عام ، ترتبط البروتينات والحمض النووي بشكل عكسي بحيث يظل البروتين محل الاهتمام (POI) مرتبطا بنفس الموضع المرتبط به في الجسم الحي. في حين أن طريقة الربط المتقاطع الشائعة المستخدمة على نطاق واسع في نظام نموذج الثدييات عادة ما يتم الاحتفاظ بها لمدة 15 دقيقة أو أقل في درجة حرارة الغرفة ، فقد تم تحسين نهج الربط المتقاطع للسماح للفورمالديهايد باختراق المخاط الذي تنتجه E. diaphana بشكل أكثر فعالية. ثم يتم تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل ، وتجانسها ، وتحللها لاستخراج النوى من الخلايا. يتم تجنب فقدان المواد في هذه الخطوات باستخدام مخزن مؤقت واحد فقط للتحلل ثم الانتقال مباشرة إلى الصوتنة ، مما يؤدي إلى تفتيت الكروماتين إلى شظايا طويلة ~ 300 bp. يتم تحضين هذه الشظايا بجسم مضاد خاص ب POI وصولا إلى دقة مستوى PTM. يتم ترسيب المركب المناعي للجسم المضاد والبروتين والحمض النووي باستخدام حبات مغناطيسية ترتبط بالأجسام المضادة الأولية ، وبالتالي اختيار أجزاء الحمض النووي المرتبطة بنقاط الاهتمام فقط. بعد انعكاس الارتباط المتقاطع وتنظيف الراسب ، يمكن استخدام شرائح الحمض النووي الناتجة لبناء qPCR أو مكتبة الحمض النووي للتسلسل لتعيين الأجزاء إلى جينوم مرجعي ، وبالتالي تحديد المواقع التي يرتبط بها POI. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول اعتبارات كل خطوة في Jordán-Pla و Visa22.

البروتوكول

ويرد في الشكل 1 نظرة عامة إجرائية. تتوفر بيانات ChIP-Seq في أرشيف قراءة تسلسل NCBI (SRA) تحت رمز BioProject PRJNA931730 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA931730).

figure-protocol-1
الشكل 1: سير عمل بروتوكول ChIP. نظرة عامة على سير عمل بروتوكول ChIP، بما في ذلك المدة المقدرة لكل خطوة ونقاط التوقف الاختيارية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. جمع

  1. باستخدام ملعقة بلاستيكية ، افصل برفق 20 E. diaphana التكافلية (سلالة CC7) بقطر دواسة ~ 5 مم أو أكبر من جدران الحوض ، وقم بسحبها في أنبوب سعة 15 مل.
    ملاحظة: يوصى بتحسين عدد شقائق النعمان بناء على حجمها وعدد عناوين IP المقصودة. يمكن تجميد شقائق النعمان في النيتروجين السائل (LN2) وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل قبل بدء ChIP. خلاف ذلك ، يوصى بالمتابعة على الفور لمنع شقائق النعمان من الاستقرار على جدران الأنبوب سعة 15 مل.

2. الربط المتقاطع

  1. تحضير 10 مل من المخزن المؤقت للربط المتقاطع بنسبة 0.5٪ (الجدول 1).
  2. دع شقائق النعمان تستقر في قاع الأنبوب ، أو قم بتدويرها في جهاز طرد مركزي لبضع ثوان ، حتى ~ 3500 × جم في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة مياه البحر الزائدة باستخدام مضخة تفريغ. اغسلها في 1x DPBS عن طريق تعليقها ، ثم قم بإزالة DPBS.
  3. انقل شقائق النعمان إلى المخزن المؤقت المتقاطع بنسبة 0.5٪ باستخدام ملاقط أو ملعقة بلاستيكية لتجنب نقل المخزن المؤقت غير الضروري. احتضان على الدوار عند 12 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد 10 مل من المخزن المؤقت للربط المتقاطع بنسبة 1٪ (الجدول 1).
  5. كما في الخطوة 2.2 ، قم بإزالة المخزن المؤقت 0.5٪ ، وأعد ملء الأنبوب بالمخزن المؤقت للربط المتقاطع بنسبة 1٪. احتضان على الدوار عند 12 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: تأكد من تعليق جميع شقائق النعمان وعدم الالتصاق ببعضها البعض عن طريق قلب الأنبوب برفق.
  6. في اليوم التالي ، قم بإعداد 10 مل من مخزن التبريد من مخزون جليكاين 2 متر (الجدول 1).
  7. قم بإزالة المخزن المؤقت للربط المتقاطع بنسبة 1٪ كما في الخطوة 2.2 ، وقم بتعليق شقائق النعمان في المخزن المؤقت للتبريد لإيقاف تفاعل الربط المتقاطع. احتضان على الدوار عند 12 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
  8. قم بإزالة المخزن المؤقت للتبريد كما في الخطوة 2.2 ، واغسل شقائق النعمان مرتين في DPBS. في حالة التعامل مع عدة عينات ، احتفظ بشقائق النعمان معلقة في DPBS أثناء العمل من خلال الخطوات 3.2-3.4 عينة تلو الأخرى.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا عن طريق التجميد المفاجئ للعينة وتخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة شهر 1 على الأكثر في هذه المرحلة. قم بإزالة أي DPBS زائد عن طريق إفراغ الأنبوب على منديل ورقي قبل التجميد والتخزين.

