مقالة منهجية

دراسة مثيلة البروتين الأرجينين: الأساليب والأساليب

DOI:

10.3791/64821

⸱

يناير 20, 2023

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقالات التي تمت مناقشتها: < p class = "jove_content" >Hutchinson، A.، Seitova، A. إنتاج بروتينات PRMT المؤتلفة باستخدام نظام ناقل التعبير عن فيروس Baculo. مجلة التجارب المتصورة. (173) ، DOI: 10.3791 / 62510 (2021). < p class = "jove_content" >Maniaci ، M. ، Marini ، F. ، Massignani ، E. ، Bonaldi ، T. نهج البروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي لتحليل R-Methylation للبروتين العالمي وعالي الثقة. مجلة التجارب المتصورة. (182) ، doi: 10.3791 / 62409 (2022). < p class = "jove_content" > Habisch ، H. ، Zhang ، F. ، Zhou ، Q. ، Madl ، T. استكشاف ميثيل الأرجينين عن طريق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. مجلة التجارب المتصورة. (178) ، DOI: 10.3791 / 63245 (2021). < p class = "jove_content" >Szewczyk ، M. M. ، Vu ، V. ، Barsyte-Lovejoy ، D. طرق كمية لدراسة نشاط بروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز 1-9 في الخلايا. مجلة التجارب المتصورة. (174) ، DOI: 10.3791 / 62418 (2021). < p class = "jove_content" >Poulard ، C. ، Jacquemetton ، J. ، Valantin ، J. ، Treilleux ، I. ، Le Romancer ، M. يسمح اختبار ربط القرب بالكشف عن مثيلة البروتين الأرجينين وتوطينها وقياسها في الأنسجة الثابتة. مجلة التجارب المتصورة. (185) ، DOI: 10.3791 / 64294 (2022).

افتتاحية

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مثيلة البروتين أرجينين هي تعديل ما بعد الترجمة يشارك في تنظيم مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية1،2،3. يمكن للأعضاء التسعة من عائلة بروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMTs) ميثيلين الأرجينين بطريقة متناظرة أو غير متماثلة أحادي ميثيل وثنائي ميثيل. أدى فهم العواقب الوظيفية وفهرسة الركائز الميثيلية ل PRMTs إلى تطوير فهم إنزيمات PRMT بشكل كبير وتسهيل ارتباطها بالمرض2. بالإضافة إلى ذلك ، مكن تطوير مثبطات قوية وانتقائية من اتباع مناهج قائمة على البيولوجيا الكيميائية لدراسة PRMTs وتسريع التطوير السريري لعوامل استهداف PRMT3. مع تقدم مجال PRMTs ، ستمكن الأساليب الجديدة وتطبيقاتها من توضيح تنظيم وبيولوجيا هذه الإنزيمات.

في مجموعة الطرق هذه ، تقدم مقالة عن الإنتاج المؤتلف لبروتينات PRMT وصفا مفصلا لنظام التعبير القائم على الفيروس العصي4. يمكن إنشاء العديد من PRMTs باستخدام التعبير البكتيري. ومع ذلك ، فإن PRMTs المعتمدة الأكبر أو المعقدة مثل PRMT7 أو PRMT5 تتطلب نظام تعبير الخلايا الحشرية. وقد استفادت هذه الطريقة بالفعل من العديد من الجهود المبذولة في المختبر لتحديد ركائز PRMTs.

تتطلب دراسة ركائز PRMT في البيئة الخلوية مناهج كشف متطورة. تقدم مقالتان في هذه المجموعة منهجيات متميزة تعتمد على إثراء الأجسام المضادة للأرجينين الميثيله متبوعا بقياس الطيف الكتلي أو القياس الكمي المستقل عن الأجسام المضادة باستخدام الرنين المغناطيسي النووي (NMR). تم تطوير العديد من الأجسام المضادة التي تتعرف على حالات المثيلة المميزة وتم استخدامها في الدراسات التي تحدد ركائز PRMT5. تتيح طريقة قياس الطيف الكتلي التقييم الكمي لمثيلة البروتين الخلوي الأرجينين من خلال استخدام وضع العلامات الأيضية ، وتقنيات الفصل المتطورة اللاحقة ، والتخصيب القائم على الأجسام المضادة6. يفضل العديد من أفراد عائلة PRMT ميثيلة الأرجينين الموجودة في أشكال RGG المتكررة الموجودة في المناطق المضطربة جوهريا من البروتينات7. تتيح الطريقة القائمة على التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي تحديد حالة المثيلة وموضع جميع مشتقات الأرجينين (أحادية وثنائية ، متماثلة وغير متماثلة) حيث يمكن قياسها كميا بشكل موثوق ضمن العينات البيولوجية المعقدة8.

أخيرا ، لتحديد بقايا الأرجينين الميثيلية في بروتينات معينة ، توفر مقالتان طرقا تعتمد على النشاف الغربي ومقايسة ربط القرب (PLA). تستخدم كلتا الطريقتين الكشف القائم على الأجسام المضادة ولكنهما تختلفان في طريقة الكشف والمعلومات المقدمة. طريقة اللطخة الغربية كمية وكانت ذات قيمة في توصيف المجسات الكيميائية9. يوفر PLA معلومات عن الموقع المكاني للأرجينين الميثيله لأنه يستخدم الجسم المضاد البروتيني المستهدف والجسم المضاد العام للأرجينين الأحادي أو ثنائي الميثيل ، وبالتالي التحايل على الحاجة إلى توليد أجسام مضادة محددة ويمكن استخدامه بشكل ملحوظ على الأنسجة الثابتة10.

ستمكن هذه المنهجيات المتنوعة معا من الاكتشاف القوي للأرجينين الميثيله في مختلف أنظمة الخلايا وحالات المرض وزيادة تعزيز المعرفة الأساسية للوظيفة البيولوجية لإنزيمات PRMT.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DBL مدعوم من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (NSERC). اتحاد الجينوم الهيكلي هو مؤسسة خيرية مسجلة (رقم: 1097737) تتلقى أموالا من Bayer AG و Boehringer Ingelheim و Bristol Myers Squibb و Genentech و Genome Canada من خلال معهد أونتاريو لعلم الجينوم [OGI-196] و EU / EFPIA / OICR / McGill / KTH / Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [منحة EUbOPEN 875510] ، Janssen ، Merck KGaA (المعروف أيضا باسم EMD في كندا والولايات المتحدة) ، Pfizer ، و Takeda.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

مقالات ذات صلة