يصف البروتوكول الحالي طرق تقييم بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض. يتضمن هنا طرق الطلاء والتلوين الشاملة ، بالإضافة إلى إجراءات القياس الكمي التفصيلية والموضوعية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصور بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض عن طريق فحوصات التألق المناعي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد التألق المناعي أحد أكثر التقنيات استخداما لتصور المستضدات المستهدفة ذات الحساسية العالية والنوعية ، مما يسمح بالتحديد الدقيق وتوطين البروتينات والجليكان والجزيئات الصغيرة. في حين أن هذه التقنية راسخة في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن استخدامها في نماذج الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D). عضويات سرطان المبيض هي نماذج ورم 3D تلخص عدم تجانس الخلايا السرطانية النسيلي ، والبيئة المكروية للورم ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا. وبالتالي ، فهي متفوقة على خطوط الخلايا لتقييم حساسية الدواء والمؤشرات الحيوية الوظيفية. لذلك ، فإن القدرة على استخدام التألق المناعي على عضويات سرطان المبيض الأولية مفيدة للغاية في فهم بيولوجيا هذا السرطان. تصف الدراسة الحالية تقنية التألق المناعي للكشف عن بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المصلية عالية الجودة المشتقة من المريض (PDOs). بعد تعريض PDOs للإشعاع المؤين ، يتم إجراء التألق المناعي على المواد العضوية السليمة لتقييم البروتينات النووية كبؤر. يتم جمع الصور باستخدام تصوير z-stack على الفحص المجهري متحد البؤر وتحليلها باستخدام برنامج حساب البؤر الآلي. تسمح الطرق الموصوفة بتحليل التوظيف الزمني والخاص لبروتينات إصلاح تلف الحمض النووي وتوطين هذه البروتينات مع علامات دورة الخلية.
المقدمة
سرطان المبيض هو السبب الرئيسي للوفاة بسبب الأورام الخبيثة النسائية. يتم علاج غالبية المرضى بالأدوية الضارة بالحمض النووي مثل كاربوبلاتين ، ويمكن إعطاء أولئك الذين يعانون من نقص في إصلاح إعادة التركيب المتماثل (HRR) مثبطات بوليميراز بولي (ADP-ribose) (PARP) 1,2. ومع ذلك ، فإن معظم المرضى يطورون مقاومة لهذه العلاجات ويموتون في غضون 5 سنوات من التشخيص. ارتبط عدم تنظيم استجابة تلف الحمض النووي (DDR) بتطور سرطان المبيض ومقاومة كل من العلاج الكيميائي ومثبطات PARP3. وبالتالي ، فإن دراسة نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج أمر حتمي في فهم الفيزيولوجيا المرضية لسرطان المبيض ، والمؤشرات الحيوية ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على أنسجة الورم والاستسقاء بعد الحصول على موافقة المريض كجزء من المستودع الحيوي لأورام النساء الذي تمت الموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة واشنطن في سانت لويس (IRB). تم تضمين المرضى إذا كان لديهم مرحلة متقدمة من سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC). تم تنفيذ جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء ما لم ينص على خلاف ذلك. تم تحضير جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة (ما لم يذكر خلاف ذلك) وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
1. توليد العضوية
- قم بإنشاء المواد العضوية بعد التقرير المنشورمسبقا 20.
