يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج غشاء المشيمية المشيمية (CAM) كأداة لدراسة زراعة أنسجة المبيض

2.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64867

⸱

يونيو 23, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف بروتوكولا لتطوير نموذج تطعيم الأغشية المشيمية (CAM) لأنسجة المبيض البشرية ونوضح فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة التوعي بالكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة عبر فترة تطعيم مدتها 6 أيام.

الملخص

يعد حفظ أنسجة المبيض بالتبريد وزرعها استراتيجية فعالة للحفاظ على الخصوبة ولكن لها عيبا رئيسيا واحدا ، وهو فقدان البصيلات الهائل الذي يحدث بعد فترة وجيزة من إعادة الزرع بسبب تنشيط الجريب غير الطبيعي والموت. القوارض هي نماذج مرجعية للتحقيق في تنشيط الجريب ، لكن التكلفة والوقت والاعتبارات الأخلاقية أصبحت باهظة بشكل متزايد ، مما يدفع إلى تطوير البدائل. يعد نموذج الغشاء المشيمي المشيمي (CAM) جذابا بشكل خاص ، كونه غير مكلف ويحافظ على نقص المناعة الطبيعي حتى اليوم 17 بعد الإخصاب ، مما يجعله مثاليا لدراسة التطعيم الأجنبي قصير المدى لأنسجة المبيض البشري. كما أن الطب التكميلي والبديل شديد الأوعية الدموية وقد استخدم على نطاق واسع كنموذج لاستكشاف تكوين الأوعية. وهذا يمنحها ميزة ملحوظة على النماذج في المختبر ويسمح بالتحقيق في الآليات التي تؤثر على عملية فقدان الجريب المبكرة بعد التطعيم. يهدف البروتوكول الموضح هنا إلى وصف تطوير نموذج التطعيم بالأشعة السينية للطب التكميلي والبديل لأنسجة المبيض البشري ، مع رؤى محددة حول فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة توعية الكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة عبر فترة تطعيم مدتها 6 أيام.

المقدمة

ازداد الطلب على الحفاظ على الخصوبة لمؤشرات الأورام والحميدة ، وكذلك الأسباب الاجتماعية ، بشكل كبير خلال العقود الأخيرة. ومع ذلك ، فإن العلاجات المختلفة المستخدمة لعلاج الأمراض الخبيثة وغير الخبيثة شديدة السمية للغدد التناسلية ويمكن أن تؤدي إلى قصور المبيض المبكر علاجي المنشأ ، مما يؤدي في النهاية إلى العقم1. تشمل التقنيات الراسخة للحفاظ على الخصوبة حفظ الأجنة بالتبريد ، وتزجيج البويضات غير الناضجة أو الناضجة ، والحفظ بالتبريد لأنسجة المبيض2،3،4. تجميد أنسجة المبيض هو الخيار الوحيد المتاح للحفاظ على الخصوبة لدى الفتيات قبل سن البلوغ أو النساء اللائي يحتجن إلى علاج فوري للسرطان. تحدث استعادة وظيفة الغدد الصماء بعد زرع أنسجة المبيض في أكثر من 95٪ من الأشخاص ، مع معدلات ولادة حية تتراوح من 18٪ إلى 42٪ 5،6،7،8،9.

على الرغم من أن زرع أنسجة المبيض المجمدة المذابة قد أثبت نجاحه ، لا يزال هناك مجال للتحسين. في الواقع ، عندما يتم زرع شظايا المبيض القشرية دون مفاغرة الأوعية الدموية ، فإنها تعاني من فترة نقص الأكسجة التي تحدث خلالها إعادة التوعيالكسب غير المشروع 10،11،12. استخدمت الغالبية العظمى من الدراسات التي تبحث في زراعة أنسجة المبيض البشري نموذج التطعيم بالخارج ، حيث يتم زرع أنسجة المبيض للفئران التي تعاني من نقص المناعة. تستغرق إعادة التوعي الكاملة للطعوم الخارجية حوالي 10 أيام ، حيث تساهم كل من الأوعية المضيفة وأوعية الكسب غير المشروع في تكوين الأوعية الوظيفية12،13،14. يتم فقدان حوالي 50٪ -90٪ من احتياطي الجريب خلال نافذة نقص الأكسجين هذه قبل الانتهاء من إعادة توعية الكسب غير المشروع10،15،16. وقد اقترح بقوة أن هذا الفقدان الهائل للجريب يحدث من خلال كل من موت الجريب المباشر ، كما يتضح من انخفاض أعداد البصيلات المطلقة المتبقية بعد التطعيم ، وتنشيط نمو الجريب البدائي ، كما يتضح من التغيرات في نسب الجريب نحو زيادة معدلات نمو البصيلات17,18.

ومن المثير للاهتمام ، أن الأعمال البحثية السابقة باستخدام أنسجة المبيض الحيوانية المختلفة المطعمة بغشاء المشيمية الذكورية (CAM) ، والتي لها دستور يحاكي موقع التطعيم النموذجي للبريتوني ، قد أبلغت عن تثبيط تنشيط الجريب التلقائي ، مع بقاء احتياطي الجريب البدائي سليما لمدة تصل إلى 10 أيام19،20،21،22. أثبت فريقنا سابقا أن تطعيم أنسجة المبيض البشري المذابة المجمدة بالطب التكميلي والبديل يشكل نهجا موثوقا به للتحقيق في زراعة أنسجة المبيض البشري في مراحلها الإقفاريةالأولى 23 وأظهر مؤخرا أن طريقة التطعيم هذه كانت قادرة على مواجهة تنشيط الجريب24.

نموذج الطب التكميلي والبديل جذاب بشكل خاص ليس فقط لأن البيض أرخص بكثير من الفئران ولكن أيضا بسبب الطبيعة الوعائية للغاية للطب التكميلي والبديل ، مما يسمح بالتدقيق في العلاقة بين تنشيط الجريب وإعادة توعية طعم المبيض. يعد نظام الطيور ، في الواقع ، أحد أكثر الطرق شيوعا وتنوعا لدراسة تكوين الأوعيةالدموية 25. يستغرق تطور جنين الفرخ (ED) 21 يوما حتى الفقس ، ويتم تشكيل الطب التكميلي والبديل خلال أول 4-5 أيام من خلال اندماج الألانتوا والمشيمية26. والجدير بالذكر أن جنين الفرخ هو مضيف يعاني من نقص المناعة بشكل طبيعي حتى اليوم 17 من الضعف الجنسي ، لذلك يمكن إجراء تجارب التطعيم بالأجانب دون أي خطر من رفض الكسب غير المشروع27,28. علاوة على ذلك ، لا يثير نهج نموذج الطب التكميلي والبديل أي مخاوف أخلاقية أو قانونية فيما يتعلق بالقانون الأوروبي29 ، مما يجعله بديلا جذابا للنماذج الحيوانية الأخرى. فيما يتعلق بظروف التكاثر ، تحتاج أجنة الكتاكيت فقط إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية مع رطوبة هواء نسبية تتراوح بين 40٪ و 60٪. تقلل متطلبات التجارب المحدودة هذه بشكل كبير من تكاليف البحث مقارنة باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة.

يهدف البروتوكول المقدم هنا إلى وصف تطوير نموذج التطعيم الخارجي للطب التكميلي والبديل لأنسجة المبيض البشري وتقديم رؤى محددة حول فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة توعية الكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة على مدى فترة تطعيم مدتها 6 أيام. يمكن أن يكون هذا البروتوكول ذا أهمية كبيرة للتحقيق في الآليات الكامنة وراء فقدان الجريب المبكر بعد التطعيم ودراسة تأثير العديد من العوامل (عوامل النمو ، الهرمونات ، إلخ) على هذه الظاهرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على استخدام الأنسجة البشرية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في لوفان. أعطى المرضى موافقتهم الخطية المستنيرة على استخدام أنسجة المبيض لأغراض البحث.

1. طلب يوم 0 بويضات من المحتمل جدا أن تكون جنينية

  1. ابحث عن مورد بيض Leghorn أبيض معتمد من Lohman تم اختياره في المختبر والذي يبلغ عن معدلات عالية من البيض الجنيني ، والذي يعتمد بشكل أساسي على عمر الكتاكيت.

