بروتوكول لتقييم وقياس أمراض ظهارة الشبكية المصطبغة في نماذج الفئران من التنكس البقعي المرتبط بالعمر

Michael Landowski; Samuel Grindel; Ying Hao; Sakae Ikeda; Catherine Bowes Rickman; Akihiro Ikeda

doi:10.3791/64927

Method Article

بروتوكول لتقييم وقياس أمراض ظهارة الشبكية المصطبغة في نماذج الفئران من التنكس البقعي المرتبط بالعمر

DOI:

10.3791/64927

⸱

March 10th, 2023

Michael Landowski¹^,² , Samuel Grindel¹ , Ying Hao³ , Sakae Ikeda¹^,² , Catherine Bowes Rickman³^,⁴ , Akihiro Ikeda¹^,²

¹Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, ²McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, ³Department of Ophthalmology, Duke University, ⁴Department of Cell Biology, Duke University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تكون نماذج الماوس أدوات مفيدة للتحقيق في بيولوجيا ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE). لقد ثبت أن الفئران يمكن أن تطور مجموعة من أمراض RPE. هنا ، نصف بروتوكول التنميط الظاهري لتوضيح وقياس أمراض RPE في الفئران باستخدام الضوء وإلكترون الانتقال والمجهر متحد البؤر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو اضطراب شبكي موهن لدى السكان المسنين. من المعتقد على نطاق واسع أن الخلل الوظيفي في ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) هو حدث بيولوجي مرضي رئيسي في AMD. لفهم الآليات التي تؤدي إلى خلل وظيفي في RPE ، يمكن للباحثين استخدام نماذج الماوس. لقد ثبت من خلال الدراسات السابقة أن الفئران يمكن أن تصاب بأمراض RPE ، والتي لوحظ بعضها في عيون الأفراد الذين تم تشخيص إصابتهم ب AMD. هنا ، نصف بروتوكول التنميط الظاهري لتقييم أمراض RPE في الفئران. يتضمن هذا البروتوكول تحضير وتقييم المقاطع العرضية للشبكية باستخدام المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني النافذ ، بالإضافة إلى حوامل RPE المسطحة بواسطة المجهر متحد البؤر. نقوم بتفصيل الأنواع الشائعة من أمراض RPE الفئران التي لوحظتها هذه التقنيات وطرق تحديدها من خلال طرق غير متحيزة للاختبار الإحصائي. كدليل على المفهوم ، نستخدم بروتوكول التنميط الظاهري RPE هذا لتحديد أمراض RPE التي لوحظت في الفئران التي تفرط في التعبير عن البروتين عبر الغشاء 135 (Tmem135) والفئران البرية القديمة من النوع C57BL / 6J. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو تقديم طرق التنميط الظاهري RPE القياسية مع تقييمات كمية غير متحيزة للعلماء الذين يستخدمون نماذج الفئران من AMD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو مرض شائع يصيب السكان الذين تزيد أعمارهم عن 55^{عاما 1}. يعتقد العديد من الباحثين أن الخلل الوظيفي داخل ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) هو حدث بيولوجي مرضي مبكر وحاسم في AMD². RPE عبارة عن طبقة أحادية من الخلايا المستقطبة المكلفة بالحفاظ على توازن المستقبلات الضوئية المجاورة والأوعية الدموية المشيمية³. توجد مجموعة متنوعة من النماذج للتحقيق في الآليات المرتبطة بالمرض داخل RPE ، بما في ذلك نماذج زراعة الخلايا⁴،⁵ والفئران⁶^،⁷^،⁸.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة ويسكونسن ماديسون ، وهي متوافقة مع بيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.

1. تقييم RPE الماوس بواسطة المجهر الضوئي

اصنع عازلا مثبتا يحتوي على تركيز نهائي قدره 2٪ بارافورمالدهيد و 2٪ جلوتارالدهيد في درجة حرارة الغرفة (RT) في زجاجة زجاجية.
ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول ، على الأكثر ، 14 مل من المخزن المؤقت المثبت لكل ماوس.
تنبيه: بارافورمالدهيد والجلوتارالدهيد من المواد الخطرة. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية عند العمل مع هذه المواد.
قم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر إكمال بروتوكول التنميط الظاهري RPE الموضح في هذه المقالة تحليلا كميا لتشوهات RPE الهيكلية التي لوحظت بشكل شائع في نماذج الماوس من AMD. لتأكيد فعالية هذا البروتوكول ، استخدمناه في الفئران المعروفة بعرض أمراض RPE ، بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا التي تفرط في التعبير عن WT Tmem135 مدفوعة بمروج الدجاج بيتا أكتين (Tmem135 TG) 30 والفئران C57BL / 6J ^31,32. الهدف من هذه التجارب هو إظهار نتائج تمثيلية يمكن الحصول عليها با.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة ، قدمنا بروتوكول التنميط الظاهري لتقييم أمراض RPE الهيكلية لنماذج الماوس. وصفنا الخطوات المطلوبة لمعالجة العيون لتقنيات التصوير المختلفة بما في ذلك الضوء وإلكترون الإرسال والمجهر متحد البؤر ، بالإضافة إلى تحديد كمية الأمراض النموذجية التي لوحظت عبر طرق التصوير هذه. لقد أثبتنا فعالية بروتوكول التنميط الظاهري RPE الخاص بنا من خلال فحص Tmem135 TG والفئران WT البالغة من العمر 24 شهرا ، لأن هذه الفئران تظهر أمراض RPE³⁰،³¹^،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى مؤلفي هذا البروتوكول أي إفصاحات وتضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا ساتوشي كينوشيتا ومبادرات البحوث الانتقالية في مختبر علم الأمراض بجامعة ويسكونسن (UW) لإعداد أنسجتنا للفحص المجهري الضوئي. يتم دعم هذا النواة من قبل قسم علم الأمراض والطب المخبري بجامعة ويسكونسن ، ومركز سرطان الكاربون بجامعة ويسكونسن (P30 CA014520) ، ومكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (S10OD023526). تم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر في UW Biochemistry Optical Core ، والذي تم إنشاؤه بدعم من قسم UW للكيمياء الحيوية. تم دعم هذا العمل أيضا بمنح من المعهد الوطني للعيون (R01EY022086 إلى A. Ikeda; R01EY031748 إلى سي باوز ريكمان ؛ P30EY016665 إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية في UW ؛ P30EY005722 إلى مركز ديوك للعيون ؛ المعاهد الوطنية للصحة T32EY027721 إلى ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 م عازلة Cacodylate pH7.2	PolyScientiifc R& D Company	S1619
100 سعة صندوق			مطلوب اثنين لهذا البروتوكول (واحد ل H& شرائح ملطخة باللون الإلكتروني وواحدة لحوامل RPE المسطحة.)
100٪ إيثانول	MDS Warehouse	2292-CASE	لصنع محاليل الإيثانول المخففة في هذا البروتوكول.
1-Way Stopcock ، 2 أنثى Luer Locks	Qosina	11069
1x محلول عازلة الفوسفات (PBS) يمكن			استخدام 1x PBS الجاهزة في هذا البروتوكول.
2.0 مل الأنابيب الدقيقة	Genesee Scientific ؛	24-283-LR
24 تجويف تضمين كبسولة بديل العفن	علوم المجهر الإلكتروني	70165
24 بوصة أنابيب PVC مع نهايات لور	فيشر العلمي	NC1376778
400 شبكة جيلدر رقيقة شريط شبكة مربعة شبكات علوم	المجهر الإلكتروني	T400-Cu
95٪ مستودع الإيثانول	MDS	2293-CASE
وسادات سفلية ماصة مع حاجز رطوبة مقاوم للماء (23 بوصة × 24 بوصة)	VWR	56616-031
قابل للتعديل 237 مل & nbsp; زجاجة رذاذ	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 الحمار المترافق المضاد للأرانب IgG & nbsp ؛	ثيرمو فيشر العلمي	A-21206
رقائق
BD الدقة الانزلاق 19 مقياس حقنة إبرة	سيجما-الدريتش & nbsp ؛	Z192546
ملقط السرخس. منحني; مسننات متقاطعة دقيقة. 4 "طول ، 1 مم عرض الطرف	Roboz أداة جراحية	RS-5211	تعرف باسم الملقط المنحني في هذا البروتوكول.
فرشاة شعر الإبل	علوم المجهر الإلكتروني	65575-02
غرفة القتل الرحيم
أكسيد الكربون ثاني أكسيد الكربون مقياس
ثاني أكسيد الكربون خزان
قسطالوي شقة تمديد المشابك	فيشر العلمية	05-769-7Q
دعم قاعدة على شكل حرف L من	الحديد الزهر فيشر Scientific ؛	11-474-207
		Cell Profir	متاح للتنزيل: https://cellprofiler.org/releases
Clear طلاء الأظافر	علوم المجهر الإلكتروني	72180
شرائح مجهر Colorfrost Lavender	VWR	10118-956
الكمبيوتر
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
المقطر H_{2< / sub>0}			من نظام تنقية Milli-Q في هذا البروتوكول.
ملاقط دومونت رقيقة تلميح ؛ النمط # 55	أداة Roboz الجراحية	RS-4984	تعرف باسم الملقط ذي الرؤوس الدقيقة في هذا البروتوكول ، و 3 مطلوبة لهذا البروتوكول (اثنان للتشريح وواحد لمعالجة المجهر الإلكتروني).
شبكة المجهر الإلكتروني	علوم المجهر	الإلكتروني 71147-01
EPON 815	علوم المجهر الإلكتروني	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking	Yellow Dye Fisher Scientific	22050460	يرجى اتباع بروتوكول الشركة المصنعة عند استخدام صبغة علامات الأنسجة.
Epredia تصاعد وسائل الإعلام	فيشر Scientific	22-110-610	استخدام لتركيب اليد & الشرائح الإلكترونية.
سلسلة إضاءة الألياف الضوئية Mi-150 ، مصدر ضوء الهالوجين 150 واط	مصدر ضوء دولان جينر إندستريز	Mi-150	لتشريح المجهر.
		Fiji ImageJ	متاح للتحميل: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook	Connector Thermo Scientific	14-666-18Q
الدخان
الجلوتارالديهايد 2.5٪ في عازلة الفوسفات ، درجة الحموضة 7.4 ، 32٪	علوم المجهر الإلكتروني	16537-05
JEM-1400 مجهر إلكتروني ناقل الحركة (JEOL) مع مختبر كاميرا
منضدة شاكر			هناك حاجة إلى اثنين لهذه التجارب. يجب أن يكون أحدهما في درجة حرارة الغرفة بينما يجب أن يكون الآخر في غرفة باردة 4 درجات مئوية.
تسميات علامة الليزر بالتبريد علوم	المجهر	77564-05
المجهر	لسترات الرصاص	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	استخدم هذه الأغطية للحوامل المسطحة RPE لأنها ذات حواف مرتفعة وتستوعب سمك RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical	Instrument RS-5600	المعروف باسم مقص التشريح الدقيق في البروتوكول.
الميثانول	فيشر العلمية	A412-4
Mice			يمكن أن يعمل أي طراز ماوس AMD وعناصر التحكم الخاصة به مع هذا البروتوكول.
مقص تشريح صغير. النسخة القياسية منحني; نقاط حادة. طول الشفرة 24 مم ؛ 4.5 "الطول الكلي	Roboz أداة جراحية	RS-5913	المعروفة باسم المقص المنحني في هذا البروتوكول.
رفوف مايكروسوفت إكسل
Microtube نيكون
A1RS مجهر متحد البؤر مصل
الحمار العادي	SouthernBiotech	0030-01
رقم 11 شفرات مشرط معقمة يمكن التخلص	منها VWR	21909-380
رابع أكسيد الأوزميوم ؛	علوم المجهر الإلكتروني	19150
بارافورمالدهايد ، 32٪	علوم المجهر الإلكتروني	15714-S
طبق بتري قلم
	رصاص VWR & nbsp ؛	21909-380
			الماصات
الماصات
متعدد النسيلة المضاد للأجسام المضادة ZO-1	Thermo Fisher Scientific	402200
علوم المجهر	الإلكتروني لأكسيد البروبيلين	20412
شفرة الحلاقة	VWR	10040-386
صينية ضحلة لتروية
شاندون إيوسين Y كحولي	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip أسود دائم ماركر	دبابيس	642736
رف منزلق لتلوين	Grainger	49WF31
غطاء زجاجي تربيع	زلات فيشر Scientific ؛	12-541B
طبق تلطيخ مع غطاء	Grainger	49WF30	Need 15 لليد & إجراء تلطيخ ه.
استهداف جميع البلاستيك يمكن التخلص منه Luer-Slip حقنة 50 مل	ثرمو علمية	S7510-50	استخدم برميل المحقنة فقط.
الموقت	فيشر	1464917
اليورانيل	خلات علوم المجهر الإلكتروني	22400
فرن
Vectashield تصاعد مختبرات ناقلات متوسطة		H-1000	تستخدم لتركيب RPE المسطحة حوامل.
زيلين	فيشر العلمية	22050283
Zeiss Axio Imager 2 مجهر			يتمتع هذا المجهر بالقدرة على إنشاء صور مخيطة 20x. إذا لم يكن المجهر الضوئي يمتلك هذه السعة ، فقم بالتقاط صور لشبكية العين بأكملها متداخلة قليلا مع بعضها البعض. استخدم Adobe Photoshop لتجميع هذه الصور معا. يرجى الرجوع إلى أدلة برنامج Adobe Photoshop لخياطة الصور.
زايس ستيمي 2000 تشريح المجهر	علوم المجهر الإلكتروني	65575-02

الشريحة يمكن استخدام الألومنيوملثانيتدفق حامل برنامج تم استخدام الماء حامل الراتنج برنامج غطاء ORIUS (1000) CCD الإلكتروني علوم الإلكتروني: أطراف الفأرفراغ ضوئي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
Bhutto, I., Lutty, G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

بروتوكول لتقييم وقياس أمراض ظهارة الشبكية المصطبغة في نماذج الفئران من التنكس البقعي المرتبط بالعمر

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles