ATAC-Seq الخاص بالخلايا الشحمية مع الأنسجة الدهنية باستخدام فرز النواة المنشطة بالفلورة

الأنسجة الدهنية ، المتخصصة في تخزين الطاقة الزائدة في شكل جزيئات دهنية ، هي عضو رئيسي لتنظيم التمثيل الغذائي. يعد التحكم الصارم في تكوين الخلايا الشحمية وصيانتها أمرا حيويا لوظيفة الأنسجة الدهنية وتوازن طاقة الجسم بالكامل¹. تلعب العديد من منظمات النسخ دورا مهما في التحكم في تمايز الخلايا الشحمية واللدونة والوظيفة. بعض هذه المنظمات متورطة في اضطرابات التمثيل الغذائي لدى البشر ^2,3. سهلت التطورات الحديثة في تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية للتعبير الجيني والتحليل فوق الجيني اكتشاف المنظمين الجزيئيين لبيولوجيا الخلايا الشحمية⁴. من الصعب إجراء دراسات التنميط الجزيئي باستخدام الأنسجة الدهنية بسبب عدم تجانس هذه الأنسجة. تتكون الأنسجة الدهنية بشكل أساسي من الخلايا الشحمية ، المسؤولة عن تخزين الدهون ، ولكنها تحتوي أيضا على أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية والخلايا المناعية⁵. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغيير التركيب الخلوي للأنسجة الدهنية بشكل كبير استجابة للتغيرات الفيزيولوجية المرضية مثل درجة الحرارة والحالة التغذوية⁶. للتغلب على هذه المشاكل ، قمنا سابقا بتطوير فأر مراسل معدل وراثيا ، يسمى الوسم النووي وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP) ، والذي ينتج الريبوسومات الموسومة ب GFP ونوى البيوتينيل الموسومة ب mCherry بطريقة تعتمد على Cre^{recombinase 7}. يمكن نظام وضع العلامات المزدوجة المرء من إجراء تحليل نسخي وفوق جيني خاص بنوع الخلية مع الأنسجة. باستخدام فئران NuTRAP المتقاطعة مع خطوط adiponectin-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية (Adipoq-NuTRAP) ، قمنا سابقا بتمييز ملفات تعريف التعبير الجيني وحالات الكروماتين من مجموعات الخلايا الدهنية النقية في الجسم الحي وحددنا كيفية تغييرها أثناء السمنة ^7,8. في السابق ، عبرت الفئران NuTRAP مع خطوط Ucp1-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية البنية والبيج (Ucp1-NuTRAP) سمحت لنا بتوصيف إعادة تشكيل epigenomic لسكان الخلايا الدهنية الحرارية النادرة ، الخلايا الشحمية البيج ، استجابة للتغيرات في درجات الحرارة⁹.

ATAC-seq هي طريقة تحليلية مستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مستوى الجينوم. يسمح ترانسبوزاز Tn5 شديد التفاعل المستخدم في ATAC-seq بتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة عن طريق وضع علامات على محولات التسلسل في المنطقة التي يمكن الوصول إليها من الكروماتين في النوى¹⁰. ATAC-seq هي طريقة بسيطة ، لكنها توفر نتائج قوية وكفاءة عالية حتى مع عينات منخفضة المدخلات. وبالتالي ، فقد أصبحت واحدة من أكثر طرق التنميط فوق الجيني شيوعا وساهمت في فهم الآليات التنظيمية للتعبير الجيني في سياقات بيولوجية متنوعة. منذ إنشاء بروتوكول ATAC-seq الأصلي ، تم تطوير العديد من التقنيات المشتقة من ATAC لتعديل وتحسين البروتوكول لأنواع مختلفة من العينات. على سبيل المثال ، تم تصميم Fast-ATAC لتحليل عينات خلايا الدم¹¹ ، و Omni-ATAC هو بروتوكول محسن لعينات الأنسجة المجمدة¹² ، و MiniATAC-seq فعال لتحليل الأجنة في المراحل المبكرة¹³. ومع ذلك ، فإن تطبيق طريقة ATAC-seq على الخلايا الشحمية ، وخاصة من عينات الأنسجة ، لا يزال يمثل تحديا. بالإضافة إلى عدم تجانس الأنسجة الدهنية ، قد يتداخل محتواها العالي من الدهون مع تفاعلات إعادة التركيب الفعالة بواسطة ترانسبوزاز Tn5 حتى بعد عزل النواة. علاوة على ذلك ، فإن المحتوى العالي من الميتوكوندريا في الخلايا الشحمية ، خاصة في الخلايا الشحمية البنية والبيج ، يسبب تلوثا عاليا للحمض النووي للميتوكوندريا وقراءات تسلسل مهدرة. تصف هذه الورقة بروتوكولا ل ATAC-seq الخاص بالخلايا الشحمية باستخدام فئران Adipoq-NuTRAP (الشكل 1). من خلال الاستفادة من فرز النواة المسمى بالفلورة ، يسمح هذا البروتوكول بجمع مجموعات نقية من نوى الخلايا الشحمية بعيدا عن أنواع الخلايا المربكة الأخرى والإزالة الفعالة للدهون والميتوكوندريا وحطام الأنسجة. وبالتالي ، يمكن لهذا البروتوكول إنشاء بيانات عالية الجودة خاصة بنوع الخلية وتقليل النفايات من قراءات الميتوكوندريا أثناء استخدام كمية أقل من المدخلات والكواشف مقارنة بالبروتوكول القياسي.