2. تحضير البيض للحضانة

  1. قبل وصول البيض ، قم بتجميع وموازنة حاضنة البيض إلى 37 درجة مئوية في رطوبة هواء نسبية 40٪ -60٪. راقب درجة الحرارة ورطوبة الهواء عن طريق إدخال مقياس حرارة ومقياس رطوبة في الحاضنة. تأكد من أن غطاء الحاضنة مزود بنافذة زجاجية للسماح بفحص المعلمات الداخلية للحاضنة دون الحاجة إلى فتحها (الشكل 1).
  2. بعد استلام اليوم 0 بيضة من فراخ Leghorn البيضاء المختارة من Lohman من مورد بيض معتمد من الدرجة المختبرية ، قم بتنظيف سطح الأصداف بورق مرطب وتجفيفها على الفور.
    ملاحظة: نظرا لأن غشاء قشر البيض مسامي ، يمكن استخدام الماء المعقم لتنظيف أسطح البيض والتحكم في الرطوبة داخل الحاضنة لتقليل مخاطر التلوث.
  3. قم بتسمية البيض باستخدام علامة (على سبيل المثال ، التاريخ ورقم البيضة).
  4. احتضان البيض مع توجيه الطرف المدبب لأسفل ، وقم بتدويره للسماح ل CAM بالتطور. قم بتدوير البيض يدويا بمقدار 180 درجة مرتين إلى ثلاث مرات يوميا أو استخدم دوارا تلقائيا.
    ملاحظة: من أجل ضمان تدوير البيض بالفعل ، يمكن تمييز قشر البيض ب "X" و "O" على الجانبين الجانبيين المتعارضين باستخدام قلم رصاص أو علامة. تسمح النافذة الزجاجية الموجودة في غطاء الحاضنة بالتحقق من دوران البيض دون فتح الجهاز.

3. فتح قشر البيض في اليوم الثالث من الضعف الجنسي

ملاحظة: يتم عمل نافذة مستطيلة في قشر البيض في اليوم 3 من الضعف الجنسي.

  1. تحضير غطاء التدفق الصفحي من أجل العمل في ظروف معقمة. ضع الأدوات التالية تحت الغطاء ، وقم بتطهيرها بنسبة 70٪ من الإيثانول (إن لم تكن معقمة بالفعل):
    - رف البيض
    - شمعة البيض أو مصدر الضوء البارد البؤري
    -علامه
    - دبوس مستقيم معقم
    - إبرة معقمة 19 جرام
    -5 مل حقنة معقمة
    - شفرة منشار التمرير
    -ملقط معقم
    -شريط لاصق
  2. انقل بيضة واحدة من الحاضنة إلى رف البيض الموضوع تحت الغطاء ، وأوقف تشغيل دوار البيض.
  3. في الظلام ، حدد الجيب الهوائي للبيضة عن طريق وضع شمعة البيض (أو مصدر الضوء البارد البؤري) مقابل قشر البيض. الجيب الهوائي موضعي في النهاية الحادة للبيضة. استخدم علامة لتحديد مركز الجيب الهوائي على قشر البيض.
  4. أشعل الأضواء. اصنع ثقبا صغيرا في قشر البيض حيث يتم تمييزه بتدوير دبوس مستقيم معقم برفق. عادة ما تكون الفتحة الصغيرة التي يبلغ قطرها حوالي 1 مم كافية.
    ملاحظة: احرص على عدم دفع الدبوس بالكامل عبر البيضة. إذا حدث هذا ، تخلص من البيضة.
  5. قم بتوصيل إبرة معقمة 19 جم بحقنة معقمة سعة 5 مل.
  6. في الظلام ، حدد موقع كيس الصفار باستخدام شمعة البيض (أو مصدر الضوء البارد البؤري) ، وثقب البيضة من خلال الفتحة المصنوعة في الخطوة 3.4 بإبرة معقمة 19 جم بزاوية 45 درجة باتجاه قاع البيضة ؛ احرص بشدة على عدم تعطيل كيس الصفار. نضح ما بين 1.5-2 مل من الزلال لفصل CAM عن القشرة ، ثم أغلق الفتحة بقطعة من الشريط اللاصق.
    ملاحظة: إذا تعطل كيس الصفار أثناء الشفط ، فسيكون السائل المستنشق في المحقنة أصفر اللون وليس شفافا (زلالي). إذا حدث هذا ، استبدل الإبرة والمحقنة. إذا تم امتصاص كمية كبيرة نسبيا من صفار البيض ، فقد يعرض ذلك صلاحية الجنين للخطر.
  7. أشعل الأضواء. ضع البيضة أفقيا ، وارسم نافذة مستطيلة بقياس 1 سم × 1.5 سم بعلامة. لا تجعل النافذة أكبر من العرض المعتاد للشريط اللاصق القياسي.
  8. امسك البيضة بيد واحدة ، وشاهد برفق النافذة المرسومة مسبقا في قشر البيض باستخدام شفرة منشار التمرير. تأكد من أن القشرة لا تتشقق ولا تقطع وصولا إلى CAM المكتئب. انفخ بانتظام لإزالة غبار القشرة والحطام.
  9. حرك ملقط معقم تحت القطعة المستطيلة من القشرة المنشورة ، وأمسكها ببراعة لإزالتها بشكل نظيف دون إتلاف CAM. بالإضافة إلى ذلك ، تخلص من غشاء الغلاف الخارجي الأبيض لتتمكن من رؤية الجنين والطب التكميلي والبديل الخاص به.
    ملاحظة: إذا سقط بعض غبار قشر البيض أو الحطام على CAM ، فيمكن إزالته باستخدام ملقط معقم ، مع الحرص الشديد على عدم تمزيق CAM.
  10. تحديد البويضات الجنينية القابلة للحياة. يمكن تمييزها من خلال زلالها الواضح والحلقة الوعائية حول الجنين ، حيث قد يتم اكتشاف قلب ينبض في بعض الأحيان حتى في هذه المرحلة (اليوم 3 من الضعف الجنسي). تخلص من الأجنة غير المخصبة أو الميتة.
  11. ضع شريطا لاصقا فوق النافذة التي تم إنشاؤها حديثا لتجنب الجفاف. تأكد من طي أحد طرفيه على نفسه لسهولة الإزالة.
  12. ضع البيضة مرة أخرى في الحاضنة مع توجيه النافذة المفتوحة لأعلى وعدم لمس الشريط للكاميرا CAM. استخدم قطعة مطوية من الورق أو جزءا من رف البيض لمنع البيضة من التدحرج. تأكد من إيقاف تشغيل الدرج الدوار.
  13. كرر الخطوات 3.2-3.12 لفتح البيض المتبقي.

4. تطعيم أنسجة المبيض البشري المجمدة المذابة في الطب التكميلي والبديل

ملاحظة: يجب أن تبدأ عملية الزرع في الطب التكميلي والبديل بشكل مثالي بين الأيام 7-10 من الضعف الجنسي.

  1. قم بإذابة شرائط المبيض القشرية المحفوظة بالتبريد تحت غطاء التدفق الصفحي باتباع البروتوكول الموصوف في مكان آخر30.
  2. قطع الشرائط القشرية إلى ثلاث أجزاء من 4 مم × 2 مم × 1 مم. استخدم قطعة واحدة كعنصر تحكم غير مطعمة والقطعتان الأخريان لتطعيم الأجانب لمدة 1 يوم أو 6 أيام.
    ملاحظة: في حالة توفر أنسجة كافية ، اعمل في نسختين.
  3. انقل بيضة واحدة من الحاضنة إلى رف البيض الموجود أسفل الغطاء ، مع توجيه النافذة لأعلى.
  4. قشر الشريط من النافذة ، وتأكد من أن الجنين قابل للحياة. في هذه المرحلة ، تتميز الأجنة القابلة للحياة بأوعية وعائية واسعة النطاق ، وزلال واضح ، ونبضات قلب مرئية ، وبعض حركة الجنين.
  5. قم بإعداد موقع التطعيم عن طريق صدمة منطقة صغيرة من الطب التكميلي والبديل برفق عن طريق وضع شريط 1 سم2 من ورق العدسة المعقم المستخرج من الأثير على السطح الظهاري وإزالته على الفور.
    ملاحظة: التكميلي والبديل هو حاجز لا يمكن اختراقه ما لم يكن الغشاء قد تعرض لصدمة بسبب إزالة الجزء العلوي حول الجلد من الطبقة الظهارية المزدوجة ، تاركا الطبقة القاعدية سليمة. تعمل هذه التقنية أيضا على تعزيز عملية إعادة التوعي عن طريق تنشيط التئام الجروح. إذا بقي ورق العدسة المعقم المستخرج من الأثير على CAM لفترة طويلة جدا ، فقد يلتصق الغشاء بورق العدسة ويتمزق. إذا حدث هذا ، تخلص من البيضة.
  6. أمسك شريطا قشريا مبيض مجمدا مذاب (4 مم × 2 مم × 1 مم) باستخدام ملقط جراحي مجهري ، وضعه على الطب التكميلي والبديل المصاب بالصدمة مع الجانب النخاعي ضد CAM. تطعيم قطعة مناديل واحدة لكل بيضة.
  7. غطي النافذة بشريط لاصق ، وأعد البويضة بعناية إلى الحاضنة. تأكد من أن فتحة قشر البيض في وضع مستقيم وأن البيضة آمنة.
  8. كرر الخطوات 4.1-4.7 لتطعيم جميع الأنسجة المتبقية.
    ملاحظة: يجب فحص الغرسات في كل يوم تطعيم لتقييم صلاحية الجنين ومراقبة التغيرات في الأوعية الدموية.

5. حصاد الطعوم

ملاحظة: يجب حصاد الطعوم الخارجية على أبعد تقدير بحلول اليوم 17 من الضعف الجنسي ، حيث يصبح الجهاز المناعي للجنين ناضجا ومختصا من اليوم 18.

  1. ضع البيضة على رف ، وقم بتكبير النافذة في قشر البيض للسماح بتصور أفضل للكسب غير المشروع والتلاعب بسهولة.
  2. تقييم الكسب غير المشروع مجهريا ، وإيلاء اهتمام خاص لرد فعل الأوعية الدموية من CAM تجاه الكسب غير المشروع. التقط صورا رقمية أو مقاطع فيديو للتسجيل.
  3. أمسك الأنسجة أو الطب التكميلي والبديل المحيط بالملقط ، واستخدم مقصا أو مشرطا لاستئصال الكسب غير المشروع من الطب التكميلي والبديل بعناية.
    ملاحظة: تصبح الطعوم مغطاة بطبقة ثانية من الطب التكميلي والبديل في حوالي اليوم 3 من التطعيم وتصبح مغلفة في النهاية. ربما تكون قد انتقلت أيضا داخل البويضة بحلول اليوم 6 ، مما يجعل من الصعب استعادتها في بعض الحالات.
  4. تحليل الأنسجة المستأصلة بأي طريقة مناسبة للتجربة المحددة. في هذه الدراسة ، تم تثبيت قطع الأنسجة في بارافورمالدهيد ، مغروس بالبارافين وملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين باتباع الخطوات الموضحة أدناه:
    1. ثبت الشظايا في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة ، وقم بتضمينها في البارافين باستخدام جهاز تضمين أوتوماتيكي بالخطوات المذكورة في الجدول 1.
    2. اترك الكتل المغروسة بالبارافين طوال الليل عند 4 درجات مئوية قبل تقطيعها إلى أقسام بسمك 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
    3. انشر أقسام المناديل على شريحة زجاجية موضوعة على طبق ساخن (30 درجة مئوية) ، واتركها لتجف لمدة 2 ساعة ، تليها 24 ساعة في فرن على حرارة 37 درجة مئوية.
    4. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الشرائح بالهيماتوكسيلين ويوزين باتباع بروتوكول موصوف في مكان آخر31. بعد ذلك ، قم برقمنة العينات باستخدام ماسح ضوئي للشرائح ، وقم بتحليلها باستخدام برنامج تحليل الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

معدلات بقاء جنين الفرخ
كان معدل بقاء الجنين من النوافذ (اليوم 3 من الضعف الجنسي) إلى تطعيم أنسجة المبيض (اليوم 7 من الضعف الجنسي) 79٪ (33/42). نظرا لأن النسبة المئوية للبيض الجنيني في اليوم 0 غير معروفة ، فقد تم طلب عدد زائد من البيض في اليوم 0 من دجاج ليغورن الأبيض المختار من قبل لومان لضمان توفر بيض جنيني كاف للتطعيم. تم استخدام ما مجموعه 23 بيضة قابلة للحياة في اليوم 7 للتطعيم ، ماتت إحداها خلال ال 24 ساعة الأولى ، مما أدى إلى معدل بقاء الجنين الإجمالي بنسبة 96٪ بعد الزرع (22/23).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الجزء الأكثر تحديا في البروتوكول الموصوف هنا هو عمل الثقب الصغير المطلوب لاستنشاق الزلال من أجل فصل CAM عن قشر البيض قبل إنشاء نافذة. يمكن أن يؤدي الضغط المفرط إلى الإفراط في الاختراق أو قد يؤدي إلى تكسير البويضة وتدميرها ، مما يتسبب في تلف لا رجعة فيه للطب التكميلي والبديل والأوعية الدموية. لتقليل الأخطاء إلى الحد الأدنى أثناء المحاولات الأولية لفصل CAM ، ينصح بشدة بالتدرب على عمل ثقوب صغيرة في قشر البيض غير المخصب الذي يتم شراؤه من البقالة باستخدام دبوس مستقيم. علاوة على ذلك ، نظرا للتباين الطبيعي للخصوبة عبر الدفعات ،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون ميرا هرينيوك ، بكالوريوس ، لمراجعة اللغة الإنجليزية للمقال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إبرة Agani تحت الجلد ، 19 GTerumo EuropeAN * 1950R119 G إبرة لشفط حقنة Terumo الزلال
، 5 مل قفل Luer متحد المركزTerumo EuropeSS * 05LE1حقنة معقمة 5 مل
Caseviewer v2.23DHISTECHبرنامج تحليل الصور
ثنائي إيثيل الأثيرMerck Chemicals603-022-00-4الأثير المعقم لإصابة CAM
محلول مائي Eosin Y 0.5٪Merck1098441000محلول تلطيخ
فورمالديهايد 4٪ محلول مائي مخزن مؤقت (الفورمالين 10٪) VWR97139010الفورمالديهايد المستخدم لتثبيت الأنسجة
ثلاجةLiebherr7081260الثلاجة عند 4 درجة ؛ C تستخدم لتضمين البارافين
لوحة التسخينSchottSLK2لوحة ساخنة تستخدم لتجفيف الشرائح
حاضنةThermo Forma Scientific 3111فرن10365156 يستخدم لحضانة الشرائح
Leica CLS 150 XE مجهر مصدر الضوء الباردLeicaCLS 150 XEمصدر الضوء البارد البؤري لشمعة البيض
مناديل تنظيف العدسة ، الصف 541VWR111-5003الأنسجة التي يجب نقعها في الأثير المعقم لإصابة محلول
تلطيخ الهيماتوكسيلينMERCK1092491000
الميثانولVWR20847307الميثانول
MicrotomeThermoScientific-MICROMHM325-2Microtome
Pannoramic P250 Flash III3DHISTECH/Slide scanner بتكبير 20x
Paraformaldehyde ميرك1،04،00،51،000حل تضمين البارافين
Paraplast Plus RSigmaP3683-1KGبطرين البارافين
، 60x15 مم ، معقمGreiner628161معقم طبق بتري
حامل دبوسأدوات العلوم الدقيقة26016-12حامل دبوس
PolyhatchBrinseaCP01Fحاضنة بيض مع دوار
أوتوماتيكيشفرة المنشار اللولب ، 132 ممSencys/شفرة المنشار لإنشاء نافذة في قشر البيض
دبابيس إدراج الفولاذ المقاومأدوات العلوم الدقيقة26007-02دبوس مستقيم لعمل ثقب في قشر
البيض Steril-Helios Angelantoni IndustrieST-00275400000غطاء محرك السيارة التدفق الصفحي
Superfrost Plus bords rod &ecute; S 90 درجة ؛VWR631-9483شرائح زجاجية 
Tissue-Tek VIP 6AlSakura60320417-0711 VID6E3-1جهاز التضمين التلقائي
ملقط التيتانيومأدوات العلوم الدقيقة11602-16ملقط لإزالة قشر البيض والتلاعب بأنسجة المبيض
تولوين ، PAVWR28701364محلول تضمين البارافين
من CAM Mayer طبق للصدأ

المراجع

  1. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
  2. Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247(2021).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. New England Journal of Medicine. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  4. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. Nature Reviews Endocrinology. 9 (12), 735-749 (2013).
  5. Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
  6. Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
  7. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  8. Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
  9. Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
  10. Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
  11. Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
  12. Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
  13. Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
  14. Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
  15. Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
  16. Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
  17. Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
  18. Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
  19. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
  20. Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
  21. Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
  22. Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
  23. Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
  24. Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
  25. Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
  26. Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876(2020).
  27. Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
  28. Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61(2018).
  29. Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
  30. Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986(2008).
  32. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  33. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651(2020).
  34. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  35. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522(2013).
  36. Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411(2015).
  37. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
  38. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154(2010).
  39. Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958(2013).
  40. Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21(2018).
  41. Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
  42. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  43. Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  44. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  45. Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نموذج غشاء المشيمية المشيمية (CAM) كأداة لدراسة زراعة أنسجة المبيض
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.