التوصيف الوظيفي والتصور للخلايا الليفية المريئية باستخدام الثقافات العضوية المشتركة

Summary

توفر الثقافات المشتركة للخلايا الليفية العضوية نموذجا لدراسة مكانة الخلايا الجذعية في الجسم الحي . هنا ، يتم وصف بروتوكول للثقافات المشتركة للخلايا الليفية العضوية المريئية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام تصوير جبل كامل لتصور التفاعل بين الخلايا الليفية والعضوية.

Abstract

تساهم الخلايا الجذعية الظهارية والسلفية في تكوين وصيانة الحاجز الظهاري طوال الحياة. يتم وضع معظم مجموعات الخلايا الجذعية والسلفية بعيدا في مواقع متميزة تشريحيا ، مما يتيح تفاعلات حصرية مع الإشارات المتخصصة التي تحافظ على الجذعية. في حين أن تطوير الثقافات العضوية الظهارية يوفر أداة قوية لفهم دور الخلايا الجذعية والسلفية في التوازن والمرض ، فإن التفاعل داخل البيئة المتخصصة غائب إلى حد كبير ، مما يعيق تحديد العوامل التي تؤثر على سلوك الخلايا الجذعية. تلعب الخلايا الليفية دورا رئيسيا في توجيه مصير الجذع الظهاري والسلف. هنا ، يتم تقديم بروتوكول شامل للاستزراع المشترك للخلايا العضوية الليفية يتيح تحديد المجموعات الفرعية للخلايا الليفية في تجديد الخلايا السلفية المريئية وتمايزها. في هذا البروتوكول ، يتم وصف طريقة لعزل كل من الخلايا الظهارية والخلايا الليفية بالتوازي مع المريء. تم تحديد استراتيجيات فرز الخلايا المنشطة بالفلورة المتميزة لعزل كل من الخلايا السلفية المريئية وكذلك المجموعات الفرعية للخلايا الليفية من المراسل المعدل وراثيا أو الفئران البرية. يوفر هذا البروتوكول نهجا متعدد الاستخدامات يمكن تكييفه لاستيعاب عزل مجموعات فرعية محددة من الخلايا الليفية. يتم تضمين إنشاء وتمرير الثقافات العضوية الظهارية المريئية في هذا البروتوكول ، مما يتيح مقارنة مباشرة مع نظام الاستزراع المشترك. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف نهج المقاصة 3D السماح لتحليل الصورة التفصيلية للتفاعلات الظهارية الليفية. بشكل جماعي ، يصف هذا البروتوكول طريقة مقارنة وعالية الإنتاجية نسبيا لتحديد وفهم مكونات الخلايا الجذعية المريئية المتخصصة في المختبر.

Introduction

تستخدم المواد العضوية كمقايسات ثلاثية الأبعاد في المختبر لتوصيف الخلايا الجذعية والسلفية ، وكذلك لفهم إشارات الإشارات المشتقة من المكونات الخلوية لمكانة الخلايا الجذعية¹،²،^3،4. تم وصف عضويات المريء للفأر لأول مرة في عام 2014 وحددت العديد من الأوراق عوامل النمو ، مثل R-Spondin (RSPO) و NOGGIN وعامل نمو البشرة (EGF) ، اللازمة للحفاظ على عضويات المريء ومرورها⁵،⁶،^{7 ،} بحجة أن إشارات إشارات مماثلة مطلوبة في الجسم الحي تجديد الخلايا السلفية. ومع ذلك ، يتم إضافة عوامل النمو بشكل شائع في التركيزات غير الفسيولوجية ، مما يؤدي إلى ظروف نمو عضوية لا تعكس بالضرورة بيئة الإشارات في الجسم الحي.

الخلايا الليفية هي مجموعات خلايا انسجة غير متجانسة تدعم خصائص الخلايا السلفية في العديد من منافذ الخلايا الجذعية⁸. إن الجمع بين الخلايا السلفية الظهارية والخلايا الليفية في نفس الثقافة العضوية يمكن من تكوين عضوي بتركيزات منخفضة من عوامل النمو المكملة خارجيا. تم وصف أنظمة الاستزراع المشترك العضوي من الظهارة المعوية والكبدية ، ولكن بروتوكول إنشاء مزارع مشتركة للخلايا الليفية العضوية المريئية لا يزال معلقا⁹،^10،11.

في هذا البروتوكول ، تم تحديد استراتيجيتين لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للخلايا الليفية من المريء ، باستخدام إما الفئران المعدلة وراثيا Pdgfrα^{H2BeGFP 12} أو الفئران من النوع البري مع تلطيخ الأجسام المضادة الكلاسيكية. يمكن عزل مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الليفية باستخدام علامات سطح الخلية المفضلة ، وبالتالي توفير المرونة للبروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام تقنية التصوير الفلوري 3D الحفاظ على مورفولوجيا العضوية لتوصيف تفاعلات الخلايا الليفية العضوية. يوفر التطهير العضوي طريقة سريعة لزيادة عمق تغلغل الضوء في المواد العضوية ، وتحسين تصور وصلات الخلايا الليفية العضوية وتمكين تلخيص البنية العضوية بالكامل. يجمع هذا البروتوكول بين الثقافة العضوية المريئية المشتركة واستراتيجية تصوير التركيب الكاملة ، مما يتيح التوصيف الوظيفي للتفاعل بين الخلايا الليفية والعضوية.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات لهذه الدراسة من قبل Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (تصريح أخلاقي رقم 14051-2019). تم إيواء الحيوانات في ظروف خالية من مسببات الأمراض وفقا لتوصيات الاتحاد الأوروبي لعلوم المختبرات.

1. التحضير

1. قم بإذابة محاليل المخزون الأنزيمية المستخدمة في التفكك (انظر جدول المواد) على الجليد. قم بإذابة حصة مصفوفة الغشاء القاعدي المخفضة لعامل النمو (GFR) (المصفوفة) عند 4 درجات مئوية.
2. إعداد وسط الثقافة. استخدم الوسيط الموصوف في الجدول 1 للمزارع العضوية والثقافات المشتركة وقم بإعداده قبل بدء البروتوكول.

2. تشريح وفصل ظهارة المريء وسدى

ملاحظة: تأكد من أن جميع الأدوات المستخدمة في التشريح ومعالجة الأنسجة معقمة. تحضير 2 مل من محلول التفكك (انظر جدول المواد) في محلول الملح المتوازن (HBSS) لهانكس لكل ثلاثة مريء.