الجدول 1: الحلول والمخازن المؤقتة المستخدمة في بروتوكول ChIP. يتم سرد المكونات وتركيزات كل منها لكل مخزن مؤقت مستخدم في البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

3. التجانس والتحلل

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل (الجدول 1) طازجا في اليوم (2 مل لكل عينة) ، وأضف كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني 100x (PIC ، انظر جدول المواد) إلى تركيز نهائي قدره 1x. قم بتنظيف ملاط البورسلين والمدقة بالإيثانول ، وابدأ في تبريد جميع الأدوات باستخدام LN2.
  2. صب DPBS ، وأفرغ شقائق النعمان على منديل ورقي لإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل. صب بعض LN2 في الهاون ، ونقل شقائق النعمان باستخدام ملاقط.
  3. باستخدام المدقة ، ابدأ بتفتيت الأنسجة بعناية ، ثم اطحن حتى تصبح العينة مسحوقا ناعما. استمر في إضافة LN2 حسب الحاجة لمنع إذابة الجليد.
  4. ضع 2 مل من محلول التحلل في أنبوب سعة 5 مل على الثلج. اجمع العينة باستخدام ملعقة، وانقلها إلى المخزن المؤقت للتحلل، مع ضمان ذوبان العينة في المخزن المؤقت. دع العينة ترتاح على الثلج لمدة 1 دقيقة ، ثم اخلطها عن طريق الانقلاب. كرر الخطوات 3.2-3.4 لجميع العينات الأخرى ، وقم بتنظيف جميع المعدات جيدا بالإيثانول بين العينات.
    ملاحظة: قلل من فقدان العينة قدر الإمكان في هذه الخطوة.
  5. اغسل مطحنة مناديل Dounce (انظر جدول المواد) بمحلول تحلل ، وانقل العينة ، واقفز 20-30 مرة بمدقة ضيقة.
  6. انقل العينة مرة أخرى إلى أنبوبها ، واغسل مطحنة الأنسجة بالإيثانول والماء المقطر ، وكرر الخطوة 3.5 لجميع العينات.
  7. احتضان العينات على المدور في ~ 14 دورة في الدقيقة و 4 °C بين عشية وضحاها.
  8. استخدم Trypan blue للتحقق من التحلل الناجح تحت المجهر (تكبير 20x) عن طريق مزجه مع 10 ميكرولتر من العينة بنسبة 1: 1. إذا اخترقت الصبغة النوى ، يكون التحلل ناجحا.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا عند هذه النقطة عن طريق تخزين العينة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.

4. سونيكيشن

  1. قم بتدوير العينة لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي عند ~ 2000 × جم لمدة 3-5 ثوان في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي سائل من الغطاء والجدران.
  2. مرر المحللة من خلال إبرة 25 جم وحقنة 1 مل 10 مرات لتفتيت أي مجاميع.
  3. ضع العينة في حمام جليدي لإبقائها باردة قدر الإمكان أثناء الصوتنة.
  4. تنظيف إبرة صوتنة مع الإيثانول. ضع العينة في جهاز الصوتنة (انظر جدول المواد) مع وضع الإبرة 1 سم فوق قاع الأنبوب وعدم لمس الجدران.
  5. اضبط دورة العمل على 50٪ والإخراج على 0. ابدأ تشغيل جهاز الصوتنة ، وتأكد من عدم إنتاج رغوة في العينة (وإلا ، أوقف موضع الإبرة وأعد ضبطه). قم بزيادة طاقة الإخراج ببطء إلى 2 ، ثم صوتنة لمدة دقيقتين.
  6. قم بإيقاف تشغيل جهاز الصوتنة ، واضبط طاقة الإخراج مرة أخرى على 0 ، واترك العينة ترتاح وتبرد لمدة 2 دقيقة.
  7. كرر الخطوات 4.5-4.6 لما مجموعه أربع مجموعات صوتنة وتهدئة لكل عينة. قم بإزالة العينة وتخزينها على الثلج ثم كررها مع عينات أخرى. تنظيف إبرة صوتي مع الإيثانول بين العينات وفي النهاية.
    ملاحظة: قد تحتاج شدة الصوتنة ورقم الدورة إلى التحسين للوصول إلى أدنى كثافة صوتنة مع إنتاج شظايا بحجم 150-500 نقطة أساس.

5. استخراج الحمض النووي وفحص حجم الشظية

ملاحظة: قبل الانتقال إلى IP ، يجب التحقق من حجم الأجزاء. إذا كانت الشظايا كبيرة جدا (>500 نقطة أساس) ، فيجب زيادة عدد دورات الصوتنة و / أو شدة الصوتنة ؛ إذا كانت صغيرة جدا (<150 نقطة أساس) ، فيجب تقليل وقت الصوتنة و / أو شدتها.

