Method Article

بروتوكول لتقييم وقياس أمراض ظهارة الشبكية المصطبغة في نماذج الفئران من التنكس البقعي المرتبط بالعمر

DOI:

10.3791/64927

⸱

March 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تكون نماذج الماوس أدوات مفيدة للتحقيق في بيولوجيا ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE). لقد ثبت أن الفئران يمكن أن تطور مجموعة من أمراض RPE. هنا ، نصف بروتوكول التنميط الظاهري لتوضيح وقياس أمراض RPE في الفئران باستخدام الضوء وإلكترون الانتقال والمجهر متحد البؤر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو اضطراب شبكي موهن لدى السكان المسنين. من المعتقد على نطاق واسع أن الخلل الوظيفي في ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) هو حدث بيولوجي مرضي رئيسي في AMD. لفهم الآليات التي تؤدي إلى خلل وظيفي في RPE ، يمكن للباحثين استخدام نماذج الماوس. لقد ثبت من خلال الدراسات السابقة أن الفئران يمكن أن تصاب بأمراض RPE ، والتي لوحظ بعضها في عيون الأفراد الذين تم تشخيص إصابتهم ب AMD. هنا ، نصف بروتوكول التنميط الظاهري لتقييم أمراض RPE في الفئران. يتضمن هذا البروتوكول تحضير وتقييم المقاطع العرضية للشبكية باستخدام المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني النافذ ، بالإضافة إلى حوامل RPE المسطحة بواسطة المجهر متحد البؤر. نقوم بتفصيل الأنواع الشائعة من أمراض RPE الفئران التي لوحظتها هذه التقنيات وطرق تحديدها من خلال طرق غير متحيزة للاختبار الإحصائي. كدليل على المفهوم ، نستخدم بروتوكول التنميط الظاهري RPE هذا لتحديد أمراض RPE التي لوحظت في الفئران التي تفرط في التعبير عن البروتين عبر الغشاء 135 (Tmem135) والفئران البرية القديمة من النوع C57BL / 6J. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو تقديم طرق التنميط الظاهري RPE القياسية مع تقييمات كمية غير متحيزة للعلماء الذين يستخدمون نماذج الفئران من AMD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو مرض شائع يصيب السكان الذين تزيد أعمارهم عن 55عاما 1. يعتقد العديد من الباحثين أن الخلل الوظيفي داخل ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) هو حدث بيولوجي مرضي مبكر وحاسم في AMD2. RPE عبارة عن طبقة أحادية من الخلايا المستقطبة المكلفة بالحفاظ على توازن المستقبلات الضوئية المجاورة والأوعية الدموية المشيمية3. توجد مجموعة متنوعة من النماذج للتحقيق في الآليات المرتبطة بالمرض داخل RPE ، بما في ذلك نماذج زراعة الخلايا4،5 والفئران6،7،8. وقد وصف تقرير حديث البروتوكولات الموحدة ومعايير مراقبة الجودة لنماذج زراعة الخلاياRPE 4 ، ومع ذلك لم يحاول أي تقرير توحيد التنميط الظاهري ل RPE في نماذج الماوس. في الواقع ، تفتقر العديد من المنشورات حول نماذج الماوس من AMD إلى وصف كامل ل RPE أو القياس الكمي لأمراض RPE فيها. الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقديم طرق التنميط الظاهري RPE القياسية مع تقييمات كمية غير متحيزة للعلماء الذين يستخدمون نماذج الفئران AMD.

لاحظت المنشورات السابقة وجود العديد من أمراض RPE في الفئران من خلال ثلاث تقنيات تصوير. على سبيل المثال ، يسمح الفحص المجهري الضوئي للباحثين بعرض التشكل الإجمالي لشبكية الفئران (الشكل 1 أ) واكتشاف أمراض RPE مثل ترقق RPE والفراغ والهجرة. يتجلى ترقق RPE في نموذج ماوس AMD من خلال انحراف في ارتفاع RPE عن عناصر التحكم الخاصة بكل منها (الشكل 1B). يمكن تقسيم فراغ RPE إلى فئتين منفصلتين: الفراغ الدقيق (الشكل 1C) والفراغ الكبير (الشكل 1D). يتم تلخيص الفراغ الدقيق RPE من خلال وجود فجوات في RPE لا تؤثر على ارتفاعه الكلي ، في حين يشار إلى الفراغ الكبير من خلال وجود فجوات تبرز في الأجزاء الخارجية من المستقبلات الضوئية. تتميز هجرة RPE بالمجموع البؤري للصبغة فوق الطبقة الأحادية RPE في مقطع عرضي للشبكية (الشكل 1E). وتجدر الإشارة إلى أن خلايا RPE المهاجرة في عيون المتبرعين بالتنكس البقعي المرتبط بالعمر تظهر تفاعلا مناعيا مع علامات الخلايا المناعية ، مثل مجموعة التمايز 68 (CD68) 9 ، ويمكن أن تمثل الخلايا المناعية التي تبتلع حطام RPE أو RPE التي تخضع للتمايز9. يمكن أن تسمح تقنية تصوير أخرى تسمى المجهر الإلكتروني النافذ للباحثين بتصور البنية التحتية ل RPE وغشاءها القاعدي (الشكل 2 أ). يمكن لهذه التقنية تحديد رواسب RPE الفرعية السائدة في الفئران ، والمعروفة باسم الرواسب الصفحية القاعدية (BLamD) (الشكل 2B)10. أخيرا ، يمكن أن يكشف الفحص المجهري متحد البؤر عن بنية خلايا RPE من خلال تصوير حوامل مسطحة RPE (الشكل 3 أ). يمكن لهذه الطريقة الكشف عن تشوه RPE ، وهو انحراف RPE عن شكل قرص العسل الكلاسيكي (الشكل 3B). يمكنه أيضا اكتشاف تعدد نوى RPE ، وجود ثلاث نوى أو أكثر داخل خلية RPE (الشكل 3C). للحصول على ملخص لأنواع أمراض RPE الموجودة في نماذج الماوس AMD الحالية ، نحيل الباحثين إلى هذه المراجعات من الأدبيات 6,7.

