تطوير سلالات أنواع الليشمانيا مع التعبير التأسيسي ل eGFP

ملخص

هنا ، نصف المنهجية المستخدمة لتوليد سلالات L. panamensis و L . donovani التي تعبر عن جين eGFP كجين تحوير متكامل مستقر باستخدام نظام pLEXSY. تم استنساخ الطفيليات المنقولة عن طريق الحد من التخفيف ، وتم اختيار الحيوانات المستنسخة ذات أعلى كثافة مضان في كلا النوعين لاستخدامها مرة أخرى في فحوصات فحص الأدوية.

الملخص

تسبب الطفيليات الأولية من جنس الليشمانيا داء الليشمانيات ، وهو مرض له مظاهر سريرية متغيرة يصيب ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم. يمكن أن تؤدي العدوى ب L. donovani إلى مرض حشوي مميت. في بنما وكولومبيا وكوستاريكا ، L. panamensis هو المسؤول عن معظم الحالات المبلغ عنها من داء الليشمانيات الجلدي والمخاطي. إن دراسة عدد كبير من الأدوية المرشحة بالمنهجيات المتاحة حتى الآن أمر صعب للغاية ، نظرا لأنها شاقة للغاية لتقييم نشاط المركبات ضد الأشكال داخل الخلايا للطفيلي أو لأداء المقايسات في الجسم الحي . في هذا العمل ، نصف جيل سلالات L. panamensis و L. donovani مع التعبير التأسيسي للجين الذي يشفر لبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP) المدمج في الموضع الذي يشفر ل 18S rRNA (ssu). تم الحصول على eGFP المشفر الجيني من ناقل تجاري وتم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لإثرائه وإضافة مواقع تقييد لإنزيمات BglII و KpnI. تم عزل أمبليكون eGFP عن طريق تنقية هلام الأغاروز ، وهضمه مع الإنزيمات BglII و KpnI ، وربطه في ناقل تعبير الليشمانيا pLEXSY-sat2.1 الذي تم هضمه مسبقا بنفس مجموعة الإنزيمات. تم نشر ناقل التعبير مع الجين المستنسخ في الإشريكية القولونية ، وتنقيته ، وتم التحقق من وجود الإدراج بواسطة مستعمرة PCR. تم تحويل البلازميد المنقى خطيا واستخدامه لنقل طفيليات L. donovani و L . panamensis. تم التحقق من تكامل الجين بواسطة PCR. تم تقييم التعبير عن جين eGFP عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم استنساخ الطفيليات الفلورية عن طريق الحد من التخفيف ، وتم اختيار الحيوانات المستنسخة ذات أعلى كثافة مضان باستخدام قياس التدفق الخلوي.

المقدمة

الطفيليات الأولية من جنس الليشمانيا تسبب داء الليشمانيات ، وهو مرض له مجموعة واسعة من المظاهر السريرية. ينتشر هذا المرض في 98 دولة ، ويقدر معدل حدوثه السنوي ب 0.9 إلى 1.6 مليون حالة¹. تنقسم أنواع الليشمانيا المسببة للأمراض للإنسان إلى جنسين فرعيين ، وهما L. (الليشمانيا) ول. (فيانيا). العدوى مع بعض الأنواع التي تنتمي إلى L. (الليشمانيا) قد يؤدي الجنس الفرعي ، مثل L. donovani و L. infantum ، إلى داء الليشمانيات الحشوي (VL) ، وهو قاتل إذا ترك دون علاج². الأنواع التي تنتمي إلى L. يرتبط الجنس الفرعي (Viannia) بمعظم حالات داء الليشمانيات الجلدي (CL) وداء الليشمانيات المخاطي الجلدي (MCL) في أمريكا الوسطى والجنوبية ، وخاصة في بنما وكولومبيا وكوستاريكا ، مع كون L. panamensis العامل المسبب الرئيسي لهذه العروض السريرية ^3,4.

العلاج الكيميائي الحالي المضاد لليشمانيا الذي يتضمن أدوية مثل الأنتيمون خماسي التكافؤ وميلتيفوسين والأمفوتريسين ب شديد السمية ومكلف. وعلاوة على ذلك، أضيفت زيادة مقاومة الأدوية خلال العقود الأخيرة إلى العوامل التي تتداخل مع العلاج الفعال للمرضى في جميع أنحاء العالم⁵. تم إثبات اختلافات جوهرية عبر أنواع جنس الليشمانيا فيما يتعلق بالحساسية للأدوية ، خاصة بين أنواع العالم الجديد^{والقديم 6,7}. لهذه الأسباب ، من الضروري توجيه الجهود لتحديد وتطوير عقاقير جديدة لمكافحة الليشمانيا ، مع إيلاء اهتمام خاص للنهج الخاصة بالأنواع. من الصعب للغاية دراسة المكتبات الكبيرة للأدوية المرشحة ذات المنهجيات التقليدية ، نظرا لأن هذه المنهجيات شاقة للغاية لتقييم نشاط المركبات ضد الأماستيجوتات داخل الخلايا أو لإجراء تجارب في الجسم الحي ⁸ ؛ لذلك ، كان من الضروري تطوير تقنيات جديدة تقلل من هذه العيوب ، بما في ذلك تنفيذ جينات المراسل وتطوير فحوصات فحص النمط الظاهري عالية المحتوى⁹.

أظهر استخدام جينات المراسل إمكانية زيادة كفاءة عملية فحص الأدوية لأنها تسهل تطوير فحوصات عالية الإنتاجية وفي الجسم الحي. تم إنشاء طفيليات الليشمانيا المؤتلفة التي تعبر عن العديد من جينات المراسل من قبل مجموعات بحثية مختلفة. تم إدخال جينات المراسل ، مثل β-galactosidase و β-lactamase و luciferase ، في العديد من أنواع الليشمانيا باستخدام النواقل العرضية ، مما يدل على فائدة محدودة لفحص الأدوية في أشكال خارج الخلايا وداخلها من الطفيلي 10،^11،12،13،^14،15. هذه الأساليب لها حدود تتطلب ضغطا انتقائيا قويا في الثقافة لتجنب القضاء على البنية العرضية ، وكذلك استخدام كواشف إضافية للكشف عن نشاط جين المراسل. على العكس من ذلك ، تم استخدام بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ومتغيره ، بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP) ، في توليد عدد كبير من سلالات الليشمانيا المعدلة وراثيا لفحوصات فحص الأدوية في المختبر بسبب مرونتها وحساسيتها ، وكذلك إمكانية أتمتة عملية الفحص باستخدام قياس التدفق الخلوي أو القياس الفلوري^{15 ، 16,17,18,19}. على الرغم من النتائج الواعدة ، كانت مزارع هذه السلالات المعدلة وراثيا غير متجانسة للغاية في مستويات مضانها ، لأن عدد نسخ جين GFP لم يكن هو نفسه في جميع الطفيليات. علاوة على ذلك ، يتطلب الحفاظ على التألق ضغطا انتقائيا ثابتا على الطفيليات في الثقافة ، حيث تم إدخال جين GFP في بنية عرضية.

للأسباب المذكورة من قبل ، ركزت العديد من الجهود على تطوير منهجيات جديدة لإنتاج سلالات مستقرة مؤتلفة. اعتمدت هذه الجهود في الغالب على دمج جينات المراسل في المواقع الريبوسومية ، مستفيدة من معدلات النسخ الأعلى للجينات الريبوسومية²⁰. تم إنشاء سلالات من L. infantum و L. amazonensis بعد دمج الجينات المشفرة ل β-galactocidase 21 و IFP 1.4 و iRFP²² و tdTomato²³ ، وتم تقييمها لفائدتها في فحوصات فحص الأدوية. طورت مجموعات مختلفة سلالات L. donovani التي تعبر عن GFP بشكل أساسي من خلال دمج جينها المشفر في موضع الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 18S (ssu locus) من خلال إعادة التركيب المتماثل^24,25 ؛ أظهروا تعبيرا مستقرا ومتجانسا عن GFP في السكان المنقولين ، بما في ذلك amastigotes داخل الخلايا 24,25 ، وتم تنفيذها بنجاح في فحوصات فحص المخدرات^24,25,26. طور Bolhassani et ^al.27 سلالات من L. major و L. infantum تعبر عن GFP كجين تحوير متكامل. استخدموا ناقل التكامل pLEXSY ، المصمم أصلا للتعبير الوراثي للبروتينات في نظام يستخدم L. tarentolae كمضيف²⁸. أظهر ناقل pLEXSY-GFP أنه فعال للغاية لتوليد سلالات مختلفة من الليشمانيا تعبر بشكل أساسي عن GFP²⁴،^25،27،^29،30. في هذه الطفيليات ، يكون التألق متجانسا ويتم الحفاظ عليه في الأشكال داخل الخلايا ، حيث يمكن اكتشافه في آفات وسادة القدم للفئران المصابة²⁷.

في هذا العمل ، نصف المنهجية المستخدمة لتوليد سلالات L. panamensis و L . donovani التي تعبر عن تشفير الجينات ل eGFP كجين تحوير متكامل باستخدام نظام pLEXSY. تستخدم السلالات الناتجة عن هذه العملية في مختبرنا لإجراء فحوصات فحص الأدوية التي تقيم النشاط المحتمل لمكافحة الليشمانيا للجزيئات ذات الأصل الطبيعي والاصطناعي.

البروتوكول

للحفاظ على العينات معقمة ، يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على زراعة الطفيليات داخل غطاء مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2) أو وفقا للوائح الصحة والسلامة المحلية. يمكن العثور على ملخص بياني لهذا البروتوكول في الشكل 1.

الشكل 1: مخطط موجز لبروتوكول توليد طفيليات L. panamensis و L. donovani المعبرة عن eGFP باستخدام عائلة ناقلات pLEXSY-2.1. جميع الأقسام الستة الرئيسية الموضحة في المقالة موضحة هنا. 1) تضخيم وإدخال جين eGFP في ناقل pLEXSY-2.1: يتم تضخيم الجين المستهدف ، مضيفا مواقع التعرف على الإنزيمات KpnI و BglII ، ويتم هضم كل من amplicon eGFP وبلازميد pLEXSY بالتتابع مع كلا الإنزيمين للربط اللاحق مع T4 ligase. 2) خطي بلازميد تعبير pLEXSY: يتم هضم بنية pLEXSY + eGFP باستخدام SwaI للخطية وتنقية شريط التعبير 7-8 كيلو بايت. 3) Transfection و 4) اختيار متعدد النسيلة: يتم نقل الليشمانيا promastigotes مع كاسيت التعبير عن طريق التثقيب الكهربائي ووضعها مرة أخرى في الثقافة لاختيار المضادات الحيوية من الطفيليات المؤتلفة. يتم تأكيد مضان الطفيليات من خلال قياس التدفق الخلوي. 5) تأكيد التكامل الجينومي و 6) الاستنساخ عن طريق الحد من التخفيف: يتم تأكيد تكامل شريط التعبير pLEXSY-eGFP بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصي ، باستخدام تهجين تمهيدي أمامي إلى كاسيت التعبير وتهجين تمهيدي عكسي إلى تسلسل كروموسومي غائب في كاسيت التعبير. ويمكن إثراء المستنبتات المنقولة للطفيليات الفلورية عن طريق الاستنساخ عن طريق الحد من التخفيف، ويمكن اختيار الحيوانات المستنسخة ذات أعلى متوسط كثافة فلورية لمزيد من التطبيقات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. تضخيم وإدخال جين eGFP في ناقل pLEXSY-2.1

1. تضخيم جين eGFP
   ملاحظة: نظرا لأن هذا البروتوكول يستخدم عائلة ناقلات pLEXSY-2.1 (انظر جدول المواد) للتعبير التأسيسي للبروتينات المستهدفة بعد دمج شريط التعبير في موضع الكروموسومات 18S rRNA (ssu) لأنواع الليشمانيا ، فإن الخطوة الأولى هي إدخال التسلسلات التي تحتوي على مواقع التقييد التي تسمح بإدخالها في متجهات pLEXSY-2.1 في جين eGFP. في هذه الحالة ، نظرا لأن eGFP مطلوب فقط للتعبير عن التحلل الخلوي ، فقد تمت إضافة مواقع التقييد للإنزيمين BglII و KpnI في النهايات 5 'و 3' لجين eGFP ، على التوالي. ينتج عن الاستنساخ باستخدام KpnI اندماج البروتين المستهدف في علامة polyhistidine C-terminal المكونة من ستة بقايا ، متبوعا بكودون توقف مشفر في بلازميد pLEXSY-2.1 لمزيد من تنقية البروتين محل الاهتمام. ولهذا السبب، لا يحتوي تتابع التمهيدي العكسي على كودون توقف.
   1. اعتمادا على مصدر البلازميد ل eGFP ، قم بتحليل التسلسل المستهدف باستخدام أداة تحليل التقييد مثل NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)³¹ للتأكد من أنه لا يحتوي على مواقع داخلية لإنزيمات التقييد المستخدمة في الاستنساخ (BglII و KpnI) أو ل SwaI ، وهو الإنزيم المستخدم في الخطية المتجهة قبل النقل.
   2. تصميم الاشعال الأمامية والخلفية لتضخيم eGFP الذي يحتوي على تسلسلات تقييد BglII و KpnI. على سبيل المثال ، كان مصدر eGFP لهذا البروتوكول هو البلازميد pEGFP-N1-1X³² ، وكانت تسلسلات التمهيدي هي تلك التي أبلغ عنها Bolhassani et ^al.27:
      التمهيدي الأمامي (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (موقع تقييد BglII بالخط العريض).
      التمهيدي العكسي (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (موقع تقييد KpnI بالخط العريض).
   3. تضخيم الجين المستهدف باستخدام بوليميراز عالي الدقة لضمان الحفاظ على تسلسل الترميز. على سبيل المثال ، بالنسبة للبادئات EGFP1 و EGFP2 ، قم بتشغيل بروتوكول ركوب الدراجات PCR كما أفاد Bolhassani et ^al.27. قم بتشغيل تمسخ أولي لمدة 2 دقيقة عند 94 درجة مئوية ، تليها 30 دورة من 30 ثانية عند 94 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 57 درجة مئوية ، و 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية. قم بتشغيل خطوة تمديد نهائية مدتها 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. أضف الاشعال بتركيز نهائي قدره 0.2 ميكرومتر.
   4. قم بتنقية الجزء باستخدام مجموعة تنقية منتج PCR التقليدية ، أو ترسيب أسيتات الصوديوم والإيثانول القياسي ، كما هو موضح في مكان آخر³³.
2. إدخال eGFP في متجه التعبير pLEXSY-2.1
   1. قم بقص نهايات منتج eGFP-PCR باستخدام BglII و KpnI ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
      1. أولا ، قم بإعداد تفاعل الإنزيم الذي يتطلب أقل تركيز للملح (في هذه الحالة ، KpnI) ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      2. ثم أضف 100 mM NaCl و 10 وحدات من BglII واحتضانها لمدة 15 دقيقة. تنقية التفاعل ، كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.
   2. هضم متجه التعبير pLEXSY مع BglII و KpnI ، باتباع بروتوكول الهضم المتسلسل الموضح في الخطوة 1.2.1.
   3. ربط ناقل pLEXSY وجين eGFP مع T4 ligase باستخدام نسبة مولية 1: 3 (المتجه: إدراج). أضف لفترة وجيزة 100 نانوغرام من pLEXSY المهضوم و 28 نانوغرام من منتج eGFP المهضوم إلى تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على مخزن مؤقت للربط عند تركيز نهائي قدره 1x و 3 وحدات من T4 DNA ligase. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
   4. تحويل خلايا الإشريكية القولونية المختصة ، مثل XL-10 أو DH5α أو DH10B ، مع منتج الربط الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.2.3 باستخدام بروتوكولات التحويل القياسية³³. صفيحة الخلايا المحولة في أجار Luira-Bertani (LB)-ampicillin واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية لاختيار الحيوانات المستنسخة المؤتلفة (تكون بلازميدات pLEXSY أكثر استقرارا في الإشريكية القولونية عند 30 درجة مئوية منها عند 37 درجة مئوية).
   5. شاشة لوجود إدراج في البلازميدات بواسطة مستعمرة PCR.
      1. اختر مستعمرات فردية ، وأعد تعليقها في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، وقم بتسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وخذ 1 ميكرولتر من المحللة كقالب للحمض النووي لمستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل. استخدم التمهيدي الأمامي لتضخيم eGFP ، الموضح في الخطوة 1.1.2 (في هذا المثال ، EGFP1) ، والتمهيدي A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') ككتاب تمهيدي عكسي²⁹.
      2. تم تصميم التمهيدي A264 لتلدين 80 bp بعد كودون التوقف للإدراج في متجهات التعبير pLEXSY-2.1. على سبيل المثال ، بالنسبة للزوج التمهيدي EGFP1 + A264 ، استخدم بروتوكول دورة PCR يتكون من تمسخ أولي لمدة 2 دقيقة عند 94 درجة مئوية ، متبوعا ب 30 دورة من 30 ثانية عند 94 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 50 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية. قم بتشغيل خطوة تمديد نهائية مدتها 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. تضاف الاشعال بتركيز نهائي يبلغ 0.2 ميكرومتر.
         ملاحظة: يبلغ طول المنتج المتوقع باستخدام مجموعة البرايمر هذه 859 نقطة أساس. تم تصوير مواقع التلدين للبادئات EGFP1 و A264 في الشكل 2.
   6. تحضير الحمض النووي البلازميد المنقى من استنساخ إيجابي للانتقال اللاحق باستخدام مجموعة عزل البلازميد التجارية أو الترسيب القلوي^{القياسي 33}. استخدم 50 مل من المزرعة الليلية عند 30 درجة مئوية لعزل ما لا يقل عن 10 ميكروغرام من البلازميد / الاستنساخ الإيجابي.

2. خطي بلازميد التعبير pLEXSY

1. استخدم ما لا يقل عن 10 ميكروغرام من بلازميد pLEXSY-eGFP المنقى للهضم مع SwaI (موقع التعرف: 5'-ATTTAAAT-3'). يهضم لمدة 3-4 ساعات عند 25 درجة مئوية ويعطل الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
2. قم بتشغيل منتج الهضم في هلام الأغاروز الكهربائي لفصل الأجزاء الناتجة. سيولد هذا الهضم جزأين ، جزء 2.9 كيلو بايت يمثل العناصر اللازمة للتكرار والانتقاء في الإشريكية القولونية ، وجزء 7-8 كيلو بايت يمثل شريط التعبير الخطي.
3. قم بتنقية كاسيت التعبير باستخدام مجموعة استخراج جل الأغاروز التجارية.

3. نقل L. panamensis و L. donovani عن طريق التثقيب الكهربائي

ملاحظة: يتم تنفيذ ثقافة الليشمانيا كما هو موضح في مكان آخر³⁴. في هذا المثال، تم استزراع L. panamensis و L . donovani promastigotes في وسط الحشرات في شنايدر، مع استزراع 20٪ (v / v) مصل بقري جنيني (FBS) و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين، وتم تحضينهما عند 26 درجة مئوية.

1. قم بتنمية مزارع الطفيليات حتى يكون هناك ما يكفي من promastigotes في المرحلة اللوغاريتمية أو المرحلة الثابتة المبكرة لاستخدام ما يقرب من 4 × 10⁷ طفيليات لكل عملية نقل. قد تختلف الكثافة القصوى للخلايا لكل دورق استزراع قبل الوصول إلى المرحلة الثابتة اعتمادا على أنواع الليشمانيا ومدى تكيف السلالات مع الظروف المختبرية. قم بتجميع محتويات قوارير الثقافة المتعددة إذا لزم الأمر.
2. أجهزة الطرد المركزي لثقافة الطفيليات عند 2000 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. أعد تعليق الحبيبات في محلول التثقيب الكهربائي عند 4 درجات مئوية (21 مللي مول HEPES ، 137 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 5 مللي مول KCl ، 0.7 مللي مول Na₂HPO₄ ، و 6 مللي متر جلوكوز ؛ درجة الحموضة 7.5) ²⁷ للحصول على تركيز 1 × 10⁸ طفيليات / مل. يوضع على الثلج لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: يجب تعقيم المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي عن طريق التصفية قبل الاستخدام.
4. في موازاة ذلك ، يتم بناء أنابيب ما قبل التبريد مع 2-10 ميكروغرام من pLEXSY-eGFP الخطي في حجم أقصى يبلغ 50 ميكرولتر من الماء أو 10 مللي متر عازلة tris (درجة الحموضة 8.0) و cuvettes التثقيب الكهربائي من d = 2 مم.
5. أضف 350 ميكرولتر من الطفيليات المبردة مسبقا إلى الأنبوب باستخدام البلازميد الخطي وانقل 400 ميكرولتر بالكامل إلى كوفيت التثقيب الكهربائي على الجليد. في موازاة ذلك ، إلكتروبور خلايا الطفيليات دون الحمض النووي البلازميد كعنصر تحكم سلبي.
6. إلكتروبورات باستخدام أحد هذين البروتوكولين:
   الاضمحلال الأسي: 450 فولت ، 450 ميكروفهرنهايت ، نبضة واحدة.
   ثابت الوقت: 450 فولت ، T = 3.5 مللي ثانية ، نبضة واحدة.
   ملاحظة: تم تشغيل هذه البروتوكولات باستخدام نبض الجينات التجاري (جدول المواد) مع وحدات الكمبيوتر الشخصي و CE.
7. ضع الكوفيت مرة أخرى على الثلج لمدة 10 دقائق وانقل الطفيليات المكهربة إلى 5 مل من وسط الاستزراع المناسب. استخدم هذا المثال وسط شنايدر للحشرات المكمل ب 20٪ (v / v) FBS. احتضان في 26 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.

4. الانتقاء متعدد النسيلة في الثقافة

1. حوالي 20 ساعة بعد التثقيب الكهربائي ، راقب الثقافات تحت المجهر. يجب أن يظهر ما لا يقل عن نصف سكان الطفيليات مورفولوجيا وحركة جيدة بصريا (promastigotes تشبه السقوط مع سوط متذبذب يتحرك عبر الوسائط و / أو يشكل مجاميع طفيليات نشطة). أضف المضاد الحيوي الانتقائي المناسب اعتمادا على بلازميد pLEXSY المستخدم. في هذا المثال ، يتم استخدام pLEXSY-sat2.1 ، والذي يحتوي على ستربتوثريسين أسيتيل ترانسفيراز كعلامة اختيار. لذلك ، استخدم نورسيوثريسين كمضاد حيوي انتقائي بتركيز 0.1 مجم / مل.
2. اتبع الثقافات مجهريا حتى يظهر فرق واضح بين الطفيليات المكهربة مع وبدون الحمض النووي البلازميد.
3. تحقق من مضان الطفيلي من خلال قياس التدفق الخلوي.
   1. جهاز طرد مركزي 1 مل من ثقافة الطور الثابت عند 2000 × جم لمدة 3 دقائق في RT. اغسل مرتين في برنامج تلفزيوني وأعد تعليق الحبيبات النهائية في 1 مل من PBS.
      ملاحظة: يمكن الكشف عن مضان eGFP في قناة FL1 لمعظم أجهزة قياس الخلايا التجارية. احصل على إعدادات للتشتت الأمامي والجانبي ، وقد تختلف قناة FL1 بين أجهزة قياس الخلايا. في هذا المثال ، تم استخدام مقياس خلوي لمساحة CyFlow (Sysmex).
   2. قم بتشغيل العينات ، وجمع 20000 حدث بسرعة 0.5 ميكرولتر / ثانية ، وقم بتعيين قيم الكسب لقنوات التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) ومضان 1 (FL-1) ك 225.0 و 200.0 و 520.0 على التوالي. قم بتشغيل عينة تحكم مع طفيليات غير فلورية لتحديد عدد الطفيليات في مخطط نقطة FSC مقابل SSC.
   3. قم بإنشاء بوابة (G1) تحتوي على مجموعة الطفيليات وقم بتصفية قناة FL-1 من خلال تلك البوابة لتحديد التألق الذاتي ل promastigotes وإعداد بوابة نطاق (G2) لقناة FL-1.
   4. قم بتشغيل الطفيليات المنقولة للتحقق مما إذا كان هناك مضان. سجل النسبة المئوية للطفيليات في G1 الفلورية ومتوسط شدة التألق في G2.

5. تأكيد التكامل الجينومي

ملاحظة: يمكن تأكيد تكامل كاسيت تعبير pLEXSY-eGFP عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصي ، باستخدام تهجين تمهيجي أمامي لكاسيت التعبير (يختلف اعتمادا على متجه pLEXSY-2.1 المستخدم) وتهجين التمهيدي العكسي F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') إلى تسلسل ssu-faffing الكروموسومي غائب في شريط التعبير. في هذا المثال ، يتم استخدام التمهيدي الأمامي F2999 (5'-CCTAGTATGATTTCGGTGATC-3') أثناء تهجينه في كاسيت التعبير pLEXSY-sat2.1. يصور الشكل 2 تمثيلا تخطيطيا لكاسيت التعبير المتكامل ومواقع التلدين التمهيدي لتشخيص تفاعل البوليميراز المتسلسل.

1. تنقية الحمض النووي الجينومي من 2-5 مل من ثقافة طفيلية ثابتة الطور عن طريق استخراج الفينول / الكلوروفورم التقليدي³⁵ أو باستخدام مجموعة تجارية.
2. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصي ل pLEXSY-sat2.1 باستخدام بروتوكول ركوب الدراجات الذي يتكون من تمسخ أولي لمدة دقيقتين عند 94 درجة مئوية ، تليها 30 دورة من 30 ثانية عند 94 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 53 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية. قم بتشغيل خطوة تمديد نهائية مدتها 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. تضاف الاشعال بتركيز نهائي يبلغ 0.2 ميكرومتر.

الشكل 2: تمثيل تخطيطي لشريط التعبير المتكامل. تمثل المربعات المسماة Chr-S (رمادية) التسلسلات الكروموسومية المجاورة لموضع 18S rRNA (ssu) الذي تم دمج كاسيت التعبير فيه. يتكون شريط التعبير المتكامل من تسلسلات 5 'و 3' (أزرق) لإعادة التركيب المتماثل في موضع ssu ، ومروج ريبوسومي إضافي لليشمانيا (أحمر) لتعزيز إنتاج البروتين ، وجين eGFP (أخضر) ، وجين علامة اختيار (أصفر) ، وثلاث مناطق غير مترجمة (رمادي فاتح) ، وهي utr1 و 2 و 3 ، والتي توفر إشارات الربط لمعالجة mRNA بعد النسخ للتعبير الأمثل عن eGFP وعلامة الاختيار في طفيليات الليشمانيا . يتم تمييز مواقع التلدين للبادئات الأمامية والخلفية المستخدمة للتحقق من وجود الإدراج بواسطة مستعمرة PCR (الخطوة 1.2.5) بالأسهم السوداء المسماة cpcr-fwd (التمهيدي EGFP1) و cpcr-rev (التمهيدي A264) على التوالي ، والتي تحدد منتج 859 bp. يتم تمييز مواقع التلدين للبادئات الأمامية والعكسية المستخدمة للتحقق من التكامل الجينومي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصي (الخطوة 5) بالأسهم السوداء المسماة sat-fwd (التمهيدي F2999) و ssu-rev (التمهيدي F3002) ، على التوالي ، والتي تحدد منتج 2,271 bp. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. الاستنساخ عن طريق الحد من التخفيف (اختياري)

1. بعد تأكيد التألق من خلال قياس التدفق الخلوي ، قم بإعداد تخفيف للطفيليات المؤتلفة بتركيز خمسة بروماستيجوتيس / مل³⁶.
2. أضف 100 ميكرولتر من هذا التخفيف في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. وبهذه الطريقة ، يتم زرع الصفائح بمتوسط كثافة 0.5 promastigotes / بئر ، مما يضمن أن بعض الآبار تتلقى طفيليا واحدا مع تقليل احتمال وجود أكثر من طفيلي واحد لكل بئر³⁶.
3. اترك اللوحة دون إزعاج لمدة 12 ساعة على الأقل. اتبع اللوحة مجهريا عند تكبير لا يقل عن 100x حتى يتم اكتشاف الآبار ذات نمو الطفيليات.
4. عندما يكون بئر الطبق مليئا بالطفيليات ، استخدم المحتوى لتلقيح ثقافة 5 مل. هذا يستغرق 1-2 أسابيع.
5. عندما تصل الثقافات المستنسخة إلى المرحلة الثابتة ، تحقق من التألق باستخدام قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح في الخطوة 4.3. حدد الحيوانات المستنسخة التي سيتم استخدامها لمزيد من المقايسات في المختبر وفي الجسم الحي بناء على النسبة المئوية للطفيليات الفلورية ومتوسط شدة التألق المقاسة في قناة FL-1. استهدف الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على 98٪ -99٪ من طفيليات الفلورسنت واختر تلك التي لديها أعلى متوسط كثافة مضان.

النتائج

بعد بناء بنية pLEXSY-eGFP وتحويل خلايا الإشريكية القولونية المختصة ، ستولد المستعمرات التي تحتوي على البنية مع إدراج eGFP منتجا يبلغ 859 نقطة أساس تقريبا بعد تشغيل مستعمرة PCR الموصوفة في القسم 1.2 (الشكل 3 أ). يجب أن يعطي الهضم الكلي للبلازميد المنقى من المستعمرات الإيجابية باستخدام SwaI شظيتين مميزتين في الرحلان الكهربائي الهلامي ، جزء 2.9 كيلو بايت وهو جزء من ناقل PLEXSY يحتوي على جميع العناصر اللازمة للتكرار والاختيار في الإشريكية القولونية ، وجزء 7-8 kpb يمثل ...

المناقشة

تمت دراسة مزايا وعيوب جينات المراسل المختلفة في العديد من الطفيليات الأولية. من بينها ، GFP و eGFP هي في جوهرها الفلورسنت وتسمح بسهولة القياس الكمي والتصوير. يمكن الكشف عن النشاط الفلوري لهذه البروتينات بأقل قدر من التلاعب باستخدام الفحص المجهري الفلوري أو القياس الفلوري أو قياس التدفق الخلوي. تم إجراء عدد قليل من الدراسات لتوليد L المعرب عن GFP. سلالات (فيانيا) ، على الرغم من المتانة الواضحة ل GFP ومشتقاتها كجينات مراسلة في أنواع الليشمانيا في العالم القديم¹⁵،

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
96 بئر Microplates	Corning	CLS3340	قاع مسطح شفاف ، بوليسترين أسود ، معقم ، غطاء
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
ملح الصوديوم	Ampicillin Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra ، مناسب لزراعة الخلايا
Bgl< / em>II إنزيم تقييد	نيو إنجلاند BioLabs	R0144S	2,000 وحدة. 10،000 وحدة / مل
قوارير زراعة الخلايا	CLS430168 مساحة		السطح 25 سم < سبر > 2 < / سوب> ، رقبة معلقة ، غطاء (ختم سدادة)
نظام التصوير ChemiDoc	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	غير متوفر
D- (+) - جلوكوز	سيجما-ألدريتش	G7021	مسحوق ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا ، مناسب لزراعة خلايا الحشرات ، مناسب لزراعة الخلايا النباتية ، & ge ؛ 99.5٪
مصل الأبقار الجنيني	سيجما-ألدريتش	F7524
جل تحميل العازلة	سيجما-ألدريتش	G2526	؛ يختلف معدل الهجرة باختلاف تكوين الجل. خفف 1: 3 إلى 1: 6 مع العينة قبل التحميل.
نظام التثقيب الكهربائي Gene Pulser Xcell	Bio-Rad	1652660	يتكون النظام من وحدة رئيسية ووحدتين ملحقتين وموسع السعة (وحدة CE) ووحدة التحكم في النبض (وحدة الكمبيوتر) وغرفة كوفيت ShockPod.
Gene Pulser / MicroPulser Electroporation Cuvettes	Bio-Rad	1652086	Pkg من 50 ، 0.2 سم & ndash ؛ كوفيت كهربائي معقم للفجوة ، للاستخدام مع أنظمة Gene Pulser و MicroPulser ، للثدييات والخلايا حقيقية النواة الأخرى
محلول Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	50 مجم / مل في الماء منزوع الأيونات ، السائل ، 0.1 & mu ؛ م مفلتر ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
محلول HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	1 M ، درجة الحموضة 7.0-7.6 ، معقم مفلتر ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا
المجهر المقلوب	Olympus	IXplore Standard
Kpn< / em>I-HF إنزيم تقييد	نيو إنجلاند BioLabs	R3142S	20,000 وحدة / مل
مرق LB مع أجار	Sigma-Aldrich	L3147	وسط نمو ميكروبي غني بالمغذيات عالي المرجع مع أجار ، مناسب للعادي & nbsp ؛ الإشريكية القولونية  ثقافة.
مرق LB	Sigma-Aldrich	L2542	نمو ميكروبي سائل متوسط
خلية فرعية صغيرة GT نظام الرحلان الكهربائي الأفقي	Bio-Rad	1640300	نظام الرحلان الكهربائي الأفقي الصغير ، يتضمن أمشاط 8 و 15 بئرا ، صينية شفافة للأشعة فوق البنفسجية 7 سم × 10 سم
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	التعبير عن eGFP mRNA مدمج مع تكرار ترادفي واحد لمجموعة
تعبير pLEXSYcon2.1	جينا علم الأحياء	EGE-1310sat	يحتوي على متجه التعبير التأسيسي التكاملي pLEXSY-sat2.1. اختيار المضادات الحيوية للأجهزة المتحركة مع نورسيوثريسين (NTC ، clonNAT). يحتوي على جميع البادئات لتشخيص PCRs والتسلسل.
كلوريد البوتاسيوم	ميليبور	529552	درجة البيولوجيا الجزيئية - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	حتى 15 & mu ؛ ز من البلازميد الجاهز للتعداء من 3 مل.
شنايدر & برايم; s الحشرة المتوسطة	Sigma-Aldrich	S0146	Medium المستخدمة في مختبرنا لزراعة الليشمانيا.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
كلوريد الصوديوم	Sigma-Aldrich	S3014	للبيولوجيا الجزيئية ، DNase ، RNase ، والبروتياز ، لم يتم الكشف عن أي منها ، & ge ؛ 99٪ (المعايرة)
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة	Sigma-Aldrich	RDD038	الكاشف الحيوي ، مناسب لزراعة الخلايا ، ومناسب لزراعة خلايا الحشرات ، & ge ؛ 99.0٪ ، انزيم تقييد Redi-Dri
SwaI	England BioLabs	R0604S	2,000 وحدة. 10,000 وحدة / مل
مرشحات حقنة	Corning	CLS431212	غشاء السليلوز المتجدد ، قطر. مم ، حجم المسام 0.2   ؛ مو m
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	نظام التدوير الحراري ، يتضمن جهاز تدوير حراري 96 بئر ، سلك طاقة ، حلقة دعم أنبوب
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	ينضم إلى خيطين من الحمض النووي بنهايات متماسكة أو حادة
Tris-Borate-EDTA عازلة	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent ، مناسبة للرحلان الكهربائي ، 10 & مرات مركز
معالج الحمض النووي الجيني طقم تنقية	Promega	A1120
Wizard SV جل ونظام تنظيف PCR	Promega	A9285
XL10-Gold Ultraefficiency Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultra Efficiency ، 10 × 0.1 مل. يتميز بجين مقاومة الكاناميسين على F 'episome ، للاستنساخ المتطلب للغاية في النواقل المقاومة للكلورامفينيكول. الكفاءة: > 5 × 10 9 محولات /& ميكرو ؛ ز pUC18 الحمض النووي.