  1. احتفظ بالعينة على الجليد أثناء إجراء فحص حجم الجزء على مجموعة فرعية من العينة. انقل مجموعة فرعية سعة 100 ميكرولتر إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
  2. أضف 8 ميكرولتر من كوكتيل RNase (انظر جدول المواد) ، واحتضن عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أثناء الرج عند 700 دورة في الدقيقة.
  3. أضف 2 ميكرولتر من البروتيناز K (انظر جدول المواد). واحتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة بينما تهتز عند 700 دورة في الدقيقة.
  4. قم بالربط العكسي للعينة عن طريق احتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أثناء الاهتزاز عند 700 دورة في الدقيقة.
  5. قم بإعداد جل أغاروز 1٪ مع 1x TAE buffer و 0.01٪ بروميد إيثيديوم (انظر جدول المواد) أو صبغة جل بديلة.
  6. استخرج الحمض النووي من العينة باستخدام مجموعة تنقية باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  7. للتحقق من حجم تجزئة الحمض النووي المستخرج ، قم بتحميل هلام الأغاروز بسلم وعينة. امزج 4 ميكرولتر من سلم 1 كيلو بايت مع 1 ميكرولتر من صبغة التحميل الأرجواني 6x ، وضعها في بئر واحدة من هلام الأغاروز. امزج 20 ميكرولتر من الحمض النووي مع 4 ميكرولتر من صبغة التحميل الأرجواني 6x للحصول على تركيز نهائي قدره 1x ، وماصة في بئر. كرر لجميع العينات.
  8. قم بتشغيل الجل على 100 فولت لمدة 30 دقيقة تقريبا ، ثم قم بتصوير الجل عن طريق تحميله على صينية ، ووضعه في نظام التصوير الهلامي ، واتباع تعليمات برنامج النظام المعني (انظر جدول المواد). قرر ما إذا كنت تريد المضي قدما بناء على أحجام التجزئة ، والتي يجب أن تتراوح بين 150-500 نقطة أساس في المتوسط (الشكل 2).

figure-protocol-2
الشكل 2: فحص حجم الشظية. بعد الصوتنة ، يتم فك ارتباط مجموعة فرعية من العينة وتنقيتها وتشغيلها على هلام أغاروز للتأكد من أن الكروماتين قد تم قصه إلى أحجام تجزئة تتراوح بين 150-500 نقطة أساس. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. الترسيب المناعي (IP)

  1. باستخدام ماصة ، تحقق من حجم العينة الرئيسية التي تم الاحتفاظ بها على الجليد أثناء استخراج الحمض النووي. أضف 10٪ Triton X-100 إلى تركيز نهائي قدره 1٪.
  2. أدر العينة عند 20000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف باستخدام ماصة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا عن طريق تجميد العينة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر. يجب تعديل تفاصيل خطوات الملكية الفكرية التالية وتحسينها لكل تجربة. قد تحتاج إلى تحسين كمية الأجسام المضادة لكل IP.
  3. باستخدام مخزن التحلل كفراغ ، قم بقياس تركيز الكروماتين باتباع تعليمات نظام قياس تركيز الحمض النووي المتاح (انظر جدول المواد).
  4. اعتمادا على حجم العينة وعدد عناوين IP المخطط لها ، قم بزيادة الحجم الإجمالي للعينة عن طريق إضافة 10٪ Triton X-100 و 100x PIC (انظر جدول المواد) إلى التركيزات النهائية بنسبة 1٪ و 1x ، على التوالي. يوصى باستخدام 100 ميكروغرام من الكروماتين بحجم إجمالي يبلغ 1000 ميكرولتر.
  5. قم بتوزيع وحدة التخزين لكل IP في أنبوب منفصل منخفض الاحتفاظ سعة 1.5 مل (انظر جدول المواد). بالنسبة إلى ChIP-qPCR ، ضع الحجم المكافئ للعينة في أنبوب آخر سعة 1.5 مل كعنصر تحكم وهمي. خذ 10٪ من حجم عناوين IP كعنصر تحكم في الإدخال ، وقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  6. أضف 4 ميكروغرام من الأجسام المضادة (هنا ، الجسم المضاد H3K4me3 ، انظر جدول المواد) إلى كل IP المعني. لا تضيف شيئا إلى المحاكاة الوهمية. احتضان تفاعلات IP والوهمية على دوار الأنبوب عند 12 دورة في الدقيقة وعند 4 درجات مئوية طوال الليل.

7. استعادة المجمعات المناعية مع الخرز المغناطيسي

ملاحظة: تجنب دائما تجفيف الخرز المغناطيسي ؛ احتفظ بها مغطاة بالسائل ، أو قم بتجديد المحاليل في أسرع وقت ممكن. اعمل دائما على عينة واحدة تلو الأخرى.

  1. اقلب الخرزات المغناطيسية برفق (انظر جدول المواد) للخلط.
  2. تحضير 10 مل من محلول الحجب (الجدول 1) طازجا في اليوم ، وتخلط بلطف.
  3. اقطع طرف طرف الماصة لزيادة القطر ، وانقل 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى أنابيب منفصلة (أنبوب واحد لكل IP وواحد للوهمية).
  4. أضف 1 مل من محلول الحجب إلى كل أنبوب ، واحتضانها على دوار عند 12 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. ضع الخرزات في محلول الحجب على رف مغناطيسي ، وانتظر الفصل. وفي الوقت نفسه ، قم بتدوير تفاعلات IP عند 2000 × جم لمدة 3-5 ثوان في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي بقايا من الجدران.
  6. باستخدام ماصة ، قم بإزالة وتجاهل طافي محلول الحجب ، ثم اغسل الخرز من الحائط بإحدى العينات أو الوهمية. ضع المزيج مرة أخرى في الأنبوب منخفض الاحتفاظ المعني ، ثم انتقل إلى العينة التالية.
  7. احتضان جميع الأنابيب على الدوار عند 12 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات.

8. الغسيل والشطف وانعكاس الارتباط المتقاطع

  1. تحضير مخازن الغسيل ومخزن الملح TE (الجدول 1) أثناء حضانة الانتعاش المناعي.
  2. بعد الحضانة ، ضع عناوين IP ووهمها على الرف المغناطيسي ، وانتظر حوالي 10-20 ثانية حتى ينفصل المغناطيس.
  3. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 1 مل من محلول الغسيل مع ملح منخفض. كرر مع جميع ردود الفعل ، ثم قم بإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي وتخلط حتى يتم تعليق الخرز.
  4. احتضان على الدوار عند 12 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي ، وقم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل بملح منخفض ، ثم أضف 1 مل من محلول الغسيل مع الملح العالي ، واحتضانه كما في الخطوة 8.4.
  6. كرر الخطوات 8.3-8.5 مرة أخرى لما مجموعه أربع غسلات باستخدام ملح منخفض وعالي بالتناوب.
    ملاحظة: المخزن المؤقت للغسيل الذي يحتوي على ملح عال شديد القسوة ويجب استخدامه لمدة 5 دقائق فقط في كل خطوة غسيل.
  7. قم بإزالة وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، واغسلها ب 1 مل من محلول الملح TE ؛ كرر مرة أخرى. بعد الغسيل الثاني ، اغسل أي خرز من غطاء الأنبوب.
  8. اصنع المخزن المؤقت للشطف (الجدول 1) أثناء الغسيل. بعد التخلص من الغسيل العازل الثاني لملح TE ، أضف 210 ميكرولتر من محلول الشطف إلى كل تفاعل.
  9. الخرزات المغناطيسية ، وقم بإزالتها عند 65 درجة مئوية ، ورجها عند 700 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
  10. ضع التفاعلات على الرف المغناطيسي ، واجمع الشطف ، وضعه في أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
  11. كرر عملية الشطف مع 210 ميكرولتر أخرى من محلول الشطف ، وأضف الشطف إلى الدفعة الأولى لحجم نهائي يبلغ 420 ميكرولتر من elute لكل IP ووهمية.
  12. قم بإزالة المدخلات من الفريزر ، وأضف المخزن المؤقت للشطف إلى حجم إجمالي يبلغ 420 ميكرولتر.
  13. قم بالربط المتقاطع العكسي لجميع الشطف والمدخلات عن طريق احتضانها عند 65 درجة مئوية و 700 دورة في الدقيقة طوال الليل.

9. هضم البروتين والحمض النووي الريبي وتنقية الحمض النووي

  1. قم بتخفيف تركيز SDS (انظر جدول المواد) إلى 0.5٪ عن طريق إضافة 420 ميكرولتر من محلول الملح TE إلى الشطف والمدخلات.
  2. لهضم الحمض النووي الريبي ، أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل RNase (انظر جدول المواد) ، واحتضانه عند 42 درجة مئوية عند 700 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
  3. لهضم البروتين ، أضف 8 ميكرولتر من البروتيناز K (انظر جدول المواد) للجميع ، واحتضان عند 55 درجة مئوية عند 700 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
  4. لتنقية الحمض النووي ، اتبع "Ren Lab ENCODE تثبيت الأنسجة وبروتوكول Sonication ل MicroChIP"23 مع بعض التعديلات:
    1. قم بإعداد الأنابيب باستخدام جل قفل الطور (انظر جدول المواد) عن طريق تدوير الجل لأسفل إلى قاع الأنبوب عند 20000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. تحت غطاء الدخان ، أضف عينة واحدة ونفس الحجم من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (25:24: 1) إلى كل أنبوب. هز الأنابيب بقوة ، ودوامة لهم لفترة وجيزة حتى تشكل طبقة بيضاء رغوية.
      تنبيه: الخليط سام وتآكل ويشكل خطرا على الصحة.
    3. تدور لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية و 20000 × جم. تأكد من أن المرحلة المائية واضحة.
    4. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد باستخدام ماصة. مطلوب أنبوبان جديدان لكل عينة اعتمادا على حجم العينة المحتمل. في هذه الحالة، انقل نصف العينة من الأنبوب الأول إلى الأنبوب الثاني.
    5. أضف 1/10 من الحجم في 3 M أسيتات الصوديوم (NaAc ، على سبيل المثال ، 40 ميكرولتر لعينة 400 ميكرولتر) و 10 ميكرولتر من مادة الأكريلاميد الخطية 5 مجم / مل لكل عينة ، واقلبها للخلط.
    6. أضف 2x حجم العينة في 100٪ إيثانول (على سبيل المثال ، 800 ميكرولتر لعينة 400 ميكرولتر) ، ورجها بقوة. لا دوامة ، لأن هذا قد يضر الحمض النووي.
    7. احتضان في -20 درجة مئوية طوال الليل أو في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    8. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية ، ثم قم بتدوير العينات لمدة 30 دقيقة عند 15000 × جم لتكوير الحمض النووي.
    9. صب بعناية ثم اغسل الكريات ب 1 مل من 70٪ EtOH. تدور بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    10. صب بعناية ، ثم تدور مرة أخرى لبضع ثوان. استخدم ماصة لإزالة كل الإيثانول. إذا كان هناك القليل المتبقي ، فقد يساعد ذلك في الدوران مرة أخرى.
    11. أعد تعليق الكريات في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: إذا كان هناك عدة أنابيب لكل عينة ، فأعد تعليق حبيبات واحدة في 30 ميكرولتر ، وانقلها إلى الأنبوب التالي ، وأعد تعليق الحبيبات التالية في نفس 30 ميكرولتر.
  5. قم بقياس تركيز الحمض النووي ، ثم قم بتخزين العينة عند -20 درجة مئوية.