2. تصفيح وتشعيع المواد العضو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن للبروتوكول المقدم أن يلطخ بنجاح بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في المواد العضوية ويتصورها ويحددها كميا. تم استخدام هذه التقنية لتلطيخ وتقييم PDOs قبل وبعد التشعيع. تعرضت PDOs إلى 10 Gy من الإشعاع وتم تقييمها للمؤشرات الحيوية التالية: ɣ-H2AX (الشكل 1) ، علامة على تلف الحمض النووي. RAD51 (الشكل 2) ، علامة لمعدل الموارد البشرية ؛ 53BP1 ، علامة على NHEJ ؛ RPA ، علامة على إجهاد النسخ المتماثل (الشكل 3) ؛ و geminin ، علامة دورة خلية.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تلعب استجابة تلف الحمض النووي دورا أساسيا في كل من تطور سرطان المبيض ومقاومة العلاج الكيميائي. لذلك ، فإن الفهم الشامل لآليات إصلاح الحمض النووي أمر حتمي. هنا ، يتم تقديم منهجية لدراسة بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في 3D ، عضويات سليمة. تم تطوير بروتوكول موثوق وقابل للتكرار باستخدام الأجسام المضادة المميزة لتقييم تلف الحمض النووي ، وإعادة التركيب المتماثل ، والانضمام النهائي غير المتماثل ، وإجهاد التكاثر. الأهم من ذلك ، يتم التحقق من صحة هذه الطرق باستخدام ضوابط معدلة وراثيا توضح خصوصية وحساسية هذه الطرق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نحن ممتنون لتوجيهات بافل لوباتشيفسكي ، دكتوراه في إنشاء هذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لكلية الطب بجامعة واشنطن في قسم أمراض النساء والتوليد في سانت لويس وقسم الأورام النسائية ، وبرنامج العميد للباحثين بجامعة واشنطن ، ومؤسسة مجموعة الأورام النسائية ، وبرنامج تطوير علماء الإنجاب لدعمهم لهذا المشروع.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS ++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون كالسيوم ومغنيسيوم (PBS) فيشر | العلمي ؛ | ICN1860454 | |
| الأجسام المضادة Ant-53BP1 | 612522 | BD Biosciences | إلى 1: 500 في المخزن المؤقت |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | مخفف إلى 1: 200 في المخزن المؤقت |
| للجسم المضاد للجيمينين ؛ | ProteinTech | 10802-1-AP | مخفف إلى 1: 400 في المخزن المؤقت |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | مخفف إلى 1: 1000 في مخزن مؤقت تلطيخ |
| الأجسام المضادة المضادة ل yH2AX ؛ | Millipore-Sigma | 05-636 | مخفف إلى 1: 500 في مخزن مؤقت تلطيخ |
| Ant-phospho-RPA32 (S4 / S8) مختبرات الأجسام المضادة | Bethyl ؛ | A300-245A-M | مخفف إلى 1: 200 في تلطيخ العازلة |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | فيشر العلمي ؛ | BP1605 100 | |
| جهاز طرد مركزي ؛ Sorvall St 16R الطرد المركزي | Thermo Scientific | 75004240 | |
| المجهر متحد البؤر ، نظام Leica SP5 متحد البؤر DMI4000 | Leica & nbsp ؛ | 389584 | |
| أنابيب مخروطية ، 15 مل | Corning ؛ | 14-959-53A | |
| الكونتيسة 3 FL عداد الخلايا الآلي (آلة عد الخلايا) ؛ | ثرمو علمية | AMQAF2000 | |
| الشرائح غرفة عد الخلايا الكونتيسة | الحرارية العلمية ؛ | C10228 | |
| غطاء زلة | LA الألوان أي | طلاء أظافر شفاف يكفي | |
| Cultrex ؛ مستخلص الغشاء القاعدي RGF ، النوع 2 | & nbsp ؛ R & D Systems | 3533-010-02 | يمكن على الأرجح استخدام Matrigel أو مصفوفة BME الأخرى |
| DAPI | ثرمو علمية | R37606 | كاشف NucBlue Fixed Cell ReadyProbes ، مخفف في 1x PBS & nbsp ؛ |
| جلايسين | فيشر العلمية | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | للوصول إلى البرنامج ، البريد الإلكتروني: jcountpro@gmail.com | |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة | فيشر العلمية | 07-000-243 | |
| طلاء الأظافر | StatLab | SL102450 | |
| بارافومرالديهايد (PFA) ، 2٪ ؛ | علوم المجهر الإلكتروني | 157-4 | تمييع إلى 4٪ PFA في PBS ++ للحصول على 2٪ |
| PFA النفاذية المؤقتة | المصنوعة في المختبر | 0.2٪ X-100 Triton في PBS ++ ؛ | |
| ماصة | Rainin | 17014382 | |
| ماصة Tip | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| تلوين العازلة | صنع في المختبر | 0.5٪ BSA ، 0.15٪ جلايسين ، 0.1٪ X-100 تريتون في PBS ++ ؛ | |
| شرائح الغرفة Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II | ثرمو علمية | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| تريبان الأزرق ، 0.4٪ | Thermo Scientific ؛ | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | إنزيم مؤتلف خال من أصل حيواني |
| X-RAD 320 Biological Irradiator ؛ | الإشعاع الدقيق بالأشعة السينية | إكس راد320 |
المراجع
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