تم إجراء رعاية الحيوان والتجريب وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في كلية الطب بجامعة إنديانا.

1. الاستعدادات قبل بدء التجربة

1. تحضير الأنسجة
   1. لوضع العلامات على نواة الخلايا الشحمية ، قم بعبور الفئران NuTRAP مع خطوط adiponectin-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية (Adipoq-Cre) لتوليد فئران Adipoq-NuTRAP ، والتي تكون نصف متماثلة لكل من Adipoq-Cre و NuTRAP.
   2. تشريح الأنسجة الدهنية ذات الأهمية من الفئران Adipoq-NuTRAP كما هو موضح سابقا¹⁴.
   3. قم بتجميد الأنسجة في النيتروجين السائل ، وقم بتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تخزين كل وسادة دهنية ككل ، ويمكن قطع الأنسجة المجمدة لاحقا على الثلج الجاف إلى قطع أصغر (~ 50 مجم) لإجراء التجارب. بدلا من ذلك ، يمكن قطع الأنسجة الدهنية وتجميدها وتجميدها في أنابيب للتخزين (~ 50 مجم لكل أنبوب). لا يسمح أبدا للعينات المجمدة بالذوبان بعد التجميد حتى الاستخدام.
2. إعداد العازلة
   ملاحظة: احتفظ بالمخازن المؤقتة على الجليد طوال التجربة.
   1. تحضير المخزن المؤقت لإعداد النواة (NPB): 250 mM السكروز ، 10 mM HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 10 mM KCl ، 1.5 mM MgCl₂ ، و 0.1٪ NP40. تحضير 7 مل من NPB لكل عينة. أضف كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني 100x (النهائي 1x) ، DTT (النهائي 1 mM) ، و Hoechst (النهائي 1 ميكروغرام / مل) إلى NPB قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يوصى بإعداد NPB طازج ، ولكن يمكن تخزينه في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
   2. تحضير 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 0.1٪ NP-40 (PBS-N).

2. عزل النواة

1. زجاج التبريد ترتد المجانسات ، مع كوب واحد ترتد لكل عينة ، على الجليد. ثم أضف 7 مل من مزيج NPB إلى كل كوب Dounce.
   ملاحظة: يوصى باستخدام ما يصل إلى ثماني عينات في كل تجربة. إن العمل مع أكثر من ثماني عينات من شأنه أن يؤخر بشكل كبير جميع الخطوات ، وقد يقلل بشكل خاص من جودة النواة أثناء الفرز.
2. ضع الأنسجة الدهنية المجمدة (50-100 ملغ) في الزجاج Dounce ، وقم بتقطيعها على الفور إلى بضع قطع أصغر باستخدام مقص طويل. السكتة الدماغية 10x مع مدقة فضفاضة لجميع العينات ، ثم 10x مع مدقة ضيقة.
   ملاحظة: الأنسجة الدهنية ناعمة ، لذا يجب أن يكون تقطيعها إلى بضع قطع صغيرة كافيا. بالنسبة للعينات النادرة ، يمكن استخدام قطع أصغر (10-20 مجم) ، على الرغم من أن عدد نواة الخلايا الشحمية التي تم جمعها قد يختلف.
3. قم بالتصفية من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل. انقل التجانسات المفلترة إلى أنبوب جديد سعة 15 مل عن طريق الصب. تدور عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي متأرجح. إزالة طاف قدر الإمكان.
   ملاحظة: نضح أولا باستخدام فراغ، ثم قم بإزالة وحدة التخزين المتبقية باستخدام ماصة ميكروية.
4. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS-N عن طريق النقر بإصبع لطيف ولكن شامل.
   ملاحظة: تجنب سحب الخاصات، لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف النوى.
5. قم بالتصفية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل باستخدام ماصة لطيفة. شطف مصفاة مع 250 ميكرولتر من PBS-N. انقل إعادة التعليق النووي المصفى إلى أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) باستخدام ماصة ميكروية.
   ملاحظة: إذا كان ذلك متاحا ، يمكن استخدام الأنابيب ومصافي الخلايا لأحجام أصغر لتقليل فقد العينة.

3. فرز النواة

1. إعداد أنبوب التجميع
   1. أضف 500 ميكرولتر من PBS-N إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل ، واقلبها عدة مرات لتبليل جميع الأسطح الداخلية بالتخزين المؤقت.
   2. قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة لإسقاط كل السائل ، ثم قم بتبريدها على الجليد حتى الفرز.
2. FACS (الشكل 2)
   1. استخدم بوابة FSC-A / FSC-H للمفردات و FSC-A / SSC-A لإزالة الحطام الصغير أو الكبير.
   2. بوابة لسكان نواة الخلايا الشحمية الإيجابية mCherry / GFP.
   3. اجمع 10000 نواة في كل أنبوب من أنابيب التجميع المعدة في الخطوة 3.1.
3. تحضير نواة ما بعد الفرز
   1. أضف 500 ميكرولتر من PBS-N إلى كل أنبوب تجميع ، واقلبه عدة مرات للخلط.
   2. قم بتدوير أنابيب التجميع عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي متأرجح. تماما إزالة طاف.
      ملاحظة: استخدم مكنسة كهربائية أولا لإزالة الفقاعات ، واسكب المادة الطافية ، واستخدم مناديل ورقية لإزالة السائل المتبقي تماما. الحبيبات غير مرئية في هذه المرحلة. قم بإعداد الخليط الرئيسي Tn5 أثناء خطوة الطرد المركزي كما هو موضح أدناه.

4. علامات Tn5 (الجدول 1)

1. لتحضير 25 ميكرولتر من الخليط الرئيسي Tn5 ، امزج 12.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي للعلامات 2x (TD buffer) ، و 1.25 ميكرولتر من Tn5 transposase (إنزيم TDE I) ، و 11.25 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
2. أضف 25 ميكرولتر من الخليط الرئيسي Tn5 إلى كل نواة بيليه ، وأعد تعليقها عن طريق السحب اللطيف. احتضان في 600 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام خلاط حراري.

5. تنقية الحمض النووي

ملاحظة: يستخدم الإجراء التالي مجموعة تنقية PCR المذكورة في جدول المواد. يمكن استخدام أي طرق أخرى مماثلة لتنقية الحمض النووي.

1. أضف 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى 25 ميكرولتر من خليط إعادة تعليق نواة Tn5 الذي تم الحصول عليه بعد الخطوة 4.2. الحجم النهائي هو 50 ميكرولتر لكل عينة.
2. أضف 250 ميكرولتر من PB المخزن المؤقت.
3. أضف 5 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 M (NaOAc) (درجة الحموضة 5.2).
4. انقل الخليط إلى عمود (مرفق مع المجموعة المرجعية) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 17900 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
5. تخلص من التدفق ، وضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. أضف 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت PE المحتوي على الإيثانول المطلق (EtOH) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 17,900 × جم لمدة 1 دقيقة في RT.
6. تخلص من التدفق ، وضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. أجهزة الطرد المركزي في 17900 × غرام لمدة 1 دقيقة في RT ، وتجاهل أنبوب التجميع مع التدفق.
7. لاستئصال شظايا الحمض النووي ، جهز العمود بأنبوب جديد سعة 1.5 مل ، وأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB ، واتركه في RT لمدة 3 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في 17900 × غرام لمدة 1 دقيقة في RT.
   ملاحظة: يمكن تخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة أيام أو عند -20 درجة مئوية لأسابيع.

6. تضخيم PCR (الجدول 2)

ملاحظة: يتم سرد الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 3.

1. لتضخيم شظايا الحمض النووي المنقولة ، قم بإعداد خليط PCR الرئيسي دون إضافة برايمر تشفير شريطي Ad2.n فريد (التمهيدي # 2). استخدم 38 ميكرولتر من الخليط الرئيسي PCR لكل عينة: 11 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر Ad1_noMX التمهيدي (التمهيدي #1) ، و 25 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix.
2. أضف 38 ميكرولتر من خليط PCR الرئيسي في أنبوب PCR سعة 0.2 مل.
3. أضف 10 ميكرولتر من شظايا الحمض النووي المستخلصة من الخطوة 5.7.
4. أضف 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي # 2 ، والذي يجب أن يكون محددا لكل عينة.
5. قم بتشغيل PCR وفقا لظروف ركوب الدراجات الموضحة في الجدول 2.

7. اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) (الجدول 4)

ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى تحديد الدورات الإضافية اللازمة لتضخيم الحمض النووي. إنه اختياري ولكن يوصى به بشدة ، خاصة للتجارب الجديدة.

1. تحضير خليط qPCR الرئيسي دون إضافة التمهيدي # 2. استخدم 9.975 ميكرولتر من الخليط الرئيسي qPCR لكل عينة: 4.41 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، 0.25 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي # 1 ، 5 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix ، و 0.09 ميكرولتر 100x SYBR Green I.
   ملاحظة: لتحضير 100x SYBR Green I ، قم بتخفيف مخزون 10000x بالماء الخالي من النيوكلياز. نظرا لأن حجم 100x SYBR Green الذي استخدمته للخليط الرئيسي qPCR لا يكاد يذكر ، فمن الأسهل عمل خليط رئيسي إضافي من 100x SYBR Green I المخفف (على سبيل المثال ، ل 8-10 عينات).
2. أضف 9.975 ميكرولتر من الخليط الرئيسي qPCR في كل بئر من لوحة qPCR.
3. أضف 0.25 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي # 2 في كل بئر.
   ملاحظة: تأكد من إضافة نفس التمهيدي # 2 لمطابقة ما تمت إضافته إلى كل عينة محددة في الخطوة 6.4.
4. أضف 5 ميكرولتر من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي تم الحصول عليه بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الخطوة 6.5 ، واخلطه عن طريق الماصة.
   ملاحظة: سيتم استخدام 45 ميكرولتر المتبقية من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني.
5. قم بتشغيل qPCR وفقا لظروف ركوب الدراجات الموضحة في الجدول 5.
6. تحقق من منحنيات التضخيم ، وحدد عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل الإضافية المطلوبة من خلال تقدير عدد الدورات التي وصلت ~ 35٪ من الحد الأقصى (الشكل 3 أ).
   ملاحظة: عادة ، تتطلب 10000 نواة من خمس إلى ثماني دورات PCR إضافية.

8. تضخيم PCR إضافي

1. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام كل ال 45 ميكرولتر المتبقية من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا للحسابات من الخطوة 7.6 (الجدول 6).
   ملاحظة: قد تتطلب كل عينة عددا مختلفا من دورات التضخيم.

9. تنقية الحمض النووي الثانية باستخدام مجموعة تنقية PCR

1. استخدم نفس الإجراءات كما في القسم 5 ، ولكن قم بإزالة شظايا الحمض النووي المضخمة ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB.

10. اختيار حجم جزء الحمض النووي

ملاحظة: استخدم حبات تثبيت عكسية ذات طور صلب ، كما هو موضح أدناه. يمكن استخدام أي حبات أخرى مماثلة لتنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يجب إعادة تعليق تعليق حبة SPRI بالكامل وموازنتها عند RT مع الدوران قبل الاستخدام.

1. انقل الحمض النووي المستخلص إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد ، وأضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB لعمل حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.
2. أضف 55 ميكرولتر من حبات SPRI (حجم عينة 0.55x) ، واخلطها عن طريق الماصة. احتضان لمدة 5 دقائق في RT ، ثم افصله على حامل مغناطيسي صغير لشرائط PCR ذات 8 أنابيب لمدة 5 دقائق.
3. نقل 150 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب PCR جديد. أضف 95 ميكرولتر من حبات SPRI ، واخلطها عن طريق الماصة.
   ملاحظة: يحتوي العنصر الطافي على حمض نووي يبلغ حوالي 500 نقطة أساس أو أصغر.
4. احتضان لمدة 5 دقائق في RT ، ثم افصلها على الحامل المغناطيسي الصغير لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية بعناية.
5. اغسل الخرز لمدة 1 دقيقة مع 200 ميكرولتر من 70٪ EtOH. كرر مرتين لمدة ثلاث غسلات في المجموع.
   ملاحظة: لا تحرك أنابيب PCR من الحامل المغناطيسي أثناء الغسيل.
6. بعد الغسيل النهائي ، قم بتدوير الأنابيب عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وقم بسحب EtOH المتبقي. جفف الحبيبات مع فتح الغطاء عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة على جهاز PCR.
   ملاحظة: يجب أن تعرض كريات الخرز بعض الشقوق الطفيفة فقط بمجرد تجفيفها. تجنب الإفراط في التجفيف.
7. أعد تعليق الحبيبات ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB عن طريق السحب ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في RT. افصلها على الحامل المغناطيسي الصغير لمدة 5 دقائق ، ثم انقل 18 ميكرولتر من المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة النهائية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
   ملاحظة يمكن تخزين المكتبة في -20 درجة مئوية أثناء إجراء فحص الجودة.

11. قياس كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور

1. لتحضير الخليط الرئيسي ، قم بتخفيف كاشف 200x dsDNA عالي الحساسية (HS) باستخدام المخزن المؤقت dsDNA HS إلى تركيز نهائي قدره 1x.
2. بالنسبة للمعايير ، أضف 190 ميكرولتر من الخليط الرئيسي 1x و 10 ميكرولتر من المعيار 1 أو المعيار 2 إلى أنبوب مقياس الفلور.
   ملاحظة: قم بموازنة المعايير في RT في الظلام قبل البدء في القياس الكمي.
3. بالنسبة لعينات المكتبة ، أضف 198 ميكرولتر من الخليط الرئيسي 1x و 2 ميكرولتر من كل عينة إلى أنبوب مقياس فلوري منفصل.
   ملاحظة: إذا كانت كميات العينة محدودة ، فيمكن تقليل حجم العينة إلى 1 ميكرولتر ، ويمكن زيادة حجم الخليط الرئيسي 1x إلى 199 ميكرولتر.
4. دوامة أو هز أنابيب الفلورومتر ، واتركها تجلس لمدة 5 دقائق في RT في الظلام. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقايسة dsDNA HS لمقياس الفلورومتر.

12. فحص جودة المكتبة بواسطة أنظمة الرحلان الكهربائي عالية الحساسية

1. خذ مكتبة ATAC-seq ، وقم بتخفيفها بالماء الخالي من النيوكلياز إلى تركيز نهائي يبلغ 1-5 نانوغرام / ميكرولتر.
2. تحليل توزيع حجم مكتبات ATAC-seq باستخدام أنظمة الرحلان الكهربائي الآلية عالية الحساسية التي تتبع بروتوكولات الشركة المصنعة.

13. فحص جودة مكتبة ATAC-seq باستخدام qPCR المستهدف

1. خذ 5-10 نانوغرام من مكتبة ATAC-seq ، وقم بتخفيفها ب 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
2. قم بتشغيل qPCR باستخدام الباشيلي الذي يستهدف المروجين والمعززات المعروفة بأنها نشطة في الخلايا الشحمية وفقا لظروف الدورة المشار إليها في الجدول 7.
3. استخدم بادئات التحكم السلبية التي تستهدف المناطق الجينومية المغلقة / الصامتة (الجدول 7).
4. احسب إثراء المروج / المعززات على الضوابط السلبية (الجدول 8).
   ملاحظة: من المتوقع أن نرى ≥10-20 ضعفا مع عينات ناجحة.

14. التسلسل

1. أرسل مكتبات ATAC-seq للتسلسل. استخدم تسلسل النهاية المزدوجة (2 × 34 نقطة أساس ، 2 × 50 نقطة أساس أو أكثر) بمتوسط أرقام قراءة يتراوح بين 10 و 30 مليون قراءة لكل عينة.

لتحليل الأنسجة الدهنية باستخدام بروتوكول ATAC-seq هذا ، قمنا بإنشاء فئران Adipoq-NuTRAP التي تم تغذيتها على وجبات الطعام. ثم قمنا بعزل نوى الخلايا الشحمية من الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية (eWAT) والأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT) والأنسجة الدهنية البنية (BAT) باستخدام قياس التدفق الخلوي. تم استخدام النوى المعزولة لوضع العلامات ، تليها تنقية الحمض النووي ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وخطوات فحص الجودة ، والتسلسل ، وتحليل البيانات ، كما هو موضح أعلاه. كان الغرض من هذه التجربة التمثيلية هو تحديد إمكانية الوصول إلى الكروماتين لمجموعات الخلايا الشحمية النقية المعزولة من مستودعات الدهون المختلفة.

لاحظنا أن نوى الخلايا الشحمية التي تحمل علامة mCherry و GFP يمكن تمييزها بوضوح عن نوى أنواع الخلايا الأخرى المعزولة من الأنسجة الدهنية لفأر Adipoq-NuTRAP باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 2A-C). كانت هناك اختلافات في كسور الخلايا الشحمية اعتمادا على نوع المستودع الدهني: ~ 50٪ في eWAT ، ~ 30٪ في iWAT ، و ~ 65٪ في BAT (الشكل 2D) 7. جمعنا 10000 نواة في غضون 2-10 دقائق لكل عينة واستخدمناها في إجراءات ATAC-seq. أجرينا ما مجموعه 10-13 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (خمس دورات من تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول وخمس إلى ثماني دورات من تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني ، الشكل 3 أ). إذا كانت العينات تتطلب أكثر من إجمالي 15 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فقد يشير ذلك إلى عينات منخفضة الجودة (الشكل 3 ب). أظهر تحليل توزيع الحجم لمكتبات ATAC-seq قمم متعددة تتوافق مع المنطقة الخالية من النيوكليوسومات (NFR) والنيوكليوسومات الأحادية والثنائية والمتعددة (الشكل 4A-C) ، بمتوسط أحجام ~ 500-800 bp. أظهرت العينات ذات الجودة الرديئة عادة في الغالب NFR مع عدم وجود قمم نووية أو عدد قليل منها (الشكل 4D). أظهرت اختبارات فحص الجودة بواسطة تحليل qRT-PCR إثراء 10-20 ضعفا بالعناصر الجينومية الإيجابية بالقرب من جينات علامات الخلايا الشحمية مثل Adipoq و Fabp4 و Plin1 و Pnpla2 ، بينما لم يظهر أي إثراء مع التحكم السلبي (الشكل 5). لاحظنا أيضا التخصيب باستخدام الجين الحراري Ucp1 على وجه التحديد في BAT ولكن ليس في eWAT أو iWAT (الشكل 5).

بعد التسلسل والتحليل ، حددنا ~ 55000 قمة مجتمعة من ثلاثة مستودعات دهنية مختلفة (eWAT و iWAT و BAT). كانت قراءات الميتوكوندريا <2٪ ، وكان الكسر تحت القمم ~ 18٪ -44٪ (الشكل 6 أ ، ب). قد تحتوي العينات ذات الجودة الرديئة على قراءات ميتوكوندريا أعلى بكثير و / أو جزء أقل من القراءات في مناطق الذروة. كشف الفحص البصري لمسارات مكتبة ATAC-seq عن قمم قوية متعددة ذات نسب إشارة إلى ضوضاء عالية بالقرب من جينات علامات الخلايا الشحمية ، مثل Adipoq و Plin1 و Fabp4 ، من جميع المستودعات الدهنية (الشكل 7A-C). لاحظنا أيضا قمم ATAC-seq قوية في موضع صانع الخلايا الشحمية البنية Ucp1 في عينة BAT ، ولكن لم يتم ملاحظة هذه القمم في عينات eWAT أو iWAT (الشكل 7D). تشير كل هذه البيانات إلى بيانات ATAC-seq الناجحة الناتجة عن نوى الخلايا الشحمية.

الشكل 1: مخطط انسيابي تخطيطي ل ATAC-seq الخاص بالخلايا الشحمية باستخدام فئران NuTRAP. يتم تمييز الخطوات الفريدة لهذا البروتوكول في المربعات المظللة باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: بوابة FACS التمثيلية التي توضح عزل نوى الخلايا الشحمية الموسومة ب mCherry / GFP من الأنسجة الدهنية لفأر Adipoq-NuTRAP. (أ-ج) تحليل التدفق الخلوي للنوى المعزولة من eWAT و iWAT و BAT لفأر Adipoq-NuTRAP. د: التحليل الكمي للنوى المأخوذة من الخلايا الشحمية وغير الشحمية في eWAT و iWAT و BAT لفأر Adipoq-NuTRAP. البيانات هي متوسط ± SEM (ن = 3). بيانات عدد النوى هذه مأخوذة من Roh et al.7. الاختصارات: FACS = فرز الخلايا المنشط بالفلورة ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ eWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. iWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. NuTRAP = وضع العلامات النووية وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم ؛ Adipoq-NuTRAP = فأر NuTRAP متقاطع مع خط adiponectin-Cre الخاص بالخلايا الشحمية ؛ FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ FSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الأمامي ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FITC-A = منطقة ذروة الفلوريسئين إيزوثيوسيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: منحنيات التضخيم التمثيلي من qRT-PCR . (أ) عينة جيدة النوعية تحتاج إلى سبع دورات تضخيم إضافية. ب: عينة رديئة النوعية تحتاج إلى ≥15 دورة إضافية. اختصار: qRT-PCR = النسخ العكسي الكمي PCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: ملفات تعريف توزيع الحجم لمكتبات ATAC-seq. (أ-ج) يتم عرض المكتبات ذات النوعية الجيدة و (د) ذات الجودة الرديئة كنتائج تمثيلية. الاختصارات: ATAC-seq = مقايسة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية ؛ FU = وحدات مضان ؛ BP = أزواج القاعدة ؛ NFR = منطقة خالية من النيوكليوسوم ؛ eWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. iWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تحليل qPCR لمراقبة الجودة لمكتبات ATAC-seq. إثراء المروجين والمعززات بالقرب من علامات الخلايا الدهنية العامة Adipoq و Fabp4 و Plin1 و Pnpla2 أو علامة الخلايا الدهنية البنية Ucp1. الاختصارات: ATAC-seq = مقايسة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية ؛ NC = السيطرة السلبية ؛ eWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. iWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. البيانات هي متوسط ± SEM (ن = 2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: قراءات الميتوكوندريا والكسور تحت قمم مكتبات ATAC-seq. (أ) تقرأ الميتوكوندريا (٪) و (ب) الكسور تحت القمم (٪) من eWAT و iWAT و BAT. الاختصارات: ATAC-seq = مقايسة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية ؛ eWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. iWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: تتبع إشارة ATAC-seq في مواضع الجينات التمثيلية. (A-C) جينات علامة الخلايا الشحمية العامة. ب: علامة خاصة بالخلايا الشحمية البنية. الاختصارات: ATAC-seq = مقايسة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية ؛ eWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. iWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مكونات الخليط الرئيسي Tn5. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مكونات الخليط الرئيسي PCR وظروف دورة PCR الأولية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: قائمة البادئات المشفرة لتضخيم PCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: مكونات الخليط الرئيسي qPCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: ظروف ركوب الدراجات qPCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 6: ظروف دورة PCR الثانية لتضخيم إضافي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 7: تسلسلات التمهيدي وظروف دورة qPCR المستهدفة لفحص جودة مكتبة ATAC-seq. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 8: تحليل نتائج qPCR لفحص الجودة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية ذات صلة أو مادية تتعلق بالبحث الموصوف في هذه الورقة.