يجب أن يكون الباحثون الذين يدرسون AMD على دراية بمزايا وعيوب استخدام الفئران للتحقيق في أمراض RPE قبل بروتوكول التنميط الظاهري. الفئران مفيدة بسبب عمرها القصير نسبيا وفعاليتها من حيث التكلفة ، فضلا عن قابليتها للتلاعب الجيني والدوائي. تظهر الفئران أيضا تغيرات تنكسية RPE ، بما في ذلك هجرة RPE ، وخلل التشوه ، وتعدد النوى ، والتي لوحظت في عيون المتبرعين AMD 11،12،13،14،15،16،17 ؛ هذا يشير إلى أن آليات مماثلة قد تكمن وراء تطور أمراض RPE هذه في الفئران والبشر. ومع ذلك ، هناك اختلافات رئيسية تحد من قابلية ترجمة دراسات الفئران إلى AMD البشري. أولا ، لا تحتوي الفئران على بقعة ، وهي منطقة متميزة تشريحيا من شبكية العين البشرية ضرورية لحدة البصر التي تتأثر بشكل تفضيلي في AMD. ثانيا ، لا تظهر بعض أمراض RPE في الفئران ، مثل ترقق RPE والفراغ ، عادة في عيون المتبرعين ب AMD18. ثالثا ، لا تصاب الفئران بدروسين ، وهي السمة المميزة لعلم الأمراض المرتبط بالعمر19. Drusen عبارة عن رواسب تحتوي على الدهون والبروتين مع عدد قليل جدا من بروتينات الغشاء القاعدي التي تتشكل بين الصفيحة القاعدية RPE وطبقة الكولاجين الداخلية لغشاء Bruch (BrM) 19. يختلف Drusen عن BLamD ، وهو الرواسب الفرعية الشائعة في الفئران ، في كل من تكوينها وموقعها التشريحي. BLamDs هي تشوهات غنية بالمصفوفة خارج الخلية تعتمد على العمر والإجهاد والتي تتشكل بين الصفيحة القاعدية RPE ل BrM والطيات القاعدية ل RPE20. ومن المثير للاهتمام ، أن BLamDs لها تركيبة ومظهر بروتين مماثل في كل من الفئران والبشر6،10،21. تشير الأعمال الحديثة إلى أن BLamDs قد تعمل في البيولوجيا المرضية ل AMD من خلال التأثير على تقدم AMD إلى مراحله اللاحقة18,22 ؛ وبالتالي ، قد تمثل هذه الرواسب RPE المريضة في شبكية الفأر. تعد معرفة هذه الفوائد والقيود أمرا بالغ الأهمية للباحثين المهتمين بترجمة النتائج من دراسات الفئران إلى AMD.

في هذا البروتوكول ، نناقش طرق تحضير العيون للضوء ، وإلكترون الإرسال ، والمجهر متحد البؤر لتصور أمراض RPE. كما وصفنا كيفية قياس أمراض RPE بطريقة غير متحيزة للاختبار الإحصائي. كدليل على المفهوم ، نستخدم بروتوكول التنميط الظاهري RPE للتحقيق في أمراض RPE الهيكلية التي لوحظت في البروتين عبر الغشاء 135- (Tmem135) الفئران المفرطة التعبير والفئران من النوع البري (WT) C57BL / 6J. باختصار ، نهدف إلى وصف منهجية التنميط الظاهري لتوصيف RPE في نماذج الماوس AMD ، حيث لا توجد حاليا بروتوكولات قياسية متاحة. قد لا يجد الباحثون المهتمون بفحص وقياس أمراض المستقبلات الضوئية أو المشيمية ، والتي تتأثر أيضا في نماذج الفئران AMD ، هذا البروتوكول مفيدا لدراساتهم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة ويسكونسن ماديسون ، وهي متوافقة مع بيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.

1. تقييم RPE الماوس بواسطة المجهر الضوئي

  1. اصنع عازلا مثبتا يحتوي على تركيز نهائي قدره 2٪ بارافورمالدهيد و 2٪ جلوتارالدهيد في درجة حرارة الغرفة (RT) في زجاجة زجاجية.
    ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول ، على الأكثر ، 14 مل من المخزن المؤقت المثبت لكل ماوس.
    تنبيه: بارافورمالدهيد والجلوتارالدهيد من المواد الخطرة. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية عند العمل مع هذه المواد.
  2. قم بإعداد نظام تروية تغذية بالجاذبية على وسادة سفلية ماصة للتروية القلبية في غطاء الدخان (الشكل التكميلي 1 أ).
    1. ضع 40 مل من المخزن المؤقت المثبت في برميل المحقنة لنظام التروية (الشكل التكميلي 1 ب).
    2. أدر الصمام حتى يصبح موازيا لخط الأنبوب للسماح للمخزن المؤقت بالتدفق عبر خط الأنبوب (الشكل التكميلي 1C). اغسل الخط بمخزن مؤقت حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء من الخط.
    3. أدر الصمام حتى يصبح عموديا على خط الأنبوب لمنع المخزن المؤقت من التدفق إلى خط الأنبوب (الشكل التكميلي 1 د).
      ملاحظة: نظام التروية جاهز الآن للاستخدام.
  3. القتل الرحيم للفأر عن طريق وضعه في غرفة ثاني أكسيد الكربون (CO2) والسماحلثاني أكسيد الكربون بالتدفق إلى الغرفة بمعدل تدفق 30٪ من حجم الغرفة في الدقيقة. بمجرد توقف الماوس عن التنفس ، اسمح لثاني أكسيد الكربون2 بالتدفق إلى الغرفة لمدة 1 دقيقة على الأقل. تحقق من نفاد الماوس قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: يمكن استخدام القتل الرحيم من خلال حقن العوامل الدوائية في هذا البروتوكول كبديل لاستنشاق CO2 .
  4. أداء نضح القلب على الفأر القتل الرحيم.
    1. انقل الماوس إلى صينية ضحلة بالقرب من نظام التروية مع توجيه بطنه لأعلى. رش البطن مع 70 ٪ من الإيثانول (EtOH).
    2. قم بعمل أربعة شقوق لكشف تجويف البطن (الشكل التكميلي 2 أ).
      1. قم بعمل قطع أدنى بمقدار 5 سم باستخدام مقص منحني وملقط عبر الجلد وجدار البطن على الجانب الأيسر الأبعد من الماوس أسفل القفص الصدري مباشرة.
      2. المضي قدما في إجراء قطع وسطي 3 سم من خلال الجلد وجدار البطن من الماوس الذي يبدأ في الجزء العلوي من قطع أدنى.
      3. قم بعمل قطع آخر أدنى بمقدار 5 سم في نهاية الشق الإنسي عبر الجلد وجدار البطن على الجانب الأيمن الأبعد من الماوس أسفل القفص الصدري مباشرة.
      4. قم بعمل شق وسطي آخر بطول 3 سم لإزالة رفرف جلد البطن بالملقط المنحني.
    3. قطع الحجاب الحاجز والقص لكشف القلب (الشكل التكميلي 2B).
      ملاحظة: احرص على تجنب وخز القلب والشرايين والأوردة. سيؤدي التخلص منها إلى نضح قلبي غير فعال.
    4. أدخل إبرة القياس في البطين الأيسر للقلب. أدر الصمام حتى يصبح موازيا لخط الأنبوب. اقطع الأذين الأيمن بمقص منحني للسماح للدم والمثبت بالخروج من القلب (الشكل التكميلي 2C).
    5. اترك 10 مل من المخزن المؤقت المثبت لاختراق الماوس لمدة 1-2 دقيقة على الأقل ، أو حتى يصبح الكبد شاحبا في اللون ولا يتدفق الدم من الأذين الأيمن. بمجرد اكتمال التروية ، أدر الصمام حتى يصبح عموديا على خط الأنبوب لإيقاف تدفق المخزن المؤقت.
  5. استئصال العينين من الماوس بعد نضح القلب.
    1. أخرج الماوس من الدرج الضحل وضع الماوس على الوسادة السفلية الماصة في غطاء الدخان. قم بتوجيه رأس الماوس بحيث تكون العين اليسرى في مواجهة المجرب والعين اليمنى بعيدة عن الأنظار. قم بالتعليق على الجانب العلوي من العين باستخدام صبغة وسم الأنسجة.
    2. ادفع برفق لأسفل بالإبهام والسبابة حول محجر العين لإحداث بروز العين من محجر العين (الشكل التكميلي 3 أ).
    3. خذ مقصا منحنيا وأمسكه بالشفرة بزاوية 30 درجة من مقبس العين. استمر في القطع حول العين بالمقص المنحني بزاوية 30 درجة (الشكل التكميلي 3 ب).
      ملاحظة: لا بأس من قطع الأنسجة الزائدة من محجر العين للحفاظ على سلامة مقلة العين.
    4. أخرج مقلة العين من الرأس بالملقط المنحني وضعها على وسادة سفلية ماصة. قم بشق القرنية بشفرة مشرط رقم 11 وضع العين بالملقط المنحني في أنبوب دقيق سعة 2 مل مع 2 مل من المخزن المؤقت المثبت. قم بتسمية الأنبوب الدقيق سعة 2 مل مع تحديد الماوس و "اليسار" للإشارة إلى العين اليسرى.
      ملاحظة: يسمح الشق الموجود في القرنية للمثبت باختراق العين بسهولة للحفاظ عليها بشكل أفضل.
    5. كرر الخطوات 1.5.1-1.5.4 للعين اليمنى.
  6. اسمح للعينين بالاحتضان في مخزن مؤقت مثبت طوال الليل على شاكر في غرفة 4 درجات مئوية (C) ، بسرعة 75 دورة في الدقيقة (rpm).
  7. استبدل المخزن المؤقت المثبت ب 2 مل من محلول ملحي عازل فوسفات 1x (PBS). احتضان العينين في 1x PBS لمدة 10 دقائق على شاكر في RT و 75 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين.
  8. تنظيف وتشريح العينين لتوليد شرائح خلفية.
    ملاحظة: الجزء الخلفي هو مقلة عين الفأر مع شبكية العين العصبية ، RPE ، المشيمية ، والصلبة بدون القرنية ، القزحية ، والعدسة.
    1. ضع العين في طبق بتري مملوء ب 1x PBS تحت مجهر تشريح (الشكل التكميلي 4 أ).
    2. ارفع أي دهون وعضلات برفق بعيدا عن مقلة العين باستخدام ملقط رفيع الرأس. قم بقص الدهون والعضلات بعناية باستخدام مقص تشريح دقيق في اتجاه مواز لمقلة العين حتى يكون لمقلة العين لون أسود مزرق موحد (الشكل التكميلي 4 ب).
      ملاحظة: لا تقطع في اتجاه عمودي ، لأن هذا يضر مقلة العين. أيضا ، إذا خرجت صبغة وضع علامة على الأنسجة أثناء المعالجة ، فقم بإعادة التعليق على الجانب العلوي من مقلة العين على الفور.
    3. ضع ملقط ذو رؤوس دقيقة في موقع ثقب القرنية. قطع حول محيط القرنية ، بدءا من موقع البزل ، بمقص تشريح دقيق ، لإزالة القرنية والقزحية من مقلة العين (الشكل التكميلي 4C).
    4. خذ ملقط ذو رؤوس دقيقة وقم بإزالة العدسة برفق من مقلة العين للحصول على الجزء الخلفي (الشكل التكميلي 4D).
    5. ضع الجزء الخلفي مرة أخرى في أنبوب دقيق سعة 2 مل مع 2 مل من 1x PBS. قم بتخزين الجزء الخلفي في ثلاجة 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن تبقى الأجزاء الخلفية في 1x PBS عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع قبل المعالجة الإضافية.
  9. كرر الخطوات 1.3-1.8 لإعداد العيون من الفئران الأخرى في الدراسة.
  10. معالجة وتضمين أحد الأجزاء الخلفية من كل ماوس في البارافين للتقسيم. تأكد من أن الجانب العلوي من الجزء الخلفي في الأعلى.
    ملاحظة: يعتمد المؤلفون على مختبر مبادرات البحوث الانتقالية في علم الأمراض (TRIP) بجامعة ويسكونسن ماديسون (UW) لأداء هذه المهام. فيما يلي بروتوكولات منشورة باستخدام طريقة مماثلة لمعالجة البارافين وتضمينه23,24.
  11. قم بقص وتقسيم كل كتلة بارافين للحصول على قسم شبكية بسمك 5 ميكرومتر يتضمن رأس العصب البصري ، بالإضافة إلى أربعة أقسام شبكية إضافية بسمك 5 ميكرومتر تفصل بينها 250 ميكرومتر. قم بتسمية الشرائح بتعريف الماوس ورقم المقطع التسلسلي (على سبيل المثال ، 1 أو 2 أو 3 أو 4 أو 5). قم بتخزين الشرائح في مربع شرائح.
    ملاحظة: يعتمد المؤلفون على مختبر UW TRIP لخدماتهم في تقسيم البارافين. فيما يلي بروتوكولات منشورة باستخدام طريقة تقسيم البارافينالمماثلة 25,26.
  12. تلطيخ الشرائح التي تحتوي على أقسام الشبكية مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E). يمكن العثور على بروتوكول تلطيخ H& E في الشكل التكميلي 5.
    ملاحظة: يجب إكمال جميع خطوات إجراء تلطيخ H& E في غطاء الدخان.
  13. اجمع صورا مخيطة لأقسام شبكية العين الملطخة ب H& E باستخدام شريط مقياس باستخدام مجهر ضوئي بتكبير 20x.
  14. تحديد سمك RPE في صور الشبكية التي تحتوي على رأس العصب البصري لكل عينة.
    1. قم بتنزيل وفتح برنامج Fiji ImageJ. اسحب جميع صور الشبكية المخيطة التي تحتوي على رأس العصب البصري إلى شريط مهام Fiji ImageJ. تحقق من معايرة مقياس الصورة بالميكرومتر وليس بالبكسل.
      ملاحظة: يوجد مقياس الصورة في الزاوية العلوية اليسرى من النافذة التي تحتوي على صورة شبكية في برنامج Fiji ImageJ. إذا تم ضبط المقياس بالبكسل ، فيرجى الرجوع إلى دليل التعليمات الخاص ببرنامج Fiji ImageJ لتحويل وحدات البكسل إلى ميكرومتر.
    2. ضع علامة على كل فاصل زمني قدره 300 ميكرومتر في كل صورة من حافة رأس العصب البصري إلى نهاية الشبكية (ora serrata). انقر على أيقونة مستقيم في شريط مهام Fiji ImageJ. انقر واسحب خطا من حافة رأس العصب البصري باتجاه ora serrata الذي يبلغ طوله 300 ميكرومتر. انقر فوق أداة Paintbrush في شريط مهام Fiji ImageJ وانقر فوق نهاية خط 300 ميكرومتر لتمييزه.
    3. قم بقياس سمك RPE في كل فترة زمنية محددة. انقر على أيقونة مستقيم في شريط مهام Fiji ImageJ. انقر فوق خط واسحبه من أعلى إلى أسفل RPE (الشكل التكميلي 6). انقر فوق تحليل > قياس في شريط قوائم Fiji ImageJ للحصول على سمك RPE.
    4. انقل قياسات سمك RPE إلى جدول بيانات وقم بتسمية العمود الذي يحتوي على القياسات بتعريف الماوس. قم بتسمية عمود إضافي ب "الفاصل الزمني المحدد" وأدخل المسافة بعيدا عن قيم العصب البصري (أي 300 ، 600 ، 900 ، إلخ.)
      ملاحظة: الفاصل الزمني الأول المقاس يتوافق مع 300 ميكرومتر بعيدا عن العصب البصري ، والفاصل الزمني الثاني المقاس يتوافق مع 600 ميكرومتر ، وهكذا.
  15. تحديد معدلات حدوث أمراض RPE بناء على صور الشبكية لكل عينة.
    1. افتح برنامج فيجي ImageJ.
    2. افتح تطبيق عداد الخلية داخل برنامج Fiji ImageJ. انقر فوق المكونات الإضافية > تحليل عداد الخلايا > في شريط قوائم Fiji ImageJ. اسحب صورة شبكية العين إلى شريط مهام Fiji ImageJ وانقر فوق تهيئة في نافذة عداد الخلايا .
    3. احسب عدد أمراض RPE لكل قسم شبكية باستخدام تطبيق عداد الخلايا . انقر فوق النوع 1 ضمن العدادات ثم انقر فوق جميع أحداث الفراغ الدقيق في الصورة. انقر فوق النوع 2 ضمن العدادات ثم انقر فوق جميع أحداث macrovacuolization في الصورة. انقر فوق النوع 3 ضمن العدادات ثم انقر فوق جميع أحداث الترحيل الفردية في الصورة.
    4. نقل أرقام أمراض RPE إلى جدول بيانات. قم بتسمية الصفوف إما بالفراغ الدقيق أو الفراغ الكبير أو الترحيل والعمود بتعريف الماوس.
    5. كرر الخطوات 1.15.2-1.15.4 للصور الأخرى للعينة. متوسط عدد أمراض RPE لكل عينة واقسم على خمسة لحساب معدل حدوث كل أمراض RPE للعينة في جدول البيانات.
  16. إجراء تحليل إحصائي على سمك RPE في كل فترة ومعدلات حدوث أمراض RPE لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في الدراسة.

2. تقييم RPE للفأر بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ

  1. قطع الأجزاء الخلفية الأخرى الناتجة بعد الخطوات 1.5-1.9 إلى النصف من خلال العلامة العليا إلى قسمين بشفرة حلاقة. أعد التعليق على الجانب العلوي من الأجزاء الخلفية المجزأة بصبغة وسم الأنسجة. افصل الأجزاء الخلفية المجزأة إلى أنابيب دقيقة جديدة سعة 2 مل تحتوي على 2 مل من 1x PBS وتحديد الماوس.
    ملاحظة: الجزء الخلفي للفأر كبير جدا بحيث لا يمكن معالجته في قطعة واحدة ويجب قطعه إلى النصف لمعالجة المجهر الإلكتروني النافذ.
  2. شطف الأنسجة مع 2 مل من 0.1 M كاكوديلات العازلة ، ودرجة الحموضة 7.2. احتضان لمدة 10 دقائق في RT على سطح الطاولة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
  3. استبدل المخزن المؤقت للكاكوديلات 0.1 M ب 2 مل من رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ (OsO4) المخفف في محلول كاكوديلات 0.1 M. احتضان لمدة 1.5 ساعة في RT في غطاء الدخان.
    تنبيه: OsO4 مادة سامة. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية عند العمل مع OsO4.
  4. اشطف المناديل ب 2 مل من محلول كاكوديلات 0.1 متر لمدة 10 دقائق في RT في غطاء الدخان. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  5. قم بتجفيف الأنسجة بتخفيفات EtOH متدرجة تتراوح من 50٪ إلى 100٪ عند RT في غطاء الدخان. يمكن العثور على بروتوكول لإجراء الجفاف في الشكل التكميلي 7.
  6. إزالة 100٪ EtOH من الأنسجة وإضافة 2 مل من أكسيد البروبيلين إلى الأنسجة. احتضان في RT في غطاء الدخان لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة أكسيد البروبيلين من الأنسجة وأضف 2 مل من أكسيد البروبيلين الطازج إلى الأنسجة. احتضان في RT في غطاء الدخان لمدة 15 دقيقة.
    تنبيه: أكسيد البروبيلين مادة سامة. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية عند العمل مع أكسيد البروبيلين.
  7. أزل أكسيد البروبيلين من الأنسجة وأضف 2 مل من خليط 1: 1 من أكسيد البروبيلين والراتنج إلى الأنسجة. اتركيه طوال الليل تحت فراغ في غطاء الدخان في RT.
    تنبيه: الراتنج مادة خطرة على البشر. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية للمختبر عند العمل مع الراتنج.
  8. استبدل خليط 1: 1 من أكسيد البروبيلين والراتنج من الأنسجة ب 2 مل من الراتنج النقي. اتركيه طوال الليل تحت فراغ في غطاء الدخان في RT .
  9. تضمين الأنسجة في الراتنج. ضع ملصقا مع تعريف الماوس بالقلم الرصاص وقطرة من الراتنج في القالب . ضع الأنسجة على قطرة من الراتنج. املأ القالب بالراتنج وضعه تحت فراغ لمدة 1 ساعة في RT في غطاء الدخان.
  10. أعد وضع الملصقات والعينات باستخدام ملقط ذو رؤوس دقيقة ، مع وضع الجانب الخلفي من قسم فنجان العين الخلفي في الأعلى. اترك القالب طوال الليل على حرارة 65 درجة مئوية في فرن في شفاط الدخان.
  11. أخرج القوالب من الفرن. اترك القوالب لتبرد إلى RT على سطح الطاولة. إزالة الكتل من القوالب.
    ملاحظة: الكتل جاهزة الآن للتشذيب.
  12. قم بتشكيل كتل الراتنج بشفرة حلاقة لتشكيل شبه منحرف. قم بقص كتل الراتنج باستخدام ميكروتوم حتى يصبح رأس العصب البصري مرئيا. تابع استخدام سكين الماس لقطع المقاطع شبه الرقيقة من كتل الراتنج بسمك 0.5 ميكرومتر.
    ملاحظة: هنا بروتوكول منشور على قسم microtome27. إذا رغبت في ذلك ، يمكن جمع مقاطع شبه رقيقة بسمك 0.5 ميكرومتر من كتل الراتنج وتلوينها لتقييم سلامة العينة.
  13. قم بقص مقطع فائق النحافة بسمك 70 نانومتر من كل كتلة مشذبة باستخدام microtome ultra. اجمع مقطعا فائق النحافة بسمك 70 نانومتر على شبكة نحاسية رفيعة القضيب 400 شبكة. ضع الشبكة في صندوق تخزين شبكي وقم بتسمية الفتحة بتعريف الماوس.
    ملاحظة: هنا بروتوكول منشور حول قسم ultramicrotome28.
  14. قم بتلطيخ الشبكات بأسيتات يورانيل 2٪ لمدة 5 دقائق ثم بمحلول سترات الرصاص 3.5٪ لمدة 5 دقائق في RT في غطاء الدخان.
    تنبيه: أسيتات اليورانيل وسترات الرصاص من المواد الخطرة. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية عند العمل مع هذه المواد.
  15. احصل على صور لكل عينة باستخدام مجهر إلكتروني نافذ بتكبير 15000x ، حيث تتقاطع خطوط الشبكة النحاسية مع RPE و BrM.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن 20 إلى 35 صورة لكل قسم و 40 إلى 70 صورة لكل عينة.
  16. تحديد ارتفاعات BLamD في الصور للعينات في الدراسة.
    1. افتح برنامج فيجي ImageJ. اسحب كل الصور من قسم العينة إلى شريط مهام Fiji ImageJ. تحقق من معايرة الصور بالميكرومتر وليس بالبكسل.
    2. قم بقياس ارتفاع BLamD في الصور. انقر فوق الرمز مستقيم في شريط مهام Fiji ImageJ. انقر واسحب خطا من الصفيحة المرنة ل BrM إلى أعلى أطول إيداع في الصورة (الشكل التكميلي 8). انقر تحليل > قياس في شريط قوائم فيجي ImageJ للحصول على ارتفاع BLamD في الصورة.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك BLamDs في الصورة ، فقم برسم خط من الصفيحة المرنة ل BrM إلى الصفيحة القاعدية ل RPE.
    3. انقل ارتفاعات BLamD إلى جدول بيانات وتسمية مع تحديد الماوس.
  17. احسب الترددات التراكمية لارتفاعات BLamD لكل نمط جيني ومتوسطات ارتفاعات BLamD لكل ماوس في جدول البيانات. إجراء تحليل إحصائي على متوسطات ارتفاعات BLamD لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في الدراسة.