النتائج

باتباع البروتوكول أعلاه ، تم ترسيب الحمض النووي المرتبط بثلاثي ميثيل الهستون 3 ليسين 4 (H3K4me3). تم استخدام الجسم المضاد من الدرجة ChIP-seq سابقا في شقائق النعمان البحرية Nematostella vectensis7 وتم التحقق من صحته هنا من خلال التلوين المناعي لأقسام أنسجة E. diaphana (الشكل 3). في حين أن إنتاج الحمض النووي يعتمد على كمية المواد المدخلة ، إلا أنه كان بانتظام حوالي 100 نانوغرام / ميكرولتر. تم تحليل شظايا الحمض النووي التي تم الحصول عليها عن طريق التسلسل و qPCR (قائمة التمهيدي في الملف التكميلي 1).

عمق تسلسل 40 مليون قراءة أسفرت عن ~ 17.6 مليون قراءة تم تعيينها بشكل فريد. بعد فحوصات الجودة ، تم قطع القراءات الخام وتعيينها إلى جينوم E. diaphana باستخدام Bowtie24 (انظر جدول المواد). حدد التحليل القائم على النموذج لبيانات ChIP-Seq باستخدام MACS (انظر جدول المواد) ما مجموعه 19,107 ذروة25. كما هو متوقع ل H3K4me3 ، كانت معظم القمم تقع بالقرب من موقع بدء النسخ (TSS) ، وانخفض تردد عدد الذروة بشكل حاد على جانبي TSS ، ولكن بشكل خاص نحو جسم الجين (الشكل 4).

تم تحديد ثلاثة جينات ذات قمم عالية حول TSSs الخاصة بهم من بيانات التسلسل ، وتم تصميم بادئات qPCR لاستهداف عدة مواقع من القمم العالية داخل هذه الجينات. تمت تسوية بيانات qPCR باستخدام النسبة المئوية لطريقة الإدخال (الشكل 5). لوحظ إثراء عالي ل H3K4me3 بالنسبة إلى عناصر التحكم في الإدخال والوهم. تراوحت النسبة المئوية للمدخلات بين 2.7٪ و 10.7٪ ، مع ملاحظة اختلافات في التخصيب عبر الجينات وبين المواقع المختلفة داخل نفس الجين.

figure-results-1
الشكل 3: تلطيخ الفلورسنت المناعي ل H3K4me3. تم تلطيخ قسم نسيج E. diaphana ب (A) صبغة حمض نووي Hoechst زرقاء و (B) جسم مضاد ثانوي أصفر يحمل علامة الفلوروفور ضد الجسم المضاد الأساسي ضد H3K4me3. (ج) تداخل بين A وB يوضح التموضع المشترك في النواة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 4: تردد عدد الذروة المرتفع حول موقع بدء النسخ. توزيع تردد عدد الذروة لتعديل H3K4me3 الذي يمتد من المنبع (-) والمصب (+) 2000 بت حول موقع بدء النسخ (TSS). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 5: H3K4me3 ChIP-qPCR في ديافانا Exaiptasia. يتم تمثيل النتائج كنسبة مئوية (٪) من المدخلات. تم اختيار المواقع بالقرب من موقع بدء النسخ للجينات المعنية (AIPGENE12312 و AIPGENE26042 و AIPGENE5950) ل ChIP-qPCR. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري بين النسخ المتماثلة ، n = 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: قائمة الاشعال المستخدمة في qPCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

باتباع البروتوكول أعلاه ، تم استخدام الحمض النووي الذي تم الحصول عليه بنجاح ل ChIP-qPCR و ChIP-Seq. تم الحصول على نفس ملف تعريف الذروة العام ل H3K4me3 الذي تم الإبلاغ عنه سابقا من الكائنات الحيةالأخرى 26،27،28 هنا ، مع أعلى قمة حول TSS وتخصيب عالي في المواقع المتوقعة في ChIP-qPCR. قد يكون العدد الكبير نسبيا من القراءات المعينة المضاعفة في بيانات ChIP-Seq ناتجا عن تكرارات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن زيادة مقدار القراءات المعينة بشكل فريد عن طريق التغييرات في بروتوكول إعداد مكتبة الحمض النووي لتقليل تكرارات تفاعل البوليميراز المتسلسل. هناك العديد من طرق التطبيع لبيانات ChIP-qPCR ، مع استخدام النسبة المئوية لطريقة الإدخال المعروضة هنا بشكل أكثر شيوعا. تعمل هذه الطريقة على تطبيع IP والعينات الوهمية مباشرة إلى الإدخال ، مع عيب أن الإدخال تتم معالجته بشكل مختلف عن IP وعينات وهمية أثناء ChIP ، مما قد يؤدي إلى حدوث أخطاء. تعمل طريقة إثراء الطي البديلة على تطبيع إشارة IP بناء على إشارة الوهمية باستخدام نفس مجموعات التمهيدي ، مما يعطي نسبة إشارة عبر الخلفية. ومع ذلك ، يمكن أن تختلف شدة إشارة العينة الوهمية بشدة ، والتي بدورها لها تأثيرات كبيرة على البيانات. يمكن العثور على مناقشة مفصلة حول ChIP-qPCR وتطبيع البيانات في Haring et al.29.

التعديل الرئيسي في الطريقة المعروضة أعلاه مقارنة ببروتوكولات ChIP الشائعة هو وقت الربط المتقاطع الأطول بكثير ، من حوالي 15 دقيقة لبروتينات هيستون إلى حضانة بين عشية وضحاها. الهدف الرئيسي من هذا التعديل هو تسهيل تغلغل الفورمالديهايد المثبت من خلال طبقة المخاط في الأنسجة العميقة ل E. diaphana للحفاظ على تفاعلات البروتين والحمض النووي داخل النواة. يعد تحسين هذه الخطوة أمرا بالغ الأهمية لضمان الربط المتقاطع الكافي للحفاظ على تفاعلات البروتين والحمض النووي دون الربط المتقاطع لدرجة أن قص الكروماتين عن طريق الصوتنة يصبح غير فعال. إضافة المنظفات مثل SDS يمكن أن تزيد من كفاءة صوتنة كذلك29. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على حضانة طويلة مع الفورمالديهايد لتسهيل خطوة التجانس وأسفرت عن عينة أرضية أكثر دقة وتوازنا مقارنة بشقائق النعمان الطازجة أو المجمدة التي تم تجانسها قبل خطوة الربط المتقاطع. تتراوح النطاقات الموصى بها لأطوال الشظايا بين 100 نقطة أساس و 1000 نقطة أساس29,30 وقد تعتمد على البروتين المستهدف. من الأهمية بمكان أن يقوم كل مستخدم بتحسين ظروف الصوتنة للوصول إلى طول الجزء المطلوب بأقل قدر ممكن من قوة الصوتنة ، لأن الإفراط في الصوتنة قد يفسد البروتينات ، وبالتالي يؤثر على IP31. ومن القيود الأخرى على ChIP كمية المواد المطلوبة، التي تؤثر بشكل خاص على الكائنات الصغيرة نسبيا مثل شقائق النعمان؛ تمت معالجة هذه المشكلة عن طريق تقليل فقدان العينة بين الخطوات. بعد تجانس العينة ، تم تحليلها على الفور ، وبالتالي حذف العديد من خطوات تحضير النوى الشائعة. احتوت مجموعة العينات التي تم الحصول عليها من 20 شقائق النعمان بشكل عام على ما يكفي من الكروماتين لثلاثة عناوين IP وعناصر تحكم وهمية وإدخال. يمكن تقليل كمية المواد الأولية (أي عدد شقائق النعمان) في المستقبل ، خاصة عند إجراء ChIP مع بروتين مستهدف واحد فقط. اعتمادا على طريقة المصب المقصودة ، يجب تعديل الضوابط ؛ بالنسبة إلى ChIP-qPCR ، يجب اعتباره يتضمن عناصر تحكم إضافية29 ، بينما بالنسبة ل ChIP-seq ، يمكن حذف الوهمية لصالح عنصر تحكم الإدخال.

في حين أن التحقق من صحة الأجسام المضادة خارج نطاق هذا البروتوكول ، وبالتالي ، تم التطرق إليه لفترة وجيزة فقط هنا ، إلا أنه خطوة حاسمة قبل إجراء ChIP. خاصة عند استخدام الأجسام المضادة التجارية على أنواع اللافقاريات ، يمكن أن يكون توافر أجسام مضادة محددة للأهداف المرجوة قيدا. في الخطوة الأولى ، تمت مقارنة تسلسل ذيل H3 N-terminal ل E. diaphana والكائنات النموذجية الأخرى ، بما في ذلك الزرد والفئران ، ووجد أنه محفوظ للغاية12. ثم تم اختبار خصوصية الجسم المضاد باستخدام التألق المناعي ، الذي شارك في تحديد إشارات الحمض النووي والجسم المضاد. يعطي ملف تعريف الذروة ل H3K4me3 حول TSS الذي تم الحصول عليه من بيانات التسلسل مزيدا من الثقة فيما يتعلق بخصوصية الجسم المضاد.

هناك اعتبار آخر فيما يتعلق بخصوصية الأجسام المضادة وهو إمكانية حدوث أي تفاعل مع الدينوفلاجيلات التكافلية التي تستضيفها E. diaphana ، بالإضافة إلى العديد من الأنثوزوان الأخرى ، في خلاياها. وجدت تحليلات Transcriptome في dinoflagellates من أجناس Lingulodinium32 و Symbiodinium33 جينات ترميز الهستون ، بما في ذلك هيستون H3 الأساسي والعديد من متغيرات H3 عند مستويات تعبير منخفضة ، ومدى الحفظ الوظيفي لشفرة هيستون غير واضح34. قارن مارينوف ولينش34 حفظ تسلسل ذيول N-terminal المتغيرة H3 داخل وبين أنواع الدينوفلاجيلات ، وأظهرت أنواع Symbiodiniaceae اختلافا كبيرا حول ليسين 4 في تسلسل الذيل ، خاصة عند النظر في تطابق الأحماض الأمينية المجاورة مع ليسين 4 كعامل. كما تبين أن هذه المنطقة تختلف عن الأنواع النموذجية الأخرى مثل Arabidopsis thaliana و Drosophila melanogaster و Saccharomyces cerevisiae ، والتي تتطابق مع تسلسل E. diaphana12. لذلك ، فإن خطر التفاعل غير المقصود للجسم المضاد ضد H3K4me3 مع دينوفلاجيلات H3 منخفض. بالإضافة إلى ذلك ، يتم محاذاة التسلسلات فقط مع جينوم E. diaphana ، ويجب أن تكون بادئات qPCR خاصة بتسلسلات E. diaphana ، مما يوفر طبقة إضافية من الترشيح لأي تسلسلات مترسبة عن غير قصد.

ينتج بروتوكول ChIP المقدم حمضا نوويا كافيا ل qPCR بالإضافة إلى تسلسل الجيل التالي ، وبينما من المحتمل أن يكون التحسين الفردي من قبل كل مستخدم مطلوبا ، فإنه يوفر نقطة انطلاق لزيادة التحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي في cnidarians القاعية ، ربما في سياق التكافل والتغيرات البيئية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلمالحمض النووي Invitrogen10787018
100٪ إيثانول
15 مل أنابيب
16٪ محلول الفورمالديهايد (وزن / حجم) ، خال من الميثانولحراري علمي28906
5 مل أنبوب
5PRIME أنابيب قفل المرحلةQuantabio2302820قفل المرحلة جل - إبرة AGANI الخفيفة
25 جرامTerumoAN * 2516R1
Agarose
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7030
Bowtieمفتوح المصدر ، متاح من https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
Branson sonifier 250BransonSonicator   ؛
أجهزة الطرد المركزي Eppendorf5430 Rمع دوارات لأنابيب 15 مل و 1.5 مل
أجسام مضادة من الدرجة ChIP (هنا الجسم المضاد H3K4me3 متعدد النسيلة )DiagenodeC15410003
كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTARoche118735800012 قرص / مل ماء ل 100x مخزون
غطاء زجاجيvwr48393 194
ملعقة يمكن التخلصمنها vwr80081-188
طقم تنقية الحمض النووي (هنا طقم تنقية QIAGEN QIAquick PCR)QIAGEN28104
طاحونة الأنسجة Dounceمدقة ويتونالضيقة
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) 1xgibco14190-094
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific10004D
EDTASigma-Aldrich3609
الرحلان
EGTASigma-Aldrich324626
Ethidium bromide
FASTQC v0.11.9
برنامج Gel Doc EZ نظام التوثيقBio-Rad1708270Gel
Gel GlycineSigma-Aldrich50046
حقنة Injekt-F Tuberculin 1 ملB. Braun9166017V
أكريلاميد خطي (5 مجم / مل)InvitrogenAM9520
منخفض الاحتفاظ 1.5 مل
رف فصللأنابيب
مجهر
التحليل القائم على النموذج ل ChIP-Seq (MACS)
الملاط والمدقة مفتوحة المصدر ، الخزف
NanoDrop 2000c مقياس الطيفالضوئي الحراري العلمي   ؛ND-2000C
N-lauroylsarcosineSigma-Aldrich61739
ماصة
باستور خالية من النوكلياز
الفينول: الكلوروفورم: خليط كحول الأيزواميل (25: 24: 1)سيجما ألدريتش77617
بروتيناز K (20 مجم / مل)AmbionAM2546
تحميل أرجوانية 6xنيو إنجلاند BioLabsB7024S
Qubit 2.0 مقياس الفلورInvitrogen
RNase مزيج إنزيم كوكتيلInvitrogenAM2286RNase A = 500 وحدة / مل ، RNase T1 = 20000 وحدة / مل
أسيتات الصوديومسيجما ألدريتشS2889
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشS9888
ديوكسي كولات الصوديومسيجما ألدريتش30970
SYBR آمن الحمض النووي جل وصمة عارInvitrogenS33102
TAE عازلة
خلاط حراريEppendorf5384000012
قاعدة تريسSigma-Aldrich10708976001
Triton X-100 محلولSigma-Aldrich93443
Trypan Blue Stain (0.4٪)Gibco15250-061خطر: قد يسبب السرطان. يشتبه في إتلاف الخصوبة أو الطفل الذي لم يولد
بعد أنبوب دوار SB3ستيوارت
UltraPure SDS ، مضخة
الصقر نظام الكهربائي أنبوب مغناطيسي 1.5 مل شريحة صبغة تفريغ Invitrogen 15553027 10٪

المراجع

  1. Pörtner, H. -O. 2022: Summary for Policymakers. Climate Change 2022: Impacts, Adaptation, and Vulnerability. Contribution of Working Group II to the Sixth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2022).
  2. Cziesielski, M. J., Schmidt-Roach, S., Aranda, M. The past, present, and future of coral heat stress studies. Ecology and Evolution. 9 (17), 10055-10066 (2019).
  3. Eirin-Lopez, J., Putnam, H. Marine environmental epigenetics. Annual Review of Marine Science. 11, 335-368 (2021).
  4. Rädecker, N. Using Aiptasia as a model to study metabolic interactions in cnidarian-Symbiodinium symbioses. Frontiers in Physiology. 9 (214), (2018).
  5. Baumgarten, S. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. PNAS. 112 (38), 11893-11898 (2015).
  6. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  7. Schwaiger, M. Evolutionary conservation of the eumetazoan gene regulatory landscape. Genome Research. 24 (4), 639-650 (2014).
  8. Zhang, X., Jacobs, D. A broad survey of gene body and repeat methylation in cnidaria reveals a complex evolutionary history. Genome Biology and Evolution. 14 (2), evab284(2022).
  9. Schwaiger, M. An ancestral Wnt-Brachyury feedback loop in axial patterning and recruitment of mesoderm-determining target genes. Nature Ecology & Evolution. 6 (12), 1921-1939 (2022).
  10. Ozment, E., et al. Cnidarian hair cell development illuminates an ancient role for the class IV POU transcription factor in defining mechanoreceptor identity. Elife. 10, e74336(2021).
  11. Baumgarten, S., et al. Evidence for miRNA-mediated modulation of the host transcriptome in cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Molecular Ecology. 27 (2), 403-418 (2018).
  12. Li, Y. DNA methylation regulates transcriptional homeostasis of algal endosymbiosis in the coral model Aiptasia. Science Advances. 4 (8), eaat2142(2018).
  13. Rodriguez-Casariego, J. A., Cunning, R., Baker, A. C., Eirin-Lopez, J. M. Symbiont shuffling induces differential DNA methylation responses to thermal stress in the coral Montastraea cavernosa. Molecular Ecology. 31 (2), 588-602 (2021).
  14. Putnam, H. M., Davidson, J. M., Gates, R. D. Ocean acidification influences host DNA methylation and phenotypic plasticity in environmentally susceptible corals. Evolutionary Applications. 9 (9), 1165-1178 (2016).
  15. Weizman, E., Levy, O. The role of chromatin dynamics under global warming response in the symbiotic coral model Aiptasia. Communications Biology. 2, 282(2019).
  16. Liew, Y. J. Epigenome-associated phenotypic acclimatization to ocean acidification in a reef-building coral. Science Advances. 4 (6), eaar8028(2018).
  17. Liew, Y. J. Intergenerational epigenetic inheritance in reef-building corals. Nature Climate Change. 10 (3), 254-259 (2020).
  18. Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), e91101(2014).
  19. Huang, C., et al. Identification of long non-coding RNAs in two anthozoan species and their possible implications for coral bleaching. Scientific Reports. 7, 5333(2017).
  20. Rodriguez-Casariego, J. A., et al. Coral epigenetic responses to nutrient stress: Histone H2A.X phosphorylation dynamics and DNA methylation in the staghorn coral Acropora cervicornis. Ecology and Evolution. 8 (23), 12193-12207 (2018).
  21. Bodega, B., et al. A cytosolic Ezh1 isoform modulates a PRC2-Ezh1 epigenetic adaptive response in postmitotic cells. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 444-452 (2017).
  22. Jordán-Pla, A., Visa, N. Considerations on experimental design and data analysis of chromatin immunoprecipitation experiments. Chromatin Immunoprecipitation., edited by Visa, N., Jordán-Pla, A. Visa, N., Jordán-Pla, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 9-28 (2017).
  23. ENCODE. Ren Lab ENCODE Tissue Fixation and Sonication Protocol for MicroChIP. , Stanford University. Available from: https://www.encodeproject.org/documents/ (2023).
  24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, R25(2009).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nature Protocols. 7, 1728-1740 (2012).
  26. Howe, F. S., Fischl, H., Murray, S. C., Mellor, J. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. BioEssays. 39 (1), e201600095(2017).
  27. Zhang, Z., Shi, L., Dawany, N., Kelsen, J., Petri, M. A., Sullivan, K. E. H3K4 tri-methylation breadth at transcription start sites impacts the transcriptome of systemic lupus erythematosus. Clinical Epigenetics. 8, 14(2016).
  28. Li, X. High-resolution mapping of epigenetic modifications of the rice genome uncovers interplay between DNA methylation, histone methylation, and gene expression. The Plant Cell. 20, 2-276 (2008).
  29. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2014).
  30. Landt, S. G. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  31. Raha, D., Hong, M., Snyder, M. ChIP-Seq: A method for global identification of regulatory elements in the genome. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, Unit 21.19.1-Unit 21.19.14 (2010).
  32. Roy, S., Morse, D. A full suite of histone and histone modifying genes are transcribed in the dinoflagellate Lingulodinium. PLoS One. 7 (4), e34340(2012).
  33. Bayer, T., et al. Symbiodinium transcriptomes: Genome insights into the dinoflagellate symbionts of reef-building corals. PLoS One. 7 (4), e35269(2012).
  34. Marinov, G. K., Lynch, M. Diversity and divergence of dinoflagellate histone proteins. G3 Genes, Genomes, Genetics. 6 (2), 397-422 (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP-Seq)علم الوراثة فوق الجينية في اللاسعاتتعديلات الهيستونالتفاعلات بين البروتين والحمض النووي (DNA)ثلاثي ميثيل H3K4تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)استخلاص الكروماتينالتلوين المناعي الفلوري
الترسيب المناعي للكروماتين في نظام نموذج Cnidarian Exaiptasia diaphana
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.