1. استخدم سلالة الماوس التي تختارها ، مثل الفئران C57BL / 6J. ينتهي تطور المريء في الفئران بعد يوم ما بعد الولادة (p) 70 ، لذلك يوصى باستخدام الفئران التي يزيد عمرها عن p70¹³. استخدم أربعة أو خمسة فئران لأنها توفر مادة كافية لإنشاء 8-10 مزارع عضوية مشتركة.
   ملاحظة: تنخفض كفاءة تكوين المواد العضوية مع تقدم عمر الفئران. إذا كانت مجموعات فرعية محددة من الخلايا الليفية ذات أهمية ، فمن الممكن أن يحد انخفاض إنتاج الخلايا الليفية من عدد الثقافات العضوية المشتركة التي يمكن إنشاؤها.
2. استخدم الفئران المعدلة وراثيا (على سبيل المثال ، Pdgfrα^H2BeGFP) أو الفئران البرية (WT) لعزل مجموعات الخلايا الليفية. عند استخدام الفئران WT ، قم بإجراء تلطيخ الأجسام المضادة لعزل مجموعات فرعية معينة من الخلايا الليفية من السدى عبر FACS.
3. القتل الرحيم للفئران عن طريق الاختناق_{CO 2} . تشريح المريء باستخدام ملقط ومقص تشريح. لإزالة المريء بالكامل ، اقطع الطرف البعيد للمريء مباشرة فوق المعدة والنهاية القريبة في بداية القصبة الهوائية. اغمر المريء في برنامج تلفزيوني وضعه على الجليد.
4. قم بإزالة العضلات الخارجية ميكانيكيا باستخدام مجهر التشريح (نطاق التكبير الكلي 8x-40x) والملقط. أمسك الطرف البعيد من المريء المشريح باستخدام زوج واحد من الملقط واستخدم الملقط الآخر للإمساك بالعضلات وسحبها من الطرف البعيد إلى الطرف القريب من المريء الذي تم تشريحه. إزالة وتجاهل طبقة العضلات.
5. افتح المريء طوليا. يعمل هذا بشكل أفضل باستخدام مقص زنبركي للتشريح المجهري بطرف كروي لمنع تلف الأنسجة. امسك أحد طرفي المريء لإدخال كرة مقص الزنبرك في تجويف المريء وقطع المريء مع التمسك بالنهاية.
6. ضع المريء في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل أو لوحة 24 بئرا. احتضان المريء المفتوح في 0.5 مجم / مل بالحرارة في HBSS عند 37 درجة مئوية على هزاز هزاز لمدة 15 دقيقة. غمر المريء تماما في محلول ثيرموليزين.
   ملاحظة: يعتمد حجم محلول التحلل الحراري المستخدم على حجم البئر أو الأنبوب. يمكن وضع العديد من المريء وغمرها في نفس البئر أو الأنبوب.
7. أخرج المريء من محلول ثيرموليسين. استخدم مجهر التشريح لفصل ظهارة المريء بعناية عن السدى. باستخدام ملقط رفيع ، أمسك كلا من الجانب الطلائي وجانب السدى من الأنسجة واسحبهما ببطء لفصل الطبقتين.
   ملاحظة: يتم تحديد السدى من خلال مظهره الأبيض وغير الشفاف ، على عكس الظهارة الشفافة. تحتوي السدى على الصفيحة المخصوصة والطبقة تحت المخاطية.
8. نقل الطبقة الظهارية واللحمية إلى أنبوبي طرد مركزي دقيقين منفصلين سعة 1.5 مل مع 200 ميكرولتر من محلول التفكك في HBSS. وضعت على الجليد.

3. عزل الخلايا السلفية المريئية

ملاحظة: يمكن إجراء عزل الخلايا السلفية المريئية (الخطوة 2) والخلايا الليفية (الخطوة 3) في وقت واحد. قم بإعداد أنبوب 50 مل من 1٪ FBS في HBSS (1٪ FBS).

1. انقل ظهارة المريء المنفصلة من أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 مل (الخطوة 2.8) إلى طبق بتري نظيف واستخدم مشرطا حادا للفرم. اجمع الأنسجة المفرومة من طبق بتري مع 200 ميكرولتر من محلول التفكك وانقلها مرة أخرى إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 مل.
   ملاحظة: يتم فرم الظهارة بشكل صحيح عندما يمكن وضع القطع مرة أخرى في أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 مل باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر.
2. أضف 800 ميكرولتر من محلول التفكك الطازج إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 مل إلى حجم إجمالي قدره 1 مل.
   ملاحظة: من المهم إضافة كمية كافية من محلول التفكك. لكل واحد إلى ثلاثة مريء ، يوصى باستخدام 1 مل من المحلول. قم بتوسيع نطاقه عندما تتم معالجة المزيد من المريء في وقت واحد.
3. ضع الأنبوب مع الطبقة الظهارية المفرومة على هزاز هزاز على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ماصة المحلول لأعلى ولأسفل حوالي 20 مرة باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر كل 15 دقيقة لتعزيز عملية الهضم.
4. بعد 60 دقيقة ، ماصة صعودا وهبوطا 20 مرة أخرى باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر. مرر المحلول من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: بلل مصفاة الخلايا بنسبة 1٪ FBS قبل إجهاد الخلايا لتقليل التصاق الخلايا بالفلتر. لن يتم هضم الظهارة بالكامل ، وستظل قطع الأنسجة مرئية. ومع ذلك ، فإن الحضانة الأطول ستقلل من بقاء الخلايا ولن تؤدي إلى زيادة إنتاجية الخلايا القابلة للحياة.
5. تخلص من المادة الطافية عن طريق إزالة السائل الزائد باستخدام ماصة سعة 1 مل وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من 1٪ FBS. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   1. أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة المترافقة ل FACS للخلايا السلفية المريئية.
   2. امزج 1 ميكرولتر من CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) و CD104-A647 (INTEGRIN-β4) في 200 ميكرولتر من 1٪ FBS لكل مليون خلية.
      ملاحظة: 1 ميكرولتر من الجسم المضاد (200 ميكرولتر الحجم النهائي) يكفي لواحد أو اثنين من المريء. عند معالجة المزيد من المريء في وقت واحد ، قم بزيادة حجم محلول تلطيخ الأجسام المضادة.
6. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة وانقلها إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. بعد إضافة الأجسام المضادة الفلورية ، احتفظ بتعليق الخلية في الظلام لتجنب تبييض الإشارة. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أضف 3 مل من 1٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم أعد تعليق الخلايا بحد أدنى 200 ميكرولتر من 1٪ من FBS.
   ملاحظة: يتم استخدام 500 ميكرولتر من 1٪ FBS لما يصل إلى أربعة أو خمسة مريء. زيادة الحجم عند معالجة المزيد من المريء في وقت واحد ، بحيث يمكن تحقيق معدل تدفق FACS من 100-300 حدث / ثانية. سيؤدي المزيد من الأحداث / الأحداث إلى تقليل كفاءة الفرز ، وستؤدي الزيادة في معدل التدفق إلى تقليل بقاء الخلية.
7. أضف علامة بقع الخلايا الميتة إلى تركيز نهائي قدره 1: 10000 ، قبل 5 دقائق من فرز FACS لعزل الخلايا الحية. فرز الخلايا السلفية باستخدام جهاز FACS (انظر الشكل 1 لاستراتيجية البوابات). اجمع الخلايا في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل مملوءة ب 200 ميكرولتر من الوسط العضوي الأساسي (الجدول 1).

