مقالة منهجية

توليد المتصورة المعدلة وراثيا بيرغي سبوروزويتات

DOI:

10.3791/64992

⸱

مايو 5, 2023

 , 
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتقل الملاريا عن طريق تلقيح مرحلة sporozoite من البلازموديوم بواسطة البعوض المصاب. لقد سمحت لنا البلازموديوم المعدلة وراثيا بفهم بيولوجيا الملاريا بشكل أفضل وساهمت بشكل مباشر في جهود تطوير لقاح الملاريا. هنا ، نصف منهجية مبسطة لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الملاريا مرض قاتل يسببه طفيلي البلازموديوم وينتقل عن طريق لدغة أنثى بعوض الأنوفيلة . تخضع مرحلة sporozoite من Plasmodium التي يرسبها البعوض في جلد مضيفات الفقاريات لمرحلة من التطور الإلزامي في الكبد قبل بدء الملاريا السريرية. نحن نعرف القليل عن بيولوجيا تطور البلازموديوم في الكبد. يعد الوصول إلى مرحلة sporozoite والقدرة على تعديل هذه الأسبوروزويتات وراثيا من الأدوات الحاسمة لدراسة طبيعة عدوى المتصورة والاستجابة المناعية الناتجة في الكبد. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا. نقوم بتعديل مرحلة الدم وراثيا P. berghei ونستخدم هذا النموذج لإصابة بعوض الأنوفيليس عندما يتناولون وجبة دم. بعد أن تخضع الطفيليات المعدلة وراثيا للتطور في البعوض ، نقوم بعزل مرحلة sporozoite من الطفيلي من الغدد اللعابية للبعوض لإجراء تجارب في الجسم الحي وفي المختبر . لقد أثبتنا صحة البروتوكول من خلال توليد sporozoites من سلالة جديدة من P. berghei تعبر عن الوحدة الفرعية 11 من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (GFP11) ، ونوضح كيف يمكن استخدامها للتحقيق في بيولوجيا الملاريا في مرحلة الكبد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وعلى الرغم من التقدم المحرز في تطوير الأدوية والبحوث في مجال الوقاية من الملاريا وعلاجها، لا يزال عبء الملاريا العالمي مرتفعا. يموت أكثر من نصف مليون شخص بسبب الملاريا كل عام، مع أعلى مستويات الوفيات بين الأطفال الذين يعيشون في المناطق الموبوءة بالملاريا، مثل أفريقيا جنوب الصحراءالكبرى 1. تحدث الملاريا بسبب طفيلي البلازموديوم ، الذي ينتقل إلى البشر من خلال لدغة أنثى بعوض الأنوفيليس التي تحمل الطفيلي في الغدد اللعابية. تترسب المرحلة المعدية من المتصورة - sporozoites - في جلد مضيفات الفقاريات أثناء تناول وجبة الدم وتنتقل عبر مجرى الدم لإصابة خلايا الكبد ، حيث تخضع لتطور إلزامي (تشكل الملاريا قبل كرات الدم الحمراء) قبل إصابة كريات الدم الحمراء. تبدأ عدوى كريات الدم الحمراء مرحلة الدم من الملاريا وهي مسؤولة عن مجمل المراضة والوفيات المرتبطة بالمرض 2,3.

جعلت الطبيعة الإلزامية لتطور البلازموديوم قبل كريات الدم الحمراء هدفا جذابا لجهود تطوير اللقاح والأدويةالوقائية 4. شرط أساسي لدراسة بيولوجيا الملاريا قبل كريات الدم الحمراء ، وكذلك تطوير اللقاحات أو الأدوية التي تستهدف مرحلة الكبد ، هو الوصول إلى Plasmodium sporozoites. علاوة على ذلك ، كانت قدرتنا على توليد Plasmodium sporozoites المعدلة وراثيا مفيدة في نجاح هذه المساعي البحثية5،6،7،8،9. سمحت لنا خطوط البلازموديوم المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات مراسل الفلورسنت أو الإنارة بتتبع تطورها في الجسم الحي وفي المختبر10,11. الطفيليات الموهنة وراثيا (GAPs) ، الناتجة عن حذف جينات متعددة في البلازموديوم ، هي أيضا بعض من أكثر اللقاحات الواعدةالمرشحة 12,13.

ساعدتنا نماذج ملاريا الرئيسيات القوارض وغير البشرية على فهم آليات التفاعلات بين الطفيليات المضيفة في الملاريا البشرية بسبب أوجه التشابه في علم الأحياء ودورة الحياة بين أنواع المتصورة 14. يسمح استخدام أنواع البلازموديوم التي تصيب القوارض ، ولكن ليس البشر (على سبيل المثال ، P. berghei) بالحفاظ على دورة حياة الطفيليات الكاملة وتوليد sporozoites المعدية لدراسة الملاريا في مرحلة الكبد في بيئة خاضعة للرقابة من مستوى السلامة البيولوجية 1. توجد بالفعل مجموعة متنوعة من البروتوكولات المنفصلة لتوليد طفيليات البلازموديوم في مرحلة الدم المعدلة وراثيا 15 ، وعدوى البعوض16 ، وعزل sporozoites17. هنا ، نحدد بروتوكولا شاملا يجمع بين هذه المنهجيات من أجل توليد وعزل P. berghei sporozoites المعدلة وراثيا ، باستخدام السلالة المعدلة وراثيا الجديدة PbGFP11 كمثال. يتاجر PbGFP 11 بالشريط الحادي عشر β من بروتين الفلورسنت الأخضر فائق المجلد (GFP) ، GFP11 ، في الفجوة الطفيلية (PV) المتولدة في خلايا الكبد المضيفة. يستخدم PbGFP 11 جنبا إلى جنب مع خلايا الكبد المعدلة وراثيا (خلفية Hepa1-6) التي تعبر عن المخلفات التي تشكل جزء GFP 1-10 (GFP 1-10) في السيتوبلازم (خلايا Hepa GFP 1-10). يبلغ PbGFP11 عن تحلل PV في خلايا الكبد المضيفة من خلال التكامل الذاتي وإصلاح GFP الوظيفي وإشارة التألق الخضراء18. وتجدر الإشارة إلى أن GFP 11 مشفر كسلسلة من سبعة تسلسلات ترادفية في PbGFP11 لتعزيز إشارة التألق الناتجة. عند تلطيخ PbGFP11 sporozoites مع صبغة السيتوبلازم CellTrace Violet (CTV) ، يمكننا تتبع الطفيليات. يؤدي تحلل هذه الطفيليات داخل الخلايا الملطخة ب CTV نفسها إلى تسرب CTV إلى سيتوبلازم الخلية المضيفة وتلطيخ الخلية المضيفة. بالإضافة إلى تصور وتمييز تحلل Plasmodium PV و / أو الطفيلي في خلايا الكبد المضيفة ، يمكن استخدام هذا النظام بشكل موثوق لدراسة المسارات المناعية المسؤولة عن أي من هذه العمليات ، من خلال الاضطراب الجيني أو العلاجي للمكونات الجزيئية لهذه المسارات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع الأبحاث التي شملت الحيوانات الفقارية في مختبرنا وفقا لإرشادات وبروتوكولات استخدام الحيوانات بجامعة جورجيا.

1. جيل من الفئران المصابة ب P. berghei

  1. بدء عدوى مرحلة الدم في ذكور أو إناث ، الفئران C57BL / 6 (B6) البالغة من العمر 6-8 أسابيع باستخدام طفيليات P. berghei من النوع البري. للقيام بذلك ، قم بنقل الدم المصاب ب P. berghei المحفوظ بالتبريد (2 × 105 كرات الدم الحمراء المصابة) ، المعاد تشكيله في 400 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، إلى واحد أو اثنين من الفئران المانحة داخل الصفاق (i.p.).
  2. نقل الدم الطازج الذي تم جمعه من خلال النزيف الحجاجي الخلفي من الفئران المانحة في 5 أيام بعد الإصابة (d.p.i.) إلى فأرين ساذجين من B6. للقيام بذلك ، اجمع 200 ميكرولتر من الدم ، وأعد تكوينه باستخدام 300 ميكرولتر من PBS ، وحقن 200 ميكرولتر i.p. في الفئران المتلقية. تأكد من أن الطفيليات في المتبرعين في هذه المرحلة الزمنية هي 2٪ -5٪ 19،20.
  3. مراقبة الطفيليات كما هو موضح سابقا19،20 ، بدءا من 2 d.p.i. في المتلقين. عندما يتراوح الطفيلي من 3٪ -5٪ (حوالي 5 d.p.i.) ، القتل الرحيم للفئران المتلقية ثم جمع الدم من خلال ثقب القلب أو النزيف خلف الحجاج. القتل الرحيم للفئران باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم ، أو وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
    ملاحظة: بمجرد أن يتجاوز الطفيلي 5٪ ، قد تنخفض كفاءة النقل بسبب زيادة انتشار كرات الدم الحمراء المصابة بالضرب.

2. جيل الفصام في الثقافة

  1. اجمع الدم من الفئران المصابة في الخطوة 1.3 (حوالي 2 مل في المجموع من فأرين) إلى 5 مل من محلول Alsever (انظر جدول المواد) في بيئة معقمة. قم بتنفيذ الخطوات من 2.1 إلى 3.12 في ظل ظروف معقمة.
    ملاحظة: تشمل الظروف المعقمة ارتداء القفازات ، ومسح القفازات والأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واستخدام المواد الاستهلاكية والمواد المعقمة ، والعمل داخل خزانة السلامة البيولوجية.
  2. جهاز طرد مركزي الدم لمدة 8 دقائق عند 450 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT). تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسائط RPMI الكاملة (RPMI 1640 مع 20٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين ، v / v).
  3. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 450 × جم في RT. أعد تعليق الحبيبات في 25 مل من وسائط RPMI الكاملة وانقلها إلى دورق ثقافة T75 بغطاء مرشح.
  4. ضعه في حاضنة عند 36.5 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، مع رجه برفق لإبقاء الخلايا معلقة لمدة 16 ساعة.
  5. عند النقطة الزمنية 16 ساعة ، تحقق من تطور schizont. للقيام بذلك ، اجمع 500 ميكرولتر من العينة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 8 دقائق ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة ، وقم بإعداد مسحة دم رقيقة. تلطيخ لطاخة الدم مع صبغة Giemsa19 (انظر جدول المواد) وتحديد وتيرة الفصام (الشكل 1).
  6. لتحقيق الكفاءة المثلى للتنقل ، يجب أن يكون 60٪ -70٪ من الطفيليات في مرحلة الفصام. إذا تم تحديد أقل من هذا الحد ، فاستمر في الزراعة كما في الخطوة 2.4 وتحقق كل ساعة للتأكد من تجاوز العتبة المذكورة أعلاه قبل المتابعة.

3. نقل شيزونتس البلازموديوم

  1. قم بإعداد مخزن مؤقت للطرد المركزي متدرج عن طريق إعادة تكوين 13 مل من وسط مخزون تدرج الكثافة (انظر جدول المواد) مع 1.44 مل من 1.5 M NaCl و 5.6 مل من 0.15 M NaCl في أنبوب طرد مركزي 50 mL.
  2. نقل 25 مل من مزرعة الدم إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل. ضع بعناية 20 مل من المخزن المؤقت للطرد المركزي المتدرج في قاع أنبوب الطرد المركزي باستخدام ماصة زجاجية ضيقة لإنشاء عمود متدرج. احرص على عدم إزعاج طبقات السائل والواجهات وتأكد من وجود فصل واضح بين المخزن المؤقت والوسائط.
  3. جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 450 × جم بدون فرامل في RT. باستخدام ماصة باستور ، قم بإزالة طبقة schizont15 الموجودة في واجهة وسائط الثقافة ومخزن الطرد المركزي المتدرج بعناية ، وضعها في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.
  4. أعد تعليق schizonts المعزولة في وسائط RPMI كاملة وارفع الحجم الإجمالي إلى 40 مل. أجهزة الطرد المركزي في 450 × ز لمدة 8 دقائق في RT والتخلص من المادة الطافية.
  5. أعد تعليق schizonts في 10 مل من وسائط RPMI الكاملة. بعد ذلك ، قم بنقل 1 مل من هذا المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لكل عملية نقل ، وأجهزة طرد مركزي عند 16000 × جم لمدة 5 ثوان لتكوير كرات الدم الحمراء المصابة. يمكن استخدام كرات الدم الحمراء المصابة المشتقة من فأرين بالطريقة المذكورة أعلاه لما يصل إلى 10 عمليات نقل منفصلة.
  6. اجمع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي (محلول nucleofector من مجموعة التثقيب الكهربائي ؛ انظر جدول المواد) في RT مع 5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد المستهدف الدائري أو الخطي (بحد أقصى 10 ميكرولتر) ، حسب الاقتضاء لكل نقل في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة 1.5 مل. يجب تضمين عينة "بدون بلازميد" كعنصر تحكم في الانتقال واختيار المضادات الحيوية.
  7. قم بإزالة المادة الطافية بعد الطرد المركزي من الخطوة 3.5 وأعد تعليق كرات الدم الحمراء المصابة بعناية في محلول nucleofector المحضر + الحمض النووي البلازميد (من الخطوة 3.6).
  8. انقل المعلق (محلول nucleofector + بلازميد + شيزونت ؛ 110 ميكرولتر كحد أقصى) إلى كوفيت التثقيب الكهربائي. Transfect باستخدام برنامج nucleofector مناسب (U-033 ، انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تأكد من تنفيذ الخطوات من 3.8 إلى 3.10 في RT.
  9. أضف 100 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة إلى كوفيت وانقل المحلول بالكامل (الآن الحجم الإجمالي 200 ميكرولتر) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واحتفظ به في RT.
  10. حقن محلول 200 ميكرولتر من الطفيليات المنقولة في الفئران عن طريق الوريد (IV) ، والعمل على تقليل الوقت بين النقل والحقن النهائي في الفئران.
    ملاحظة: يتم حقن الفصاميات المنقولة في الفئران بعد أقل من 5 دقائق من التثقيب الكهربائي لزيادة كفاءة البروتوكول إلى أقصى حد.

4. اختيار الطفيليات المنقولة

  1. تحقق من مستويات الطفيليات في الفئران الملقحة بالفصام المنقولة يوميا من 2 d.p.i. للتحقق من العدوى.
  2. بمجرد التحقق من العدوى ، ابدأ في اختيار الدواء باستخدام تناول الدواء عن طريق الفم في مياه الشرب ، المقدمة حسب الطلب.
    ملاحظة: تم استخدام بيريميثامين كعلامة دواء قابلة للاختيار للبلازميد. في هذه الحالة ، تمت إضافة 17.5 ملغ من البيريميثامين إلى 250 مل من الماء النظيف (التركيز النهائي 70 ملغ / لتر). بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة 10 غرام من السكر إلى هذا الماء لتشجيع الاستهلاك الكافي للمياه المحتوية على البيريميثامين من قبل الفئران.
  3. مراقبة الطفيليات كل يومين باستخدام مسحات الدم المصنوعة من 5 ميكرولتر من الدم ، بدءا من 6 أيام بعد بدء علاج البيريميثامين. يشير عدم وجود طفيليات يمكن اكتشافها بعد 15 يوما إلى فشل عملية النقل. في هذه الحالة، أعد بدء العملية من الخطوة 1.1 لمحاولة جديدة.
  4. عندما يصل الطفيلي إلى 1٪ على الأقل ، قم بنقل الطفيليات إلى فئران B6 الساذجة لإنشاء مخزون طفيلي في مرحلة الدم. استمر في الانتقاء في الفئران المصابة حديثا حتى يصل الطفيلي إلى 2٪ -5٪ ، وعند هذه النقطة يولد مخزونا ويحفظها بالتبريد21.

5. إصابة البعوض بالخطوط المعدلة وراثيا

  1. تصيب الفئران B6 ب 200 ميكرولتر من الدم تحتوي على الطفيليات المختارة (2 × 105 كرات الدم الحمراء / الفئران المصابة ، أي IV.). تحديد الطفيليات في هذه الفئران في يوم تغذية البعوض والعدوى. الطفيليات بين 2 ٪ -5 ٪ هو الأمثل لعدوى البعوض. بمجرد التحقق ، قم بنقل العدوى على الفور إلى أنثى البعوض Anopheles stephensi وفقا للخطوات 5.2-5.4).
    ملاحظة: يجب الحفاظ على الحاضنات التي تحتوي على البعوض للعدوى عند 20.5 درجة مئوية ، عند رطوبة 80٪ ، وفي دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة (تضيء الأضواء بين الساعة 07:00 صباحا و 07:00 مساء).
  2. في اليوم السابق لإصابة البعوض ، افصل أنثى البعوض عن طريق وضع مصدر حرارة فوق القفص يحتوي على كل من البعوض الذكور والإناث ، مثل المثانة البلاستيكية الرقيقة أو القفاز المملوء بالماء الساخن إلى 37 درجة مئوية. قم بإزالة البعوض الأنثوي ، الذي ينجذب إلى مصدر الحرارة ، باستخدام شفاط الحشرات ونقله إلى قفص منفصل أصغر للعدوى.
    ملاحظة: يمكن تمييز ذكور البعوض عن إناث البعوض من خلال انخفاض حجم جسمها قليلا وهوائيات البرقوق.
  3. حقن الفئران المصابة بمخدر عام (على سبيل المثال ، 2٪ ثلاثي برومو إيثانول / أفيرتين). تأكد من التخدير الكامل عن طريق الضغط بقوة على وسادة القدم لكل ماوس. إذا لم تتفاعل ، فهي مخدرة بما فيه الكفاية وجاهزة لنقل العدوى إلى البعوض.
  4. ضع الفئران المخدرة فوق أنثى البعوض المحبوسة (من الخطوة 5.2) تحت راقد القص. انشر الأرجل الأمامية والخلفية يدويا لتوفير أكبر مساحة سطح لتغذية البعوض. اترك الفئران المصابة فوق كل قفص لمدة 15 دقيقة ، وتحقق كل 5 دقائق للتأكد من أن الفئران ليست مستيقظة. بمجرد اكتمال التغذية ، قم بالقتل الرحيم للفئران باستخدام خلع عنق الرحم ، أو وفقا لبروتوكول استخدام الحيوانات المؤسسي ، وتخلص منها بأمان.

6. مجموعة من sporozoites

  1. افحص الأمعاء الوسطى للبعوض بحثا عن البويضات عند حوالي 10 d.p.i. للتحقق من نجاح العدوى وتطور البلازموديوم داخل البعوض. عزل البعوض midguts من البطن عن طريق إزالة الجزء البطني النهائي باستخدام ملقط. تصور الأمعاء الوسطى تحت الضوء المستقطب لوجود البويضات22.
  2. من المتوقع أن تكون sporozoites من النوع البري موجودة في الغدد اللعابية للبعوض بعد 18-21 يوما من التغذية على الفئران المصابة. في اليوم 18 ، تشريح 5-10 البعوض لتقييم أعداد sporozoite.
    ملاحظة: يتم غسل البعوض وقتله في الإيثانول. بعد ذلك ، يتم غسل البعوض الميت مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة الحطام قبل التشريح.
  3. لعزل وعدد sporozoites ، قم بإزالة رأس البعوض بعناية أثناء الضغط على صدر البعوض باستخدام ملقط أو إبرة تشريح دقيقة. تظل الغدد اللعابية متصلة بالرأس الذي تمت إزالته (الشكل 2).
  4. قم بإزالة أي حطام إضافي للبعوض من الغدد اللعابية وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 400 ميكرولتر من وسائط تشريح البعوض (وسط Ealge المعدل من Dulbecco [DMEM] مع مصل فأر 1٪ ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ؛ انظر جدول المواد).
  5. تعطيل الغدد اللعابية المعزولة عن طريق المرور عبر حقنة إبرة 30 غرام 15-20 مرة. ضع 10 ميكرولتر من الغدد اللعابية المعطلة في وسائط تشريح البعوض في مقياس الدم والعد. إعادة التعليق في التركيز المطلوب لوسائط تشريح البعوض أو PBS للحقن في الفئران ، أو التلقيح في مزارع الخلايا ، أو الحفظ بالتبريد على المدىالطويل 23,24.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تحديد تواتر وتطور الفصام أمرا بالغ الأهمية لضمان وجود ما يكفي من الطفيليات القابلة للحياة في المرحلة المثلى للنقل. يمكن تمييز الفصاميات غير الناضجة عن الفصاميات الناضجة تماما من خلال وجود عدد أقل من الميروزويتات التي لا تملأ المساحة داخل الخلايا بالكامل لكرات الدم الحمراء (الشكل 1 ب). من المهم ملاحظة أنه عند إجراء مسحات الدم من الدم المزروع ، قد تنفتح كرات الدم الحمراء المصابة ، مما يؤدي إلى ملاحظة الميروزويتات الحرة خارج الخلية في لطاخة الدم (الشكل 1). لا ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد استخدمنا البروتوكول أعلاه في مختبرنا لإنشاء عدة خطوط من طفيليات P. berghei المعدلة وراثيا. على الرغم من أنه تم تحسينه ل P. berghei ، فقد استخدمنا هذا البروتوكول بنجاح لتوليد P. yoelii sporozoites المعدلة وراثيا. بعد حقن الفصاميات المنقولة في الفئران ، يمكن اكتشاف الطفيليات عادة في موعد لا يتجاوز 3 d.p.i. في جميع المجموعات ، بما في ذلك عدم التحكم في البلازميد. يبدأ الانتقاء فقط بمجرد اكتشاف الطفيليات لضمان صلاحية الطفيليات بعد التثقيب الكهربائي. بالإضافة إلى ذلك ، عند التحضير لاختيار الدواء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة AI168307 إلى SPK.  نشكر نواة قياس التدفق الخلوي UGA CTEGD ونواة الفحص المجهري UGA CTEGD. كما نعترف بمساهمات آش باثاك وآن إليوت وموظفي UGA Sporocore في تحسين البروتوكول. نود أن نشكر الدكتور دايتشي كامياما على الأفكار القيمة والمناقشة والبلازميدات الأم التي تحتوي على GFP11 و GFP 1-10. نود أيضا أن نشكر أعضاء مختبر Kurup على دعمهم المستمر وصبرهم وتشجيعهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
30 جم × 1/2 "إبرة حقنةExel international26437
حل Alsever:Sigma-AldritchA3551-500ML
Amaxa Basic طفيلي Nucleofector Kit 2LonzaVMI-1021
Avertin (2،2،2-Tribromoethanol)TCI AmericaT1420
أنابيب جمع الدم BDBioscience365967لجمع المصل
C-Chip مقياس الدم القابل للتصرفINCYTODHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture DishGreiner Bio-One627860
جهاز طرد مركزي 5425مركزيEppendorf
5910REppendorf5910Rللطرد المركزي
المتدرج Delta Vision II - نظام المجهر المقلوبأوليمبوسIX-71
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجماD5879-500 مل
مصل الأبقار الجنينيGenClone25-525
GFP11 البلازميدKurup LabpSKspGFP11تم إنشاؤه من PL0017 البلازميد
Giemsa StainSigma-Aldritch48900-1L-F
خلايا Hepa GFP1-10خلايا Kurup LabHepa GFP1-10تم إنشاؤها من خلايا Hepa 1-6 (ATCC Cat # CRL-1830)
مصلالمستخدم في وسائط تشريح البعوض
NaClMillipore-SigmaSX0420-51.5 M و 0.15 M لمحلول
percoll Nucleofector IIAmaxa Biosystems (Lonza)برنامج U-033 المستخدم في التثقيب الكهربائي RBC
ماصة باستورVWR14673-043
البنسلين / الستربتومايسينسيجما ألدريتشP0781-100ML
Percoll (وسيط مخزون التدرج الكثافة)Cytivia17-0891-02التفاصيل في البروتوكول
PL0017 موارد البلازميدBEIMRA-786
بيريميثامين (للإعطاء عن طريق الفم)Sigma46706تفاصيل التحضير: أضف 17.5 مجم بيريميثامين إلى 2.5 مل من DMSO. دوامة ، إذا لزم الأمر لتذوب تماما ؛ اضبط درجة الحموضة 225 مل من dH2O إلى 4 باستخدام HCL. أضف بيريميثامين في DMSO إلى الماء واتركه حتى 250 مل. أضف 10 جم من السكر لتشجيع الاستهلاك المنتظم للمياه المخدرة. بيريميثامين حساس للضوء. استخدم زجاجة داكنة أو زجاجة مغطاة بورق الألمنيوم عند علاج الفئران.
RPMI 1640Corning15-040-CV
برنامج الفحص المجهري SoftWoRxتطبيق الدقةv6.1.3
جهاز طرد 5405000107 الفأر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Geneva. World Health Organization. , 1(2020).
  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
  3. Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
  4. Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400(2020).
  5. Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
  6. Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
  7. Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7(2020).
  8. Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
  9. Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321(2014).
  10. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
  11. Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391(2015).
  12. Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
  13. Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198(2017).
  14. Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86(2014).
  15. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
  16. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426(2020).
  17. Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
  18. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046(2016).
  19. Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
  20. Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
  21. de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
  22. Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287(2019).
  23. Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098(2022).
  24. Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487(2022).
  25. Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة