نموذج الفئران لزراعة القلب غير المتجانسة خارج الموقع النورمومري

لا يزال زرع القلب هو العلاج الوحيد القابل للتطبيق لفشل القلب المقاوم^{للحرارة 1}،^2،3،4. على الرغم من الارتفاع المطرد في عدد المرضى الذين يحتاجون إلى زراعة القلب ، لم تلاحظ زيادة نسبية في توافر الأعضاء المانحة⁵. لمعالجة هذه المشكلة ، تم تطوير مناهج جديدة للحفاظ على قلوب المانحين بهدف تحسين التحديات وزيادة توافر المانحين⁶،^7،8،9.

ظهر نضح القلب خارج الموقع الطبيعي (NESHP) باستخدام آلات نظام العناية بالأعضاء (OCS) كتدخل سريري ^1,3. تم اعتبار هذه التقنية بديلا مناسبا لطريقة غرفة التبريد الثابتة التقليدية (SCS) ^2,9. يقلل NESHP بشكل فعال من مدة نقص التروية الباردة ، ويقلل من الطلب الأيضي ، ويسهل الإمداد الغذائي الأمثل والأوكسجين أثناء نقل الأعضاء المانحة^10,11. على الرغم من الإمكانات الواضحة لهذه الطريقة لتحسين الحفاظ على أعضاء المتبرعين ، إلا أن تطبيقها السريري والمزيد من التحقيق قد تم تقييده بسبب ارتفاع التكاليف. لذلك ، تعد النماذج الحيوانية قبل السريرية ل NESHP ضرورية لتحديد التحديات التقنية الرئيسية المرتبطة بهذه التقنية^12،13. الخنازير والجرذان هي النماذج الحيوانية المفضلة للدراسات قبل السريرية بسبب تحملها الإقفاري⁹. على الرغم من أن نموذج الخنازير مثالي للبحث الأساسي والانتقالي ، إلا أنه محدود بسبب تكلفته العالية والعمالة المكثفة المطلوبة للرعاية والصيانة. في المقابل ، نماذج الفئران أقل تكلفة وأسهل في التعامل معها¹⁴.

في هذه الدراسة ، نقدم نموذجا مبسطا للفئران من NESHP ، متبوعا بزراعة القلب غير المتجانس ، لتقييم تأثير تقنية الحفظ على حالة الكسب غير المشروع بعد الزرع. هذا النموذج واضح وفعال من حيث التكلفة ويمكن تنفيذه بواسطة مجرب واحد. يوضح الشكل 1 مخططات الإجراء.

اللجنة الأخلاقية لمركز أبحاث المختبر في مستشفى جامعة تشونام الوطنية (الموافقة رقم. CNU IACUC - H - 2022-36) وافق على جميع التجارب على الحيوانات. تلقى ذكور فئران Sprague-Dawley (350-450 جم) ، المستخدمة في هذه الدراسة ، الرعاية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر. تم إيواء الفئران في غرف يتم التحكم في درجة حرارتها مع دورة 12 ساعة من الضوء والظلام ، مع توفر الطعام والماء القياسيين.

1. التحضير

ملاحظة: يمكن لمجرب واحد إجراء جميع الإجراءات التجريبية.

1. قم بتجميع جهاز Langendorff ، بما في ذلك الأكسجين والمضخة وخطوط التروية ، قبل الجراحة (الشكل 2). املأ دائرة التروية ب 20 مل من المحلول الملحي وقم بتدويرها حتى يتم تحضيرها بالدم الذاتي.
   ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو تدفئة الدائرة خارج الجسم.
2. قم بتوصيل خط شلل القلب بالدائرة عبر المحبس المتصل بالقنية الأبهرية وقم بإعداد مضخة المحقنة للتسريب النهائي لشلل القلب.
   ملاحظة: تأكد من إزالة أي فقاعات هواء من دائرة التروية وخط شلل القلب.
3. ضع مستشعر درجة الحرارة داخل الخزان حيث سيتم تخزين قلب المتبرع ، مع الحفاظ على درجة حرارة الدائرة عند 37 درجة مئوية.
4. الاستعدادات الجراحية
   1. قم بإعداد مجموعة منفصلة من الأدوات والمواد الدقيقة المعقمة لكل متبرع وفأر متلقي.
      1. تحضير المجموعة الجراحية للمتبرع: زوج من المقصات الجراحية ، زوج من الملقط الدقيق ، ملقط البعوض الحاد ، 5-0 خيوط الحرير ، مسحات القطن ، حقنة 50 مل ، خط التروية لمحلول شلل القلب (CPS) ، مضخة حقنة ، قسطرة وعائية 18 G ، مجموعة واحدة من 5 Fr. قسطرة الفخذ ، وشاش معقم.
      2. قم بإعداد المجموعة الجراحية للمتلقي: مقص جراحي مجهري ، مبعدة للجرح ، زوج من الملقط الدقيق ، ملقط البعوض ، مشابك الأوعية الدموية الدقيقة ، حقنة 1 مل ، خيوط بولي بروبيلين واحدة 5-0 و 9-0 ، خيوط حرير 5-0 ، مسحات قطنية ، وشاش معقم.

2. الحفاظ على قلب المتبرع وجمع الدم

1. حث التخدير في الفئران المانحة مع إيزوفلوران (5 ٪) في غرفة التخدير وتسجيل وزن الفئران قبل وضعه على طاولة الجراحة.
2. ضع الجرذ في وضع الاستلقاء على الطاولة الجراحية وقم بتطبيق التخدير المستمر عن طريق توصيل 2٪ -2.5٪ إيزوفلوران مع 90٪ أكسجين من خلال مخروط الأنف.
3. تحقق من عمق التخدير عن طريق التحقق من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم وتكرار التنفس ، والذي يجب أن يكون بين 50-60 في الدقيقة.
   ملاحظة: مستوى مناسب من التخدير أمر بالغ الأهمية لتجنب الإجهاد والألم غير الضروريين للفأر المتبرع.
4. ضع مادة تشحيم للعين وحلق منطقة العانة على الترقوة ، حيث سيتم إجراء الجراحة. نظف المنطقة باستخدام مقشر يحتوي على اليود وكحول بنسبة 70٪.
5. القسطرة
   1. قم بعمل شق في منتصف البطن بطول 7 سم وشقوق ثنائية بقياس 3 سم من عملية الخنجري إلى منتصف الترقوة. إزالة القشرة من المنطقة الصدرية.
   2. باستخدام مسحات القطن ، قم بتعبئة أعضاء البطن إلى الجانب الأيسر من البطن. عزل الشريان الأورطي البطني عن اللفافة خلف الصفاق والأنسجة الدهنية.
   3. حقن 1000 وحدة دولية من الهيبارين المذاب في 0.3 مل من محلول ملحي متساوي التوتر من خلال الوريد الأجوف السفلي (IVC) باستخدام حقنة 1 مل. أوقف أي نزيف من فتحة الإبرة عن طريق الضغط برفق باستخدام قطعة قطن.
      ملاحظة: كن حذرا من انسداد الهواء أثناء الحقن ، لأنه يمكن أن يؤدي إلى السكتة القلبية.
   4. أدخل قسطرة الفخذ 5 Fr. في الشريان الأورطي البطني (Abd. A). تأكد من وصول طرف القسطرة إلى قوس الأبهر. تأكد من موقع القسطرة من خلال تقييم الطول التقريبي للجزء المدخل من القسطرة.
6. جمع الدم
   1. اجمع حوالي 10 مل من الدم عن طريق القسطرة التي تم إدخالها في عبد. أ.
   2. في وقت لاحق ، تمييع الدم فتيلة مع محلول ملحي متساوي التوتر حتى يصل الحجم الكلي إلى 12 مل. أضف 5 ملغ من سيفازولين المذاب في 0.3 مل من المياه المالحة والأنسولين (20 وحدة دولية).
7. السكتة القلبية
   1. قم بتوصيل خط نضح CPS المعد مسبقا بالقسطرة البطنية وابدأ في إدارة CPS بمضخة المحقنة بمعدل 800 مل / ساعة.
   2. افتح التجويف الصدري من الحجاب الحاجز واقطع IVC بالقرب من الحجاب الحاجز لمنع انتفاخ البطين. قطع الأضلاع بشكل ثنائي على طول العمود الفقري الصدري حتى مدخل الصدر. تعكس جدار الصدر البطني المتحرك بشكل متفوق مع ملقط البعوض.
   3. قم بإزالة الغدة الصعترية بالكامل باستخدام ملقط دقيق لتصور قوس الأبهر. تطبيق ضغط خفيف إذا نزفت الشرايين الغدة الصعترية.
8. إستخلاص
   1. بعد إعطاء جميع CPS ، عزل قوس الأبهر من الأنسجة المحيطة. تشريح بعناية أسفل الشريان تحت الترقوة الأيسر.
   2. قم بعبور الشرايين السباتية العضدية الرأسية واليسرى في موضع بعيد ، تاركا جذوع أطول من قوس الأبهر لسهولة التعامل معها أثناء قنية الشريان الأورطي. عبور الشريان الرئوي الرئيسي (MPA) أقرب ما يمكن إلى التشعب. كن حذرا حتى لا تتلف الزائدة الأذينية اليسرى.
   3. اربط بعناية الوريد الأجوف العلوي (SVC) و IVC بخيوط حريرية 5-0 ، مما يمنع انسداد الأذين الأيمن (RA) والجيوب التاجية. قم بتغطية الحواف اليسرى للصدر بشاش مبلل ، ضع القلب عليه واسحب أربطة SVC و IVC برفق لكشف الهيلوم.
   4. اربط الأوردة الرئوية والأزيجوس مع خياطة حرير 5-0. قطع الأنسجة الظهرية إلى الرباط واستخراج القلب. افحص القلب بحثا عن أي إصابة. أخيرا ، قم بوزن القلب قبل قنية الأبهر.

3. التروية خارج الموقع

1. قنية الأبهر والتروية
   1. قبل قنية الشريان الأورطي ، استبدل الدائرة المحضرة بالمحلول الملحي بفتيلة الدم.
   2. أدخل القنية الأبهرية في قوس الأبهر وقم بتثبيتها بمشبك دقيق مؤقت. تأكد من وضع طرف القنية عند التقاطع العضدي الرأسي.
   3. تأكد من الموضع الصحيح للقنية عن طريق إمساك الشريان الأورطي برفق باستخدام ملقط دقيق.
   4. ابدأ التروية بمعدل تدفق 2-3 مل / دقيقة ، مما يسمح للبيرفوسات بالتسرب من موقع القنية لإزالة أي فقاعات هواء.
   5. راقب ضغط التروية ودرجة الحرارة من خلال المستشعر المتصل بنظام المراقبة.
   6. قم بتدليك القلب برفق بإصبعي الإصبع الأول والسبابة حتى يتسرب الدم الوريدي من الشريان الرئوي الرئيسي (MPA).
   7. قم بتأمين الشريان الأورطي برباط حريري 1-0 وإزالة المشبك بعد التحقق من جميع الإعدادات (دائرة التروية ، ضغط التروية ، درجة الحرارة).
   8. بمجرد وضع الرباط الدائم ، تأكد من أن القلب يبدأ في الانقباض في غضون ثوان قليلة ويصل إلى الإيقاع الطبيعي في 60 ثانية. يشير متوسط ضغط التروية البالغ 55-65 مم زئبق مع معدل تدفق الشريان التاجي من 3-4 مل عند 37 درجة مئوية إلى التروية الكافية.
   9. اجمع 0.15 مل من الدم من الخزان وتحقق من تحليل غازات الدم (BGA) في بداية التروية وكل 20 دقيقة بعد ذلك. مراقبة وتسجيل الأس الهيدروجيني ، pCO 2 ، pO₂ ، الجلوكوز ، الهيماتوكريت ، البوتاسيوم ، واللاكتات أثناء التروية. بعد 120 دقيقة من التروية، يتم تطبيق 3 مل من الوديعة من خلال مضخة المحقنة بمعدل 250 مل/ساعة لإيقاف القلب.

4. زرع

1. إعداد المتلقي
   1. ابدأ تحضير المتلقي قبل 30 دقيقة من توقف التروية خارج الموقع .
   2. تخدير الحيوان المتلقي باستخدام نفس الطريقة المذكورة في الخطوة 2.2.
   3. ضع الجرذ في وضع ضعيف على وسادة التدفئة وأدخل مسبار درجة الحرارة في المستقيم للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية.
   4. ضع مادة تشحيم للعين ، واحلق العانة على منطقة شرسوفي ، ونظف المنطقة بفرك يحتوي على اليود وكحول بنسبة 70٪.
2. الادويه
   1. حقن 2 مل من المحلول الملحي الدافئ تحت الجلد لتعويض السوائل المفقودة أثناء الجراحة. حقن 200 وحدة دولية من الهيبارين تحت الجلد.
   2. تطبيق العلاج الوقائي بالمضادات الحيوية عن طريق حقن 10 ملغ/ كغ من سيفازولين المذاب في 0.3 مل من محلول ملحي تحت الجلد أو في العضل.
   3. يجب تطبيق التحكم في الألم عن طريق حقن 20 ملغ/ كغ من ديكلوفيناك تحت الجلد.
3. إجراء بضع البطن منتصف الخط وإدراج ضامد لتوسيع تجويف البطن. قم بتعبئة أعضاء البطن إلى الجانب الأيسر من المتلقي باستخدام مسحات القطن لإفساح المجال للإجراء.
4. منع الجفاف عن طريق لف أعضاء البطن بشاش دافئ ورطب. انشر محلول ملحي دافئ بشكل متقطع باستخدام حقنة سعة 50 مل أثناء الجراحة.
5. باستخدام مجهر جراحي بتكبير 10x ، قم بتعبئة الاثني عشر والصائم القريب عن طريق التشريح الحاد باستخدام مسحات القطن لفضح Abd. A. و IVC. جهز عبد. A و IVC للمفاغرة وزرع قلب المتبرع بشكل منهجي ، وفقا للشكل 3 أو الطرق الموثقة مسبقا¹⁵.
   ملاحظة: لا تفصل بين Abd. A. و IVC.
   1. بافتراض مفاغرة الأوعية الدموية ليتم وضعها تحت ، وإعداد جزء كاف من الشريان الأورطي و IVC لتثبيت.
   2. قم بإجراء تحضير حاد باستخدام مسحات قطنية أو ملقط مسنن حاد لإزالة الدهون واللفافة حول الأوعية.
   3. ضع 5-0 أربطة حريرية على الفروع المساريقية وكلا الجانبين القحفي والذيلية للأوعية الرئيسية. ارفع الأوعية البطنية وقم بتخثر أو ربط الفروع القطنية بخيوط من الحرير 5-0. تذكر أن تجنيب شرايين وأوردة الخصية ولا تشبكها.
   4. استخدم الأربطة لرفع الأوعية ووضع المشابك الدقيقة على الفروع المساريقية والجوانب الذيلية والجمجمة للأوعية الرئيسية لوقف تدفق الدم في موقع المفاغرة. أغلق وسادة التدفئة قبل وضع المشابك ، لأن التسخين الزائد يمكن أن يؤدي إلى تفاقم نقص تروية الأطراف. تأكد من تشغيل وسادة التدفئة بعد فك تثبيت الأوعية لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
   5. ثقب الشريان الأورطي باستخدام إبرة 27 G وإطالة الشق بمقص دقيق بطول يساوي أو أكبر قليلا من فتحة الشريان الأورطي الصاعد للمتبرع (Asc. A) ، وهو ما يقرب من 5 ملم.
   6. قم بعمل شق طولي على IVC بنفس طريقة بضع الأبهر ، ولكن اجعله أقرب بمقدار 3 مم إلى الجانب الذيلي مقارنة بشق الشريان الأورطي.
   7. بدء مفاغرة ، ووضع قلب المتبرع على الجانب الأيمن من بطن المتلقي وإرفاق المتبرع Asc. أ إلى عبد المستلم. A مع غرزة واحدة بسيطة متقطعة (9-0 البولي بروبلين) في الزاوية القحفية من شق طولي.
   8. انقل القلب إلى الجانب الأيسر من بطن المتلقي وقم بإجراء مفاغرة في Asc للمتبرع. أ مع عبد المستلم. أ باستخدام خياطة البولي بروبلين 9-0.
   9. ثبت الشريان الرئوي المتبرع ب IVC بخيطين متقطعين (9-0 بولي بروبيلين) في الزوايا الذيلية والجمجمة للشق الطولي.
   10. أداء النصف الأول من مفاغرة الوريدية من الجانب داخل اللمعة من السفينة واستكمال النصف الثاني من الجانب خارج اللمعة من الوعاء. قبل شد العقد ، اغسل الحقل بالمحلول الملحي لمنع انسداد الهواء.
6. نزع الهواء وإزالة لقط
   1. قم بإزالة مشبك الوريد المساريقي أولا بعد الانتهاء من المفاغرة للسماح للجانب الأيمن من القلب بالامتلاء بالدم الوريدي.
   2. إزالة الهواء في الدائرة التاجية و Asc. A. عن طريق تطبيق التروية التاجية إلى الوراء لعدة ثوان.
   3. ضع قطعة من الشاش على جانبي الأوعية وأزل المشبك الذيلي ومشبك الجمجمة.
   4. ضع ضغطا لطيفا بمسحات قطنية لمدة 1-2 دقيقة. بعد التأكد من الإرقاء الكافي ، قم بإزالة المسحات وغسل المفاغرة بمحلول ملحي دافئ.
      ملاحظة: يجب أن يبدأ القلب في النبض خلال الدقيقة الأولى من إعادة التروية. إذا كانت درجة حرارة جسم الجرذ المتلقي أقل من 35 درجة مئوية ، فإن إيقاع القلب سوف يعود إلى طبيعته بعد أن تصل درجة الحرارة إلى 36 درجة مئوية.
7. استبدل أعضاء البطن بطريقة تشبه التعرج وأغلق طبقات شق البطن باستخدام خيوط البولي بروبلين المستمرة 5-0.
8. بعد الجراحة ، ضع الحيوان المخدر على منطقة نظيفة فوق وسادة التدفئة حتى تصل درجة حرارة الجسم إلى 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: لا تبدأ فحوصات ما بعد الجراحة حتى تصل درجة حرارة الجسم إلى 37 درجة مئوية. الحفاظ على التخدير في 2-2.5 ٪ إيزوفلوران حتى نهاية التجارب.
9. مراقبة تخطيط القلب لقلب المتبرع المزروع لمدة 3 ساعات. ثم ، استئصال القلب تحت التخدير العميق للدراسات النسيجية.
   ملاحظة: تأكد من عمق التخدير عن طريق عدم وجود منعكس دواسة قبل استئصال القلب. تستغرق العملية الجراحية ومراقبة تخطيط القلب أقل من 6 ساعات. يتيح ديكلوفيناك ، الذي يتم إعطاؤه حول الجراحة (الخطوة 4.2.3.) ، إدارة الألم طوال مدة هذا الإجراء. يمكن تعديل نظام التسكين وفقا للإرشادات المؤسسية لاستخدام الحيوانات.

يوضح الشكل 1 التصميم التجريبي المستخدم في نموذج حيواني صغير. يعرض الشكل 2 جهاز نضح لانجيندورف المعدل، والذي يتضمن جهاز أكسجين حيواني صغير. يتم عرض ترتيب مفاغرة لزرع البطن غير المتجانس في الشكل 3.

يوضح الشكل 4 المعلمات المستخدمة لتقييم صلاحية القلب أثناء التروية خارج الموقع ، مثل اللاكتات والبوتاسيوم ومتوسط ضغط الأبهر. في هذه الدراسة ، أدى استخدام الحفظ الطبيعي الحرارة خارج الموقع إلى تقليل إجمالي الوقت الإقفاري لست حالات ناجحة إلى 46.2 ± 4.7 دقيقة ، بينما كان إجمالي وقت الخروج من الجسم 166.2 ± 4.7 دقيقة (الشكل 5). يتطلب استخراج القلب من المتبرع والتحضير للتروية خارج الموقع والزرع غير المتجانس 5.8 ± 1.3 دقيقة ، كما هو موضح في الشكل 5. كان معدل النجاح الإجمالي للجراحة 70٪ وكان متوسط وقت المفاغرة للحالات الست الناجحة 38.4 ± 3.4 دقيقة. في جميع التجارب، انخفض معدل ضربات القلب انخفاضا ملحوظا بعد الانغراس مباشرة، لكنه تعافى في النهاية بمرور الوقت، كما هو موضح في الشكل 6. تم الحفاظ على الهيكل الإجمالي لقلوب المتبرعين بشكل جيد بعد الحفظ خارج الموقع والزرع غير المتجانس ، مع عدم اكتشاف أي أضرار مرئية. ومع ذلك ، كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين عن زيادة عدد الخلايا الالتهابية ، ومعظمها من العدلات ، بعد 3 ساعات من الزرع غير المتجانس (الشكل 7).

الشكل 1: التصميم التجريبي لحفظ القلب الطبيعي الحرارة خارج الموقع مع زراعة القلب غير المتجانسة. الاختصارات: BGA = تحليل غازات الدم ، CPS = محلول شلل القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مخططات حفظ قلب الحيوانات الصغيرة المعدلة خارج الموقع . الاختصارات: مستشعر ضغط الدم = مستشعر ضغط الدم ، CPS = محلول شلل القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: ترتيب المفاغرة في زراعة القلب غير المتجانس. أ: مخططات موضع قلب المتبرع في بطن المتلقي وترتيب المفاغرة. ب: المتبرع الأبهر الصاعد ومفاغرة الشريان الأورطي البطني المتلقي. (ج) الشريان الرئوي المتبرع به والمتلقي مفاغرة IVC. الاختصارات: LV = البطين الأيسر ، RV = البطين الأيمن ، LA = الأذين الأيسر ، MPA = الشريان الرئوي الرئيسي ، IVC = الوريد الأجوف السفلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: بارامترات تقييم الجدوى أثناء التروية خارج الموقع الطبيعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: الجدول الزمني لحفظ القلوب الستة المحفوظة بنجاح. استخراج القلب وتسهيل التروية خارج الموقع: 5.8 ± 1.3 دقيقة. التروية خارج الموقع: 120 دقيقة. الزرع في بطن الجرذ المتلقي: 38.4 ± 3.4 دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: أداء الفيزيولوجيا الكهربية لقلب المتبرع قبل الشراء وبعد الزرع. أ: التغيرات في معدل ضربات القلب. ما قبل الحصاد ، 30 دقيقة ، 60 دقيقة ، 90 دقيقة ، 120 دقيقة ، 150 دقيقة ، 180 دقيقة: الأوقات بعد الزرع. (ب) صور تخطيط كهربية القلب قبل حصاد قلب المتبرع وبعد 3 ساعات من الزرع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: المظهر العياني (A-C) والمجهري (D-F) لقلب المتبرع. (أ، د) قبل الحفظ الطبيعي للحرارة خارج الموقع . (ب، ه) بعد الحفظ الطبيعي خارج الموقع . (ج، و) بعد 2 ساعة من زرع غير متجانسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.