3. تقييم RPE الماوس من خلال المجهر متحد البؤر

  1. جمع عيون من الفئران. القتل الرحيم للفئران وفقا للإجراء الموضح في الخطوة 1.3. قم باستئصال العينين باستخدام الخطوة 1.5. ضع العينين باستخدام ملقط منحني في أنبوب دقيق سعة 2 مل مع 2 مل من 1x PBS وتحديد الماوس.
    ملاحظة: لا تتكيف مع الفئران بشكل مظلم ، لأن الرقمنة بين المستقبلات الضوئية والعمليات القمية RPE تسمح بتصور أفضل ل RPE من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.
  2. نظف وتشريح عيون الفأر على الفور لتوليد أكواب العين الخلفية للفأر.
    ملاحظة: يختلف فنجان العين الخلفي عن الجزء الخلفي لأنه لا يحتوي على شبكية العين العصبية.
    1. انقل العين إلى طبق بتري يحتوي على 1x PBS تحت مجهر تشريح (الشكل التكميلي 9 أ).
    2. قم بإزالة الدهون والعضلات من مقلة العين ، كما هو موضح في الخطوة 1.8.2 (الشكل التكميلي 9B).
    3. قرنية مقلة العين بشفرة مشرط رقم 11. إزالة القرنية والقزحية ، كما هو مفصل في الخطوة 1.8.3 (الشكل التكميلي 9C).
    4. اسحب العدسة بملقط رفيع الرأس. خذ ملقطين رفيعي الرأس وافصل الشبكية العصبية برفق عن الجزء الخلفي.
    5. قطع بعناية شبكية العين العصبية في رأس العصب البصري لإزالتها من فنجان العين الخلفي (الشكل التكميلي 9D).
    6. ضع فنجان العين الخلفي في أنبوب دقيق جديد سعة 2 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من 1x PBS مع تحديد الماوس.
  3. ثبت أكواب العين الخلفية بالميثانول (MeOH) (الشكل التكميلي 10).
    ملاحظة: تستغرق الخطوة 3.3 حوالي 2 ساعة و 40 دقيقة لإكمالها.
    1. أضف 500 ميكرولتر من MeOH إلى الأنسجة. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT.
    2. قم بإزالة 500 ميكرولتر من المحلول من الأنسجة وأضف 500 ميكرولتر من MeOH. احتضان لمدة 5 دقائق على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
    3. قم بإزالة المحلول بالكامل من الأنسجة وأضف 500 ميكرولتر من MeOH. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة على الأقل في RT.
      ملاحظة: كبديل للخطوة 3.3.3 ، يمكن تحضين فنجان العين الخلفي طوال الليل في MeOH على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة في غرفة 4 درجات مئوية.
    4. أضف 500 ميكرولتر من 1x PBS إلى الأنسجة. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT.
    5. قم بإزالة 500 ميكرولتر من المحلول من الأنسجة وأضف 500 ميكرولتر من 1x PBS. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
    6. قم بإزالة المحلول بالكامل من الأنسجة واستبدله ب 500 ميكرولتر من 1x PBS.
      ملاحظة: يتم إصلاح الأنسجة بالكامل بواسطة MeOH ويمكن الاحتفاظ بها في ثلاجة 4 °C لمدة 1 شهر على الأقل.
  4. إجراء تلطيخ مناعي لأكواب العين الخلفية لتصور الوصلات الضيقة ونوى RPE (الشكل التكميلي 11).
    1. قم بإزالة 500 ميكرولتر من 1x PBS من العينات وأضف 100 ميكرولتر من مصل الحمير العادي المخفف بنسبة 10٪ في محلول 1x PBS. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في RT.
    2. قم بإزالة محلول مصل الحمير الطبيعي المخفف بنسبة 10٪ من العينات وأضف 100 ميكرولتر من تخفيف 1:50 من الجسم المضاد للأرانب متعدد النسيلة المضاد ل Zonula Occludens-1 (ZO-1) في 1x PBS. انقل العينات إلى غرفة 4 درجات مئوية واحتضانها طوال الليل على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة.
    3. قم بإزالة تخفيف الأجسام المضادة من العينات وأضف 2 مل من 1x PBS. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في RT. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
    4. قم بإزالة 1x PBS من العينات. أضف 100 ميكرولتر من تخفيف 1: 250 من الجسم المضاد IgG المضاد للحمار مع علامة 488 مترافقة بالفلوروفور وتخفيف 1: 250 من 4 '، 6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI) في 1x PBS إلى العينات. قم بتغطية العينات بورق الألمنيوم واحتضانها على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في RT.
      ملاحظة: يجب تغطية العينات بالكامل بورق الألمنيوم لمنع التبييض الضوئي.
    5. قم بإزالة الجسم المضاد وتخفيفات DAPI من العينات. أضف 2 مل من 1x PBS إلى العينات ، وأعد تغطيتها بورق الألمنيوم ، واحتضانها على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في RT. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أخرى.
      ملاحظة: يتم الآن تمييز الوصلات الضيقة ونوى RPE بالكامل وتلوينها ، على التوالي.
  5. قم بتركيب أكواب العين الخلفية على شرائح المجهر.
    1. قم بتسمية شريحة مجهر بتعريف الماوس. انقل فنجان العين الخلفي إلى شريحة مجهرية تحت مجهر تشريح مع توجيه الجانب المشيمي لأسفل. أضف قطرة من 1x PBS إلى فنجان العين الخلفي لمنعه من الجفاف (الشكل التكميلي 12).
    2. اقطع فنجان العين الخلفي باستخدام شفرة مشرط رقم 11 في أربع نقاط ستنتج أربعة أرباع تتوافق مع الاتجاهات الأساسية (أي الشمال والشرق والجنوب والغرب). ربت الزائد 1x PBS مع الأنسجة من محيط فنجان العين الخلفي. قم بتسطيح فنجان العين الخلفي برفق باستخدام فرشاة شعر الجمل والملقط ذي الرؤوس الدقيقة (الشكل التكميلي 12).
      ملاحظة: يعرف المنتج الناتج الآن باسم حامل مسطح RPE.
    3. أضف قطرة من وسيط التثبيت إلى الحامل المسطح RPE وضع غطاء فوقه. ضع طلاء أظافر شفاف لإغلاق غطاء الغطاء واتركه يجف لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT في درج مغلق. ضع الشرائح في صندوق حامل منزلق واحتفظ بالصندوق في ثلاجة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: كن حذرا لتجنب إدخال فقاعات على حامل RPE المسطح. يمكن تصوير حوامل RPE المسطحة في غضون إطار زمني مدته 2 أسبوع.
  6. احصل على صورة لكل من الأرباع الأربعة المحيطة بالعصب البصري للحامل المسطح RPE على مجهر متحد البؤر عند تكبير 20x لكل عينة. يمكن العثور على مثال لصورة التثبيت المسطح RPE في الشكل التكميلي 13A.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري إجراء تصوير مكدس z للحوامل المسطحة RPE حيث يتم التقاط صور متعددة وتكديسها للتعويض عن اختلافات الأبعاد للحامل المسطح RPE.
  7. تتبع التقاطعات الضيقة لخلايا RPE داخل كل صورة تحميل مسطحة RPE. يمكن العثور على مثال لصورة التثبيت المسطح RPE التي تم تتبعها في الشكل التكميلي 13B.
    1. افتح برنامج فيجي ImageJ. اسحب صورة تحميل مسطحة RPE إلى شريط مهام Fiji ImageJ. تحقق من معايرة الصورة بالميكرومتر وليس بالبكسل.
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق أيقونة أداة فرشاة التراكب في شريط مهام Fiji ImageJ لضبط عرض الفرشاة على 3 والشفافية على 0 واللون على الأحمر. انقر زر إغلاق في نافذة أداة فرشاة التراكب .
    3. انقر على أيقونة أداة فرشاة التراكب . انقر واسحب على التقاطعات الضيقة لجميع خلايا RPE الموجودة بالكامل داخل الصورة.
      ملاحظة: في حالة حدوث خطأ في التتبع ، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز أداة فرشاة التراكب وانقر فوق المربع تراجع في نافذة أداة فرشاة التراكب لإزالة خطأ التتبع من الصورة.
    4. انقر فوق رمز المستطيل في شريط مهام Fiji ImageJ. انقر على الصورة واسحب حول محيط الصورة. انقر فوق تحرير > مسح على شريط قوائم Fiji ImageJ للاحتفاظ بالخطوط المتعقبة وإزالة أي ألوان زرقاء وخضراء من الصورة.
    5. احفظ صورة التتبع في موقع مناسب مع تعريف الماوس والموقع الرباعي (أي الشمال أو الجنوب أو الشرق أو الغرب) وتسمية لاحقة CP.
      ملاحظة: لا تقم بحفظ صورة تتبع RPE قبل إكمال الخطوة 3.7.4.
  8. احسب مساحات خلايا RPE لكل عينة.
    1. قم بتعيين موقع لحفظ الملفات من تحليل منطقة RPE عن طريق إنشاء مجلد على شاشة سطح مكتب الكمبيوتر. قم بإنشاء مجلدات فرعية لكل صورة تتبع RPE وقم بتسمية المجلدات الفرعية بتعريف الماوس بالإضافة إلى الموقع الرباعي (أي الشمال أو الجنوب أو الشرق أو الغرب).
    2. قم بتثبيت وفتح برنامج Cell Profiler29. قم بتنزيل ملف مشروع Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (ملف الترميز التكميلي 1). افتح الملف Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj بالنقر فوق ملف > فتح المشروع في شريط قوائم برنامج منشئ ملفات تعريف الخلايا.
    3. اسحب صورة تتبع RPE واحدة إلى الصورة > مربع إسقاط الملفات والمجلدات هنا في نافذة برنامج منشئ ملفات التعريف الخلوية.
    4. أدخل موقع المجلد في برنامج منشئ ملفات تعريف الخلية الذي يتوافق مع صورة تتبع RPE. انقر فوق الزر "إعدادات الإخراج" في الزاوية اليسرى السفلية من نافذة برنامج Cell Profiler وأدخل موقع المجلد في مربعات نص مجلد الإدخال الافتراضي ومجلد الإخراج الافتراضي.
    5. انقر فوق الزر "تحليل الصور " في الزاوية اليسرى السفلية من نافذة برنامج Cell Profiler. بعد اكتمال التحليل، ستظهر نافذة اكتمال التحليل على الشاشة. انقر فوق الزر "موافق " في نافذة اكتمال التحليل .
      ملاحظة: سيؤدي هذا الإجراء إلى إنشاء ملف csv وصورة jpeg. سيحتوي ملف csv على مناطق لخلايا RPE داخل صورة التتبع. ستتوافق صورة jpeg مع صورة تتبع RPE ، حيث سيتم تسمية كل خلية RPE برقم (الشكل التكميلي 13C).
    6. انقل مناطق RPE من ملف csv إلى جدول بيانات. قم بتسمية جدول البيانات بتعريف الماوس.
    7. قم بإجراء مسح لمراقبة الجودة للبيانات من خلال التأكد من أن كل منطقة RPE في ملف csv ترتبط بخلية RPE تم تتبعها بالكامل في صورة jpeg. قم بإزالة أية قيم من جدول البيانات لا تتوافق مع خلايا RPE التي تم تتبعها بالكامل.
    8. ارجع إلى برنامج منشئ ملفات تعريف الخلية. انقر بزر الماوس الأيمن فوق اسم صورة تتبع RPE في مربع إسقاط الملفات والمجلدات هنا وحدد مسح القائمة لإزالة الصورة من برنامج Cell Profiler.
    9. كرر الخطوات 3.8.3-3.8.8 لحساب أحجام RPE لصور تتبع RPE الثلاثة المتبقية للعينة.
  9. حدد متوسطات حجم خلية RPE لكل عينة في جدول البيانات.
  10. حدد كثافات خلايا RPE لكل عينة في جدول البيانات. لحساب كثافة خلايا RPE ، قسم العدد الإجمالي لخلايا RPE لكل ربع على المساحة الإجمالية لخلايا RPE لكل ربع تم اكتشافه بواسطة برنامج Cell Profiler. أوجد متوسط كثافة خلايا RPE من الأرباع الأربعة لكل عينة.
  11. حدد عدد خلايا RPE متعددة النوى لكل حامل مسطح RPE لكل عينة. استخدم تطبيق عداد الخلايا ضمن برنامج Fiji ImageJ ، كما هو موضح في الخطوات 1.15.1-1.15.3 ، لحساب عدد خلايا RPE التي تحتوي على أكثر من ثلاث نوى في أربعة أرباع من العينة.
  12. إجراء تحليل إحصائي على حجم خلية RPE ومتوسطات الكثافة، بالإضافة إلى عدد خلايا RPE متعددة النوى لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات كبيرة بين المجموعات في الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر إكمال بروتوكول التنميط الظاهري RPE الموضح في هذه المقالة تحليلا كميا لتشوهات RPE الهيكلية التي لوحظت بشكل شائع في نماذج الماوس من AMD. لتأكيد فعالية هذا البروتوكول ، استخدمناه في الفئران المعروفة بعرض أمراض RPE ، بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا التي تفرط في التعبير عن WT Tmem135 مدفوعة بمروج الدجاج بيتا أكتين (Tmem135 TG) 30 والفئران C57BL / 6J 31,32. الهدف من هذه التجارب هو إظهار نتائج تمثيلية يمكن الحصول عليها با...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة ، قدمنا بروتوكول التنميط الظاهري لتقييم أمراض RPE الهيكلية لنماذج الماوس. وصفنا الخطوات المطلوبة لمعالجة العيون لتقنيات التصوير المختلفة بما في ذلك الضوء وإلكترون الإرسال والمجهر متحد البؤر ، بالإضافة إلى تحديد كمية الأمراض النموذجية التي لوحظت عبر طرق التصوير هذه. لقد أثبتنا فعالية بروتوكول التنميط الظاهري RPE الخاص بنا من خلال فحص Tmem135 TG والفئران WT البالغة من العمر 24 شهرا ، لأن هذه الفئران تظهر أمراض RPE30،31،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى مؤلفي هذا البروتوكول أي إفصاحات وتضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا ساتوشي كينوشيتا ومبادرات البحوث الانتقالية في مختبر علم الأمراض بجامعة ويسكونسن (UW) لإعداد أنسجتنا للفحص المجهري الضوئي. يتم دعم هذا النواة من قبل قسم علم الأمراض والطب المخبري بجامعة ويسكونسن ، ومركز سرطان الكاربون بجامعة ويسكونسن (P30 CA014520) ، ومكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (S10OD023526). تم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر في UW Biochemistry Optical Core ، والذي تم إنشاؤه بدعم من قسم UW للكيمياء الحيوية. تم دعم هذا العمل أيضا بمنح من المعهد الوطني للعيون (R01EY022086 إلى A. Ikeda; R01EY031748 إلى سي باوز ريكمان ؛ P30EY016665 إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية في UW ؛ P30EY005722 إلى مركز ديوك للعيون ؛ المعاهد الوطنية للصحة T32EY027721 إلى م. لاندوفسكي ؛ F32EY032766 إلى M. Landowski) ، رئاسة تيموثي ويليام تراوت (A. Ikeda) ، جائزة FFB Free Family AMD (C. Bowes Rickman) ؛ ومنحة غير مقيدة من أبحاث الوقاية من العمى (مركز ديوك للعيون).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 م عازلة Cacodylate pH7.2PolyScientiifc R& D CompanyS1619
100 سعة صندوقمطلوب اثنين لهذا البروتوكول (واحد ل H& شرائح ملطخة باللون الإلكتروني وواحدة لحوامل RPE المسطحة.)
100٪ إيثانول MDS Warehouse2292-CASEلصنع محاليل الإيثانول المخففة في هذا البروتوكول.
1-Way Stopcock ، 2 أنثى Luer LocksQosina11069
1x محلول عازلة الفوسفات (PBS) يمكناستخدام 1x PBS الجاهزة في هذا البروتوكول.
2.0 مل الأنابيب الدقيقةGenesee Scientific   ؛24-283-LR
24 تجويف تضمين كبسولة بديل العفنعلوم المجهر الإلكتروني70165
24 بوصة أنابيب PVC مع نهايات لورفيشر العلميNC1376778
400 شبكة جيلدر رقيقة شريط شبكة مربعة شبكات علومالمجهر الإلكترونيT400-Cu
95٪ مستودع الإيثانولMDS2293-CASE
وسادات سفلية ماصة مع حاجز رطوبة مقاوم للماء (23 بوصة × 24 بوصة)VWR56616-031
قابل للتعديل 237 مل & nbsp; زجاجة رذاذVWR23609-182
Alexa Fluor488 الحمار المترافق المضاد للأرانب IgG & nbsp ؛ثيرمو فيشر العلميA-21206
رقائق
BD الدقة الانزلاق 19 مقياس حقنة إبرةسيجما-الدريتش & nbsp ؛Z192546
ملقط السرخس. منحني; مسننات متقاطعة دقيقة. 4 "طول ، 1 مم عرض الطرفRoboz أداة جراحيةRS-5211تعرف باسم الملقط المنحني في هذا البروتوكول.
فرشاة شعر الإبلعلوم المجهر الإلكتروني65575-02
غرفة القتل الرحيم
أكسيد الكربون ثاني أكسيد الكربون مقياس
ثاني أكسيد الكربون خزان
قسطالوي شقة تمديد المشابكفيشر العلمية  05-769-7Q
دعم قاعدة على شكل حرف L منالحديد الزهر فيشر Scientific   ؛11-474-207
Cell Profirمتاح للتنزيل: https://cellprofiler.org/releases
Clear طلاء الأظافرعلوم المجهر الإلكتروني72180
شرائح مجهر Colorfrost LavenderVWR10118-956
الكمبيوتر
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
المقطر H2< / sub>0من نظام تنقية Milli-Q في هذا البروتوكول.
ملاقط دومونت رقيقة تلميح ؛ النمط # 55أداة Roboz الجراحيةRS-4984تعرف باسم الملقط ذي الرؤوس الدقيقة في هذا البروتوكول ، و 3 مطلوبة لهذا البروتوكول (اثنان للتشريح وواحد لمعالجة المجهر الإلكتروني).
شبكة المجهر الإلكترونيعلوم المجهرالإلكتروني 71147-01
EPON 815علوم المجهر الإلكتروني14910
Epredia Mark-It Tissue MarkingYellow Dye Fisher Scientific 22050460يرجى اتباع بروتوكول الشركة المصنعة عند استخدام صبغة علامات الأنسجة.
Epredia تصاعد وسائل الإعلامفيشر Scientific22-110-610استخدام لتركيب اليد & الشرائح الإلكترونية. 
سلسلة إضاءة الألياف الضوئية Mi-150 ، مصدر ضوء الهالوجين 150 واطمصدر ضوء دولان جينر إندستريزMi-150لتشريح المجهر.
Fiji ImageJمتاح للتحميل: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy HookConnector Thermo Scientific   14-666-18Q
الدخان
الجلوتارالديهايد 2.5٪ في عازلة الفوسفات ، درجة الحموضة 7.4 ، 32٪علوم المجهر الإلكتروني16537-05
JEM-1400 مجهر إلكتروني ناقل الحركة (JEOL) مع مختبر كاميرا
منضدة شاكرهناك حاجة إلى اثنين لهذه التجارب. يجب أن يكون أحدهما في درجة حرارة الغرفة بينما يجب أن يكون الآخر في غرفة باردة 4 درجات مئوية.
تسميات علامة الليزر بالتبريد علومالمجهر77564-05
المجهرلسترات الرصاص17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlipsThermo Fisher Scientific22X22I24788001LSاستخدم هذه الأغطية للحوامل المسطحة RPE لأنها ذات حواف مرتفعة وتستوعب سمك RPE.
Mayer's HematoxylinVWR100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring ScissorsRoboz SurgicalInstrument RS-5600المعروف باسم مقص التشريح الدقيق في البروتوكول.
الميثانولفيشر العلمية A412-4
Miceيمكن أن يعمل أي طراز ماوس AMD وعناصر التحكم الخاصة به مع هذا البروتوكول.
مقص تشريح صغير. النسخة القياسية منحني; نقاط حادة. طول الشفرة 24 مم ؛ 4.5 "الطول الكليRoboz أداة جراحيةRS-5913المعروفة باسم المقص المنحني في هذا البروتوكول.
رفوف مايكروسوفت إكسل
Microtube نيكون
A1RS مجهر متحد البؤر مصل
الحمار العاديSouthernBiotech0030-01
رقم 11 شفرات مشرط معقمة يمكن التخلصمنها VWR21909-380
رابع أكسيد الأوزميوم   ؛علوم المجهر الإلكتروني19150
بارافورمالدهايد ، 32٪علوم المجهر الإلكتروني15714-S
طبق بتري قلم
رصاص VWR & nbsp ؛21909-380
الماصات
الماصات 
متعدد النسيلة المضاد للأجسام المضادة ZO-1Thermo Fisher Scientific402200
علوم المجهرالإلكتروني لأكسيد البروبيلين20412
شفرة الحلاقةVWR10040-386
صينية ضحلة لتروية
شاندون إيوسين Y كحوليVWR89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip أسود دائم ماركردبابيس642736
رف منزلق لتلوينGrainger49WF31
غطاء زجاجي تربيعزلات فيشر Scientific   ؛12-541B
طبق تلطيخ مع غطاءGrainger49WF30Need 15 لليد & إجراء تلطيخ ه.
استهداف جميع البلاستيك يمكن التخلص منه Luer-Slip حقنة 50 مل  ثرمو علمية S7510-50استخدم برميل المحقنة فقط.
الموقتفيشر1464917
اليورانيلخلات علوم المجهر الإلكتروني22400
فرن
Vectashield تصاعد مختبرات ناقلات متوسطةH-1000تستخدم لتركيب RPE المسطحة حوامل.
زيلينفيشر العلمية 22050283
Zeiss Axio Imager 2 مجهريتمتع هذا المجهر بالقدرة على إنشاء صور مخيطة 20x. إذا لم يكن المجهر الضوئي يمتلك هذه السعة ، فقم بالتقاط صور لشبكية العين بأكملها متداخلة قليلا مع بعضها البعض. استخدم Adobe Photoshop لتجميع هذه الصور معا. يرجى الرجوع إلى أدلة برنامج Adobe Photoshop لخياطة الصور.
زايس ستيمي 2000 تشريح المجهرعلوم المجهر الإلكتروني65575-02
الشريحة يمكن استخدام الألومنيوملثانيتدفق حامل برنامج تم استخدام الماء حامل الراتنج برنامج غطاء ORIUS (1000) CCD الإلكتروني علوم الإلكتروني: أطراف الفأرفراغ ضوئي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170(2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34(2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19(2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160(2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33(2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235(2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16(2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392(2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119(2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588(2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal Pigmented EpitheliumAge Related Macular DegenerationMouse ModelsRPE PathologiesLight MicroscopyTransmission Electron MicroscopyConfocal MicroscopyCardiac PerfusionRPE QuantificationMolecular Pathways

Related Articles