4. عزل الخلايا الليفية من الطبقة اللحمية

1. قطع طبقة الثغر إلى قطع دقيقة في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 200 ميكرولتر من محلول التفكك (الخطوة 2.8) باستخدام مقص التشريح. يتم فرم الأنسجة بشكل صحيح بمجرد أن يتم سحب المحلول لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر.
2. أضف 800 ميكرولتر من محلول التفكك الطازج إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 مل إلى حجم إجمالي قدره 1 مل.
   ملاحظة: من المهم إضافة كمية كافية من محلول التفكك. لكل واحد إلى ثلاثة مريء ، يوصى باستخدام 1 مل من المحلول. قم بتوسيع نطاقه عندما تتم معالجة المزيد من المريء في وقت واحد.
3. ضع الأنبوب على هزاز على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، ماصة المحلول لأعلى ولأسفل حوالي 20 مرة باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر لتعزيز الهضم.
4. بعد 30 دقيقة من الهضم الأنزيمي ، ماصة صعودا وهبوطا 20 مرة أخرى باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر. قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: بلل مصفاة الخلايا بنسبة 1٪ FBS قبل إجهاد الخلايا لتقليل التصاق الخلايا بالفلتر.
5. تخلص من المادة الطافية عن طريق إزالة السائل الزائد باستخدام ماصة سعة 1 مل وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من 1٪ FBS. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: عند استخدام سلالة فأر معدلة وراثيا تحتوي على خلايا ليفية تحمل علامة فلورسنت ، تكون تلطيخ الأجسام المضادة اختيارية. إذا لم تكن تلطيخ الأجسام المضادة مطلوبا ، فتابع الخطوة 3.7 وانقل العينة إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي.
   1. أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة المترافقة لعزل FACS للخلايا الليفية. امزج 1 ميكرولتر من CD26-APC (DPP4) في 200 ميكرولتر من 1٪ FBS لكل مليون خلية.
      ملاحظة: 1 ميكرولتر من الجسم المضاد يكفي لواحد أو اثنين من المريء. عند معالجة المزيد من المريء في وقت واحد ، قم بزيادة حجم محلول تلطيخ الأجسام المضادة.
6. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة المترافق في 1٪ FBS وانقلها إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
7. أضف 3 مل من 1٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من 1٪ من FBS.
   ملاحظة: يتم استخدام 500 ميكرولتر من 1٪ FBS لما يصل إلى أربعة أو خمسة مريء. قم بزيادة مستوى الصوت عند معالجة المزيد من المريء في وقت واحد ، بحيث يمكن تحقيق معدل تدفق يتراوح بين 100-300 حدث / ثانية. المزيد من الأحداث / الأحداث سيقلل من كفاءة الفرز ، وزيادة معدل التدفق سيقلل من بقاء الخلية. بعد إضافة الأجسام المضادة الفلورية ، يجب أن تبقى معلقات الخلايا مظلمة لتجنب تبييض الإشارة.
8. أضف علامة بقع الخلايا الميتة إلى تركيز نهائي قدره 1: 10000 ، قبل 5 دقائق من فرز FACS لعزل الخلايا الحية. فرز الخلايا باستخدام جهاز FACS (انظر الشكل 1 لاستراتيجية البوابة). اجمع الخلايا في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل مملوءة ب 200 ميكرولتر من الوسط العضوي الأساسي (الجدول 1).

5. إنشاء وثقافة عضويات المريء

ملاحظة: التسخين المسبق_منخفض ER (الاستزراع المشترك العضوي) ، وسط ENR (عضوي) (انظر الجدول 1 للحصول على الوصف) ، وصفيحة 48 بئرا عند 37 درجة مئوية. ضع المصفوفة المذابة (المعدة في الخطوة 1) على الجليد. يوصى باستخدام المصفوفة المتوفرة هنا (انظر جدول المواد) لثقافة المريء العضوية للفأر ، لأن العلامات التجارية الأخرى للمصفوفة تؤثر سلبا على كفاءة تشكيل العضوي.

1. بالنسبة للثقافة العضوية المشتركة ، امزج الخلايا الظهارية المصنفة والخلايا الليفية بنسبة 1: 2 في أنبوب. لكل قبة مصفوفة ، استخدم 5000 خلية ظهارية و 10000 خلية ليفية. عند التحضير لمزيد من القباب ، أضف مضاعف 5000 خلية ظهارية و 10000 خلية ليفية إلى أنبوب واحد. بالنسبة للمزارع العضوية التي لا تحتوي على خلايا ليفية ، استخدم 5000 خلية ظهارية لكل قبة مصفوفة.
2. أجهزة الطرد المركزي لسكان الخلايا المختلطة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق إزالتها بعناية باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر.
3. اغسل الخلايا مرة واحدة عن طريق تعليق الحبيبات في وسط عضوي أساسي بارد وأجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. ضع الخلايا على الجليد.
4. تحضير مزيج يتكون من 80 ٪ مصفوفة و 20 ٪ وسط عضوي أساسي بارد. ضع كل شيء على الجليد عندما تصلب المصفوفة في درجة حرارة الغرفة (RT).
5. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي عن طريق إزالتها بعناية باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر. أعد تعليق الخلايا في 10 ميكرولتر من مزيج / قبة المصفوفة ووضعها مرة أخرى على الجليد.
6. خذ اللوحة المسخنة مسبقا المكونة من 48 بئرا من حاضنة 37 درجة مئوية واصنع قبة مصفوفة واحدة لكل بئر باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر. تحتوي كل قبة على 10 ميكرولتر من 80٪ مصفوفة و 5000 خلية ظهارية و 10000 خلية ليفية. انقل اللوحة رأسا على عقب إلى حاضنة واترك القباب تصلب لمدة 20-30 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: سيؤثر انخفاض حجم قبة المصفوفة و / أو زيادة عدد الخلايا على كفاءة تشكيل العضو العضوي.
7. أضف 200 ميكرولتر من الوسط_{المنخفض} ER المسخن مسبقا (الجدول 1) إلى قباب المصفوفة التي تحتوي على مزارع عضوية مشتركة ووسط ENR (الجدول 1) إلى قباب المصفوفة المعنية التي تحتوي على عضويات ظهارية فقط وضع اللوحة في الحاضنة.
8. تنمو المواد العضوية في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO₂. في أول يومين ، استكمل الوسط بمثبط الصخور 10 ميكرومتر (Y-27623). يمنع مثبط الصخور موت الخلايا الناجم عن الإجهاد ويزيد من فرصة نجاح إنشاء مزارع عضوية.
9. قم بتحديث الوسيط كل 2-3 أيام. تأكد من أن الوسط دافئ لمنع تفكك المصفوفة الحساسة لدرجة الحرارة.
10. قم بإجراء تحليلات للتجربة بعد 6 إلى 8 أيام من الطلاء. يمكن الاحتفاظ بالمواد العضوية في الثقافة لمدة تصل إلى 14 يوما. حوالي اليوم 14 ، لوحظ فقدان سلامة القبة.

6. تمرير المواد العضوية

ملاحظة: يؤدي مرور المواد العضوية المزروعة في الاستزراع المشترك إلى فقدان الخلايا الليفية. لذلك ، يوصى باستخدام وسيط ENR لجميع المواد العضوية عند مرورها. قم بتسخين ENR و PBS وصفيحة 48 بئرا عند 37 درجة مئوية.

1. إزالة المتوسطة وغسل البئر التي تحتوي على قبة المصفوفة مع PBS قبل تسخينها. أضف 200 ميكرولتر من محلول التربسين البارد 0.25٪ والماصة لأعلى ولأسفل لكسر قبة المصفوفة.
   ملاحظة: يوصى باستخدام التربسين البارد 0.25٪ ، لأن المصفوفة حساسة لدرجة الحرارة وهذا يساعد في تكسير قباب المصفوفة.
2. احتضان المواد العضوية مع التربسين في 37 درجة مئوية لمدة ~ 20 دقيقة. ماصة صعودا وهبوطا بعد 10 دقائق لزيادة تفكك المواد العضوية. راقب عملية التفكك بالمجهر كل 5-10 دقائق. نظرا لأن التربسين يقلل من صلاحية الخلية ، فقد يساعد ذلك في تحديد وقت التفكك المثالي.
3. بعد 20 دقيقة ، ماصة المواد العضوية صعودا وهبوطا مع ماصة 200 ميكرولتر لفصل المواد العضوية. اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل ، وأضف 1 مل من الوسط العضوي الأساسي ، وأجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
4. اختياري: لضمان أفضل ظروف نمو عضوي وأن الكائنات العضوية الجديدة مشتقة من خلايا مفردة ، قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية مبللة مسبقا 40 ميكرومتر. يؤدي ترشيح تعليق الخلية إلى إزالة النوى العضوية وكتل الخلايا التي يصعب فصلها.
5. قم بإعداد مزيج مصفوفة يتكون من 80٪ مصفوفة و 20٪ وسط عضوي أساسي بارد. ضع كل شيء على الجليد ، حيث تصلب المصفوفة في RT.
6. تخلص من المادة الطافية عن طريق إزالتها بعناية باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، وأعد تعليق الخلايا في 10 ميكرولتر من مزيج / قبة المصفوفة ، ثم أعد الخليط إلى الثلج.
   ملاحظة: يمكن تقسيم المواد العضوية بنسبة 1: 5 إلى 1:10 ، اعتمادا على كثافة القبة. يمكن أيضا عد الخلايا الظهارية وإعادة طلائها عند 5000 خلية / قبة.
7. خذ الصفيحة ذات 48 بئرا الدافئة مسبقا من الحاضنة التي تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية واصنع قبة واحدة لكل بئر. انقل اللوحة رأسا على عقب إلى حاضنة واترك القباب تصلب لمدة 20-30 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية.
8. أضف 200 ميكرولتر من وسط ENR المسخن مسبقا إلى القباب العضوية المعنية. تكملة الوسط مع 10 ميكرومتر مثبطات الصخور (Y-27623) لأول 2 أيام.
9. قم بتحديث الوسيط كل 2-3 أيام. تأكد من أن الوسط دافئ لمنع تفكك المصفوفة الحساسة لدرجة الحرارة.

7. معالجة عضوي لتلطيخ جبل كامل

ملاحظة: قم بتغطية الأطراف والأنابيب بنسبة 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام لتجنب التصاق المواد العضوية بالبلاستيك. بالنسبة لأطراف الماصة ، يكفي أن تكون الماصة مرة أو مرتين لأعلى ولأسفل في محلول FBS / PBS بنسبة 10٪ قبل استخدام الطرف. بالنسبة للأنابيب ، املأ الأنبوب بنسبة 10٪ FBS / PBS ثم قم بإزالة المحلول.

1. قم بإزالة الوسط العضوي وأضف 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد إلى قباب المصفوفة. ضع الطبق على الثلج لمدة 5-10 دقائق.
2. ماصة لأعلى ولأسفل ونقل الحل إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 0.6 مل غير ملتصقة. أجهزة الطرد المركزي قريبا لمدة 30-60 ثانية عند 100 × جم للسماح للعضويات بالاستقرار في القاع.
   ملاحظة: السحب الزائد والطرد المركزي الطويل يكسر المواد العضوية ويعطل تفاعل الخلايا الليفية العضوية.
3. إزالة السائل الزائد وإضافة الثلج البارد PBS. أجهزة الطرد المركزي قريبا لمدة 30-60 ثانية عند 100 × جم للسماح للعضويات بالاستقرار في القاع.
4. قم بإزالة السائل الزائد وإصلاح العضو العضوي ب 200 ميكرولتر من الفورمالديهايد البارد 4٪ في محلول PBS لمدة 30 دقيقة على الجليد.
   تنبيه: الفورمالديهايد سام ويجب استخدامه دائما في غطاء دخان كيميائي. يجب دائما ارتداء قفازات النتريل ونظارات السلامة ومعاطف المختبر.
5. يؤدي تثبيت العضو العضوي إلى غرقها ، ولم تعد هناك حاجة إلى الطرد المركزي. دع الكائنات العضوية تغرق عن طريق وضع الأنبوب في وضع مستقيم وانتظر 2-3 دقائق ، وقم بإزالة الفورمالديهايد ، وأضف 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد لغسل الفورمالديهايد.
6. دع المواد العضوية تغرق ، وقم بإزالة PBS الزائد ، وأضف 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد طازج. دع الكائنات العضوية تغرق ، وقم بإزالة PBS الزائد ، وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر (5٪ مصل حمار عادي ، 1٪ BSA ، و 0.5٪ Triton X-100 في PBS). ضع الأنبوب على هزاز هزاز لمدة 60 دقيقة في RT.
   ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الحجب بين عشية وضحاها (O / N) عند 4 درجات مئوية.
7. دع الكائنات العضوية تغرق ، وقم بإزالة المخزن المؤقت المانع ، وأعد تعليق المواد العضوية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع بالأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد). احتفظ بالمواد العضوية على هزاز هزاز O / N عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: لتحسين تلطيخ البروتينات النووية أو البروتينات منخفضة التعبير أو الأجسام المضادة التي تظهر تلطيخا غير محدد ، يمكن زيادة وقت الحضانة لمدة 1 أو 2 أيام عند 4 درجات مئوية. يعد وضع المواد العضوية على هزاز الروك أمرا ضروريا لأنه يمنع الكائنات العضوية من التكتل معا ويزيد من كفاءة التلطيخ.
8. دع الكائنات العضوية تغرق ، وقم بإزالة مزيج الأجسام المضادة الأساسي ، واغسل المواد العضوية باستخدام 500 ميكرولتر من 0.02٪ Triton X-100 في PBS (0.02٪ Tx) لمدة 60 دقيقة في RT. كرر ثلاث مرات.
   ملاحظة: عند الحاجة إلى حضانة أطول للأجسام المضادة الأولية ، أضف خطوة غسيل مع 0.02٪ Tx في PBS O / N عند 4 درجات مئوية.
9. دع المواد العضوية تغرق ، وقم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل ، وأضف 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلورة في منع المخزن المؤقت O / N عند 4 درجات مئوية. بعد إضافة الأجسام المضادة الثانوية الفلورية ، احتفظ بالمواد العضوية في الظلام لتجنب تبييض الإشارة.
10. دع الكائنات العضوية تغرق ، وقم بإزالة مزيج الأجسام المضادة الثانوي ، واغسل الكائنات العضوية باستخدام 500 ميكرولتر من 0.02٪ Tx لمدة 60 دقيقة في RT. كرر ثلاث مرات.
11. قم بتلطيخ المواد العضوية بمحلول 200 ميكرولتر من DAPI (0.25 ميكروغرام / مل) للتلطيخ النووي إذا لزم الأمر. احتضان العينات لمدة 60 دقيقة في RT على شاكر الروك.
12. دع المواد العضوية تغرق ، وأزل محلول DAPI ، واغسل المواد العضوية في 500 ميكرولتر من PBS لمدة 15 دقيقة في RT. كرر ثلاث مرات.
13. دع الكائنات العضوية تغرق وتزيل كل السوائل الزائدة. أضف 10 ميكرولتر من محلول التطهير إلى الكائنات العضوية واحتضانها لمدة 15 دقيقة في RT.
    ملاحظة: محلول المقاصة لزج ، لذا اقطع الجزء الخارجي من طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر قبل سحب محلول المقاصة. يمكن إضافة المزيد من محلول المقاصة إذا تم استخدام فاصل أكبر للتصوير. يمكن استخدام محلول التركيب بدلا من محلول المقاصة عند عدم إزالة المواد العضوية. يقلل حل التطهير من الخلفية عند التصوير ويزيد من عمق التصوير.
14. ضع فاصل لزج على الوجهين 0.05 مم من 4 آبار على شريحة مجهرية. أضف 10 ميكرولتر من محلول المقاصة مع المواد العضوية في بئر واحدة وضع زلة غطاء أعلى الفاصل.
    ملاحظة: يمكن أيضا تركيب المواد العضوية دون استخدام فاصل. يحافظ الفاصل على شكل العضو سليما ويمنع تسطيح المواد العضوية.
15. احتفظ بالشريحة في RT O / N لمسح المواد العضوية. للتخزين طويل الأجل ، احتفظ بالشرائح عند 4 درجات مئوية. الحصول على الصور باستخدام نظام الفحص المجهري متحد البؤر.

Results

ينقسم المريء إلى طبقات مختلفة: ظهارة ، صفيحة بريوريا ، تحت المخاطية ، والعضلات الخارجية (الشكل 1 أ). تتواجد الخلايا الليفية داخل تحت المخاطية والصفيحة المخصوصة ، ويشار إليها باسم السدى. في هذا البروتوكول ، تتم إزالة العضلات الخارجية ميكانيكيا (الشكل 1B) ، مما لا يؤدي إلى فقدان الخلايا الليفية (Pdgfrα^H2BeGFP +) الموجودة في السدى (الشكل 1C). قبل التفكك ، يتم فصل الظهارة عن السدى مما ينتج عنه جزءان من الأنسجة (الشكل 1 ب). يوفر فصل الطبقتين الفرصة لزيادة وقت التفكك للطبقة الظهارية الأكثر قوة مقارنة بالطبقة اللحمية الهشة. وبهذه الطريقة ، يتم إنشاء بروتوكول عزل فعال ينتج عنه كل من الخلايا السلفية الظهارية القابلة للحياة وكذلك الخلايا الليفية اللحمية (الشكل 1 ب). يتم فرز الخلايا السلفية المريئية بناء على تعبيرها العالي INTEGRIN-β4 و E-CADHERIN (الشكل 1C ، D).

يمكن عزل المجموعات الفرعية من الخلايا الليفية باستخدام علامات مميزة. في هذا البروتوكول ، يتم توفير استراتيجية لعزل الخلايا الليفية بناء على علامات الخلايا الليفية شائعة الاستخدام PDGFRα و DPP4 (CD26). يظهر العزل إما بواسطة تعبير مراسل Pdgfrα^H2BeGFP أو الجسم المضاد DPP4 أن حوالي 50٪ من الخلايا المعزولة هي خلايا ليفية (الشكل 1E ، F). بالإضافة إلى ذلك ، فإن 70٪ من الخلايا الليفية PDGFRα + هي DPP4 + ، مما يشير إلى أنه يتم الحصول على مجموعة متداخلة إلى حد كبير ، ولكن ليست متطابقة. بعد عزل كل من مجموعات الخلايا الظهارية واللحمية ، يتم زراعة الخلايا السلفية المريئية إما بمفردها أو مع الخلايا الليفية في قبة مصفوفة. لدراسة مساهمة الخلايا الليفية في تكوين العضوي ، يتم الحفاظ على الثقافة المشتركة في وسط عامل نمو منخفض (الشكل 1G).

تشكل الخلايا السلفية المريئية عضويات في وجود EGF و NOGGIN و RSPO (ENR). إزالة NOGGIN وتقليل كمية RSPO (25 نانوغرام / ميكرولتر ؛ ER_منخفض) يكفي لمنع تكوين الأعضاء (الشكل 2 أ). ومن المثير للاهتمام ، أن إضافة الخلايا الليفية DPP4 + أو PDGFRα + إلى الخلايا السلفية المريئية في الوسط_{المنخفض} ER يعيد القدرة على تكوين الأعضاء ، مما يدل على وظيفة داعمة لكل من مجموعات الخلايا الليفية (الشكل 2A-D). يظهر تصور جين التحوير Pdgfrα^H2BeGFP أن الخلايا الليفية على اتصال وثيق بالخلايا السلفية الظهارية أثناء تكوين الأعضاء (الشكل 2 أ). في اليوم 6 ، لا تزال الخلايا الليفية Pdgfrα^H2BeGFP + موجودة بكثرة في الثقافة المشتركة. توجد الخلايا الليفية في جميع أنحاء القبة ، بالقرب من الكائنات العضوية وتلمسها (السهم الكامل) ، أو تعلق على الكائنات العضوية (رأس السهم; الشكل 2 د).

يظهر تلطيخ جبل كامل تمثيلا ثلاثي الأبعاد لتفاعل الخلايا الليفية مع المواد العضوية (الشكل 3). في حين أنه من الممكن تنفيذ بروتوكول التثبيت بالكامل دون استخدام محلول المقاصة ، إلا أنه يقلل من الشفافية واختراق الليزر للعضو العضوي (الشكل 3B ، z-view). عند تركيب المواد العضوية ، يساعد الفاصل في الحفاظ على مورفولوجيا العضوية. في المقابل ، يؤدي طلاء الغطاء مباشرة على المواد العضوية (بدون فاصل) إلى تسطيح الكائنات العضوية ويؤدي إلى فقدان بنية العضو (الشكل 3 أ ، ب).

تم العثور على كل من الخلايا الليفية DPP4 + و PDGFRα + ملفوفة حول الكائنات العضوية (الشكل 3C و Video1 و Video 2). يمكن تقييم تمايز عضويات المريء باستخدام علامات مختلفة. يوضح الشكل 4 أن بروتوكول التلوين المقدم مناسب للكيراتين الأسهل في تلطيخ (KRT14 / 13) بالإضافة إلى عوامل النسخ الأكثر صعوبة في البقع (TRP63 / KLF4). يولد بروتوكول الاستزراع المشترك عضويات ذات نمط تمايز مماثل ، كما هو موضح في الجسم الحي^13،14 وكما هو موضح في الكائنات العضوية المزروعة في وسط ENR. تشكل الخلايا السلفية KRT14 + أو TRP63 + الطبقة الخارجية والخلايا المتمايزة KRT13 + أو KLF4 + موجهة إلى الداخل.

يوفر هذا البروتوكول أداة لدراسة مكانة الخلايا الجذعية المريئية في المختبر وتصور التفاعل بين الكائنات العضوية والخلايا الليفية. من خلال تنفيذ بروتوكول لعزل الخلايا الليفية باستخدام الأجسام المضادة ، فإن الطريقة قابلة للتكيف ويمكن استخدامها لدراسة المجموعات الفرعية للخلايا الليفية دون الحاجة إلى الفئران المعدلة وراثيا.

الشكل 1: عزل الخلايا السلفية والمجموعات الفرعية للخلايا الليفية عن المريء. أ: نظرة عامة تخطيطية على الطبقات المختلفة في المريء. تحتوي السدى على الصفيحة المخصوصة وتحت المخاطية. (ب) نظرة عامة تخطيطية لبروتوكول العزل. تتم إزالة العضلات (العضلات الخارجية) ميكانيكيا باستخدام ملقط. يتم قطع المريء المتبقي وحضنه في التحلل الحراري لفصل الطبقة الظهارية عن السدى. يتم فصل الظهارة والسدى ، وفرمها ميكانيكيا ، وهضمها إنزيميا إلى معلقات خلية واحدة. ثم يتم تلطيخ الخلايا المنفصلة وإعدادها ل FACS. (ج) مقطع عرضي للمريء تم تجريده من العضلة الخارجية يظهر الخلايا الليفية Pdgfrα^H2BeGFP + في السدى. الخلايا الإيجابية المزدوجة INTEGRIN-β4 (ITGβ4) و E-CADHERIN (ECAD) هي الخلايا السلفية الظهارية للمريء. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (د) مخطط قياس التدفق الخلوي التمثيلي لعزل الخلايا الظهارية يوضح النسبة المئوية للخلايا الحية (اللوحة العلوية) من جميع الخلايا المفردة. تظهر اللوحة السفلية النسبة المئوية للخلايا السلفية ITGβ4 + ECAD + المعزولة (Prog.) من جميع الخلايا الحية. (ه) مخطط قياس التدفق الخلوي التمثيلي لعزل الخلايا اللحمية يوضح النسبة المئوية للخلايا الحية (اللوحة العلوية اليسرى). مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي توضح النسبة المئوية للخلايا الليفية المعزولة DPP4 + (Fibr. ؛ اللوحة اليمنى العليا) والخلايا الليفية Pdgfrα + (اللوحة اليسرى السفلية) لجميع الخلايا الحية. 70٪ من الخلايا الليفية Pdgfrα + هي أيضا DPP4 + (اللوحة اليمنى السفلية). (F) مخطط قياس التدفق الخلوي التمثيلي للسدى يظهر خلايا DPP4 + فقط (2.5٪) ، خلايا DPP4 + PDGFRα + (37.5٪) ، وخلايا PDGFRα + فقط (17.7٪). النسب المئوية لجميع الخلايا الحية. (ز) يتم طلاء الخلايا الظهارية فقط في قبة مصفوفة في وجود 50 نانوغرام / ميكرولتر EGF ، و 100 نانوغرام / ميكرولتر NOGGIN ، و 250 نانوغرام / ميكرولتر RSPO (ENR) ، أو مع الخلايا الليفية في وجود EGF وتركيز منخفض من RSPO (25 نانوغرام / ميكرولتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: النتائج التمثيلية للمزارع العضوية المشتركة. (أ) صور برايتفيلد توضح نمو الكائنات العضوية من اليوم 1 إلى اليوم 6. تظهر صور برايت فيلد مع الكائنات العضوية المزروعة بشكل مشترك مع الخلايا الليفية Pdgfrα^H2BeGFP + أيضا إشارة eGFP النووية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (B) صور برايتفيلد لقبة المصفوفة بأكملها في اليوم 6. يظهر العمود الأيسر الثقافات العضوية المشتركة التي نمت في وجود الخلايا الليفية Pdgfrα + في ER منخفضة أو E_منخفضةR _منخفضة المتوسطة. يظهر العمود الأوسط الثقافات العضوية المشتركة التي نمت في وجود الخلايا الليفية DPP4 + في ER منخفضة أو E_منخفضةR _منخفضة المتوسطة. يظهر العمود الأيمن الثقافات العضوية الأحادية المزروعة في وسط ENR. وسط ENR = EGF (50 نانوغرام / ميكرولتر) ، NOGGIN (100 نانوغرام / ميكرولتر) ، و RSPO (250 نانوغرام / ميكرولتر). _{ER منخفض} = EGF و 25 نانوغرام / ميكرولتر RSPO. Eمنخفض R_منخفض = 5 نانوغرام / ميكرولتر EGF و 25 نانوغرام / ميكرولتر RSPO. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ج) رسم بياني يوضح كفاءة تشكيل المواد العضوية (٪) (أي النسبة المئوية للخلايا التي تشكل المواد العضوية في ظروف الاستزراع المختلفة). تمثل كل نقطة قبة مصفوفة ويمثل الشريط متوسط جميع النقاط لكل حالة. (د) صورة برايتفيلد والفلورسنت لليوم 6 عضويات تمت زراعتها بشكل مشترك مع الخلايا الليفية Pdgfrα^H2BeGFP +. توجد الخلايا الليفية Pdgfrα^H2BeGFP + في جميع أنحاء القبة ، متصلة بالمواد العضوية (رأس السهم) ، وغير متصلة ولكنها على اتصال بالمواد العضوية (السهم الكامل). شريط المقياس = 250 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: بروتوكول تلطيخ كامل للتركيب لدراسة تفاعلات الخلايا الليفية والعضوية . (أ) نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول التألق المناعي المركب بأكمله. AB = الأجسام المضادة. (ب) صورة التألق المناعي لتلطيخ كامل غير مزيل يظهر انخفاضا في شفافية واختراق ضوء الليزر مقارنة بالكائنات العضوية التي تم تطهيرها. يؤدي عدم وجود فاصل إلى تسطيح العضو العضوي وفقدان التشكل العضوي. (ج) تظهر صور التركيب الكاملة للعضويات المستزرعة بشكل مشترك أسطح 3D للعضويات مع الخلايا الليفية VIMENTIN + (Fibr.) ملفوفة حول العضو العضوي وعلى اتصال وثيق به. تظهر المقاطع العرضية 3D والصور المستوية 2D تجويف العضوي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تكشف صور التركيب الكاملة عن تجمعات متميزة من الخلايا القاعدية وفوق القاعدية. (أ) تلطيخ كامل للعضويات أحادية ومشتركة الاستزراع باستخدام الخلايا الليفية Pdgfrα^H2BeGFP + التي تظهر الخلايا القاعدية KRT14 + في الطبقة الخارجية والخلايا فوق القاعدية المتمايزة KRT13 +. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) تلطيخ كامل للعضويات أحادية ومشتركة الاستزراع مع الخلايا الليفية Pdgfrα^H2BeGFP + التي تظهر الخلايا القاعدية TRP63 + في الطبقة الخارجية والخلايا فوق القاعدية المتمايزة KLF4 +. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: جدول يصف مكونات وسائط الاستزراع العضوي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

فيديو 1: Pdgfrα^H2BeGFP + خلية ليفية ملفوفة حول العضو العضوي وعلى اتصال وثيق به. يرافق الفيديو اللوحة العلوية من الشكل 3C. شريط المقياس في الشكل 3C هو 50 ميكرومتر ، ويبلغ قطر العضو ~ 120 ميكرومتر. يظهر VIMENTIN باللون الأبيض ، و E-CADHERIN باللون الأحمر ، و Pdgfrα^H2BeGFP باللون الأخضر ، و DAPI باللون الأزرق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو 2: الخلايا الليفية DPP4 + ملفوفة حول العضو العضوي وعلى اتصال وثيق به. يرافق الفيديو اللوحة السفلية من الشكل 3C. شريط المقياس في الشكل 3C هو 50 ميكرومتر ، ويبلغ قطر العضو ~ 120 ميكرومتر. يظهر VIMENTIN باللون الأبيض ، و E-CADHERIN باللون الأحمر ، و DAPI باللون الأزرق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

Discussion

ينشئ البروتوكول المقدم هنا نموذجا في المختبر للتحقيق في تفاعلات الخلايا الليفية الظهارية المريئية الوظيفية.

يتم فصل الطبقة الظهارية عن السدى ، مما يسمح ببروتوكول تفكك محسن لكل من المقصورة الظهارية واللحمية. على الرغم من تحسين بروتوكول التفكك الظهاري ، تظل كتل الأنسجة واضحة. يؤدي الشفط لأعلى ولأسفل بقوة كل 15 دقيقة إلى تقليل عدد وحجم الكتل بشكل كبير. تستخدم البروتوكولات الأخرى التربسين لزيادة فصل الطبقة الظهارية ^5,6. هنا ، لا ينصح باستخدام التربسين ، أو زيادة وقت التفكك ، لأن هذا يميل إلى انخفاض صلاحية الخلايا الظهارية وكفاءة تشكيل العضوية. على عكس الظهارة ، يتم فصل السدى بسهولة ، وينتج عن 30 دقيقة في محلول التفكك تعليق أحادي الخلية مع ~ 90٪ من صلاحية الخلايا الليفية (الشكل 1E). يؤدي استبعاد خطوة الفصل الظهاري الفموي في البروتوكول إلى زيادة وقت التفكك بشكل كبير ، مما يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا الليفية وانخفاض إنتاجية الخلايا الظهارية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر فصل الظهارة عن السدى فرصة لتحديد أعداد الخلايا لكل مجموعة وخلط الخلايا الظهارية والخلايا الليفية من خطوط الفئران المختلفة عند إعداد الثقافات المشتركة.

دراسة وظيفة الخلايا الليفية على نمو الأعضاء هي طريقة شائعة الاستخدام في بيولوجيا الخلايا الجذعية ⁹،¹⁰،¹¹،^15،16. وسائط الاستزراع المشترك الراسخة إما DMEM مكملة بمصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (FCS) 9,15 أو عامل نمو متوسط^{منخفض 10,16}. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام الوسط المختزل لعامل النمو لتقليد الظروف في مكانة الخلايا الجذعية في الجسم الحي ، حيث تكون الخلايا الليفية هادئة إلى حد كبير. FCS هو مصل غني بعامل النمو يؤدي إلى تنشيط وتكاثر الخلايا الليفية في الثقافات المشتركة ، ومن المحتمل أن يتوافق مع حالة خلية ليفية متميزة عن الحالة في الجسم الحي. من خلال استبعاد FCS وتقليل عوامل النمو ، بحيث لا يدعم الوسط وحده (_{ER low}) نمو الأعضاء ولا يحفز تكاثر الخلايا الليفية ، فمن الممكن عزل تأثير الخلايا الليفية على نمو العضوي. في هذه الوسيلة ، تتم إزالة NOGGIN وتقليل RSPO إلى الحد الأدنى (10٪ RPSO). وقد ثبت أن كلا من NOGGIN و RSPO ضروريان لنمو المريء^{العضوي 6}. تم الاحتفاظ ب EGF في وسط الاستزراع المشترك ، لأنه لا يدعم النمو العضوي في حد ذاته. ومع ذلك ، فإن الخلايا الليفية قادرة أيضا على دعم نمو الأعضاء في وسط منخفض EGF (E lowR_low; الشكل 2 ب ، د).

لا يمكن الحفاظ على الثقافات العضوية المشتركة من خلال المرور حيث يتم فقدان الخلايا الليفية أثناء التربسين. ومع ذلك ، تم تضمين تمرير العضوي في البروتوكول حيث يمكن الحفاظ على عضويات المريء وتوسيعها واستخدامها لمزيد من التجارب كمزارع أحادية. يمكن استخدام المواد العضوية المارة من الثقافات الأحادية لإنشاء مزارع مشتركة مع الخلايا الليفية المعزولة حديثا. عيب استخدام الخلايا الأولية هو عدد الفئران اللازمة لإنشاء ثقافات عضوية مشتركة متعددة. عند التركيز على مجموعات فرعية صغيرة من الخلايا الليفية ، يكون عدد الثقافات المشتركة التي تم الحصول عليها محدودا. في بروتوكولات أخرى ، يتم توسيع الخلايا الليفية أولا في الثقافة قبل استخدامها لإعداد مزارع عضوية^{مشتركة 10}. ومع ذلك ، فإن الخلايا الليفية تغير التشكل والهوية أثناء المرور ، كما هو موضح باستخدام الجلد الأساسي والخلايا الليفية القلبية^17,18. يؤدي تمرير 2D التقليدي للخلايا الليفية المريئية إلى كل من التشكل والتغيرات الظاهرية ، مما يدل على أن إثراء الخلايا الليفية في المختبر غير مناسب للثقافات المشتركة التي تهدف إلى التكاثر الظاهري لمكانة الخلايا الجذعية الذاتية.

يوفر تلطيخ جبل كامل أداة للحفاظ على وتصور التفاعل بين الخلايا الليفية والعضوية. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أنه لن تحتوي جميع الكائنات العضوية على خلايا ليفية مرتبطة بها مباشرة ، فإن معظم الكائنات العضوية على اتصال بالخلايا الليفية (انظر الشكل 2C). للحفاظ على تفاعلات الخلايا الليفية الظهارية ، من المهم التعامل مع المواد العضوية بعناية وتجنب السحب القوي ، والدوامة ، والغزل عالي السرعة. التثبيت الأمثل مهم للحفاظ على بنية الأنسجة 3D ، وكذلك الحفاظ على مضان الذاتية. يكفي التثبيت لمدة 30 دقيقة للاحتفاظ بإشارة H2BeGFP وهو مثالي للأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول ، ولكن هذا قد يختلف بين الفلوروفورات والأجسام المضادة المستخدمة. إزالة المواد العضوية يقلل من تشتت الضوء ويحسن التصور لهيكل 3D بأكمله بشكل كبير. نظرا لأن المواد العضوية صغيرة ، فإن المقاصة سهلة وسريعة. ومع ذلك ، فإن تصوير الكائنات العضوية الكاملة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر للمسح بالليزر يمكن أن يستغرق وقتا طويلا ، حيث يجب عمل العديد من مداخن Z. يمكن استخدام المجاهر متحدة البؤر ، مثل القرص الدوار ، لتقليل وقت التصوير.

بشكل عام ، توفر عضويات المريء التي تزرع في وجود الخلايا الليفية أداة قيمة لفهم جوانب مكانة الخلايا الجذعية المريئية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر تطهير التثبيت الكامل طريقة يمكن الوصول إليها لتصور التفاعل بين الخلايا الليفية والمواد العضوية.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
مكمل B-27 (50X) ، Thermo	Fisher (Gibco)	الخالي من المصل 17504001
Corning   ؛ Matrigel  عامل النمو المخفض (GFR) مصفوفة الغشاء القاعدي	فيشر 356231
ثنائي ميثيل سلفوكسيد	سيجما ألدريتش	276855-100 مل
DMEM / F-12	ثيرمو فيشر (جيبكو)	11320074
DPBS	ثيرمو فيشر (جيبكو)	14190250
مصل الأبقار الجنيني	سيجما ألدريتش	F7524
جلوتا ماكس مكمل	حراري فيشر (جيبكو)	35050061
HBSS ، خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم ، خال من الفينول الأحمر	ثيرمو فيشر (جيبكو)	14175-129
مصل الحمار العادي	جاكسون إيمون	017-000-121
البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) ثيرمو	فيشر (جيبكو)	15140122
محلول تريتون X-100	ميرك	93443-100 مل
التربسين EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمر	ثيرمو فيشر (جيبكو)	25200-056
< قوي > المواد الكيميائية والببتيدات والبروتينات المؤتلفة< / قوي >
DAPI Solution	Thermo Fisher	62248
محلول التفكك: 0.25 مجم / مل Liberase TM ، 0.25 مجم / مل Dnase في HBSS
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
الفورمالديهايد ، 37٪ ، مع 10-15٪ ميثانول	سيجما ألدريتش	252549-1L
Liberase	Sigma-Aldrich	5401127001
N-Acetyl-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-25G
Noggin murine	Peprotech	250-38
RapiClear 1.47	SunJin Lab	#RC147001
بروتين EGF المؤتلف للفأر ، CF	R & أنظمة D	2028-EG-200
R-spondin-1 الفئران	Peprotech	315-32
SYTOX الأزرق خلية ميتة وصمة عار	ثيرمو فيشر	S34857
Thermolysin	Sigma-Aldrich	T7902-25MG
Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد	سيجما-ألدريتش	Y0503-5MG
strong>Plastic & الأواني الزجاجية < / قوية >
مصافي الخلايا المعقمة من Corning 40um	VWR	15360801
مصافي الخلايا المعقمة Corning 70um	VWR	431751
Menzel Deckgl & auml ؛ ser/ غطاء زلات	Thermo Fisher	Q10143263NR15
أنبوب تفاعل SafeSeal ، 1.5 مل ، PP	Sarstedt	72.706
Snap Cap أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الاحتفاظ 0.6 مل	Thermo Fisher	3446
SuperFrost Slides	VWR	631-9483
Tools< / strong>
0.05 مم 4 بئر دائري iSpacer	SunJin Lab	#IS204
Dumont # 5 ملقط ، طرف علم الأحياء	FST	11252-20
ImmEdge Pen	VectorLaboratories	H-4000
مقص زنبركي بزاوية إلى طرف كروي جانبي 8 مم حافة القطع	FST	15033-09
Instruments< / قوي >
مجهر متحد البؤر Stellaris 5	تشريح لايكا
ZEISS Stemi 305	Zeiss
FACS ARIA III	BD Biosciences
contringed antibodies for FACS< / strong>
Alexa Fluor 647 الأجسام المضادة CD104 المضادة للفأر استنساخ: 346-11A	123608	123608
APC المضاد للفأر CD26 (DPP-4) الأجسام المضادة	H194-112	H194-112
PE / Cy7 الأجسام المضادة للفأر / البشرية CD324 (E-Cadherin)	147310	147310
<قوية >أجسام مضادة للتألق المناعي < / قوي >
CD104 (ß ؛ -integrin 4) استنساخ: 346-11A	BioLegend	553745
السيتوكيراتين 14	أجسام مضادة أكرس (AbD Serotec)	BP5009
استنساخ السيتوكيراتين13 : EPR3671	abcam	ab92551
E-cadherin (CD324) استنساخ: 2.40E + 11	تقنية إشارات	الخلية 3195
الكيراتين 5 أجسام مضادة للدجاج متعدد النسيلة ، منقى استنساخ: Poly9059	BioLegend	905901
p63 استنساخ: 4a4	abcam	ab735
استنساخ مضاد مؤتلف مضاد مضاد ل KLF4: EPR20753-25	أبكام	AB214666
فيمنتين	سيجما-ألدريتش	AB5733
<قوي>الأجسام المضادة الثانوية < / الأجسام المضادة للأنواع
الحمير * مع الفلوروفور المفضل	جاكسون إيمونو