إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر

Marie Bannier-Hélaouët; Maarten H. Geurts; Jeroen Korving; Harry Begthel; Hans Clevers

doi:10.3791/65040

مقالة منهجية

إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر

DOI:

10.3791/65040

⸱

فبراير 3, 2023

Marie Bannier-Hélaouët¹^,² , Maarten H. Geurts¹^,² , Jeroen Korving¹ , Harry Begthel¹ , Hans Clevers¹^,²

¹Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), University Medical Center Utrecht, ²Oncode Institute, Hubrecht Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء عضويات الغدة الدمعية المشتقة من الفئران الأولية والأنسجة البشرية وصيانتها وتعديلها وراثيا وتمييزها وظيفيا وتوصيفها وظيفيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدة الدمعية عضو أساسي في الاتزان الداخلي لسطح العين. من خلال إنتاج الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع ، فإنه يحمي العين من إجهاد الجفاف والشتائم الخارجية. لا يعرف سوى القليل عن فسيولوجيا الغدة الدمعية (المرضية) بسبب عدم وجود نماذج كافية في المختبر . أثبتت تقنية Organoid نفسها كمنصة تجريبية مفيدة لأعضاء متعددة. هنا ، نشارك بروتوكولا لإنشاء وصيانة عضويات الفئران والغدة الدمعية البشرية بدءا من خزعات الغدة الدمعية. من خلال تعديل ظروف الاستزراع ، نقوم بتعزيز وظائف الغدة الدمعية العضوية. يمكن فحص وظائف العضوي من خلال فحص "البكاء" ، والذي يتضمن تعريض عضويات الغدة الدمعية لناقلات عصبية مختارة لتحفيز إطلاق الدموع في تجويفها. نفسر كيفية تصوير هذه الظاهرة وقياسها. لدراسة دور الجينات المهمة في الاتزان الداخلي للغدة الدمعية، يمكن تعديلها وراثيا. نحن نصف بدقة كيفية تعديل عضويات الغدة الدمعية وراثيا باستخدام المحررين الأساسيين - من تصميم دليل الحمض النووي الريبي إلى التنميط الجيني للاستنساخ العضوي. أخيرا ، نوضح كيفية التحقيق في الإمكانات التجديدية لعضويات الغدة الدمعية البشرية عن طريق زرع تقويم العظام في الفأر. توفر مجموعة الأدوات الشاملة هذه معا موارد لاستخدام عضويات الفئران والغدد الدمعية البشرية لدراسة فسيولوجيا الغدة الدمعية (المرضية).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدة الدمعية هي الظهارة الغدية المسؤولة عن إنتاج معظم الطبقة المائية للفيلم المسيل للدموع¹. لا تحتوي الطبقة المائية من الفيلم المسيل للدموع على الماء لتليين سطح العين فحسب ، بل تحتوي أيضا على ذخيرة كبيرة من المكونات المضادة للميكروبات التي تحمي سطح العين من العدوى². عندما تتلف الغدة الدمعية أو تلتهبها ، يحدث مرض جفاف العين ، مما يؤدي إلى عدم الراحة للمرضى ويمكن أن يؤدي في النهاية إلى فقدان الرؤية³. على مر السنين ، كانت الأنظمة النموذجية لدراسة الغدة الدمعية ، وخاصة الغدة البشرية ، محدودة⁴،⁵^،⁶. وقد ساهم ذلك في حدوث فجوة معرفية فيما يتعلق بوظيفة الغدة الدمعية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نماذج في المختبر لدراسة الغدة الدمعية في طبق⁷،⁸^،⁹. تستمد عضويات الغدة الدمعية هذه من الخلايا الجذعية البالغة التي تزرع كهياكل ثلاثية الأبعاد في مصفوفة خارج الخلية تكملها مجموعة من عوامل النمو التي تحافظ على قدراتها التجديدية في المختبر⁷. تتمثل ميزة الكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة (ASC) في أنه يمكن الحفاظ عليها لفترة طويلة جدا مع تلخيص ميزات الأنسجة السليمة. يتكون هذا النوع من الكائنات العضوية فقط من الخلايا الظهارية ، على عكس الكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) ، والتي قد تحتوي أيضا على خلايا انسجة ، على سبيل المثال. على عكس الكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) ، يتم إنشاء عضويات ASC مباشرة من الأنسجة البالغة ولا تتطلب أي تعديلات وراثية لتوسيعها. تعبر عضويات ASC عن خصائص البالغين¹⁰.

يحتوي هذا البروتوكول على صندوق أدوات لاشتقاق عضويات الغدة الدمعية من الفئران والأنسجة الأولية البشرية. يصف البروتوكول كيفية زيادة تعزيز وظائف المواد العضوية عن طريق الانسحاب البسيط لعامل النمو وكيفية إثارة الكائنات العضوية لإفراز السائل المسيل للدموع عن طريق إجراء فحص التورم. يتضمن هذا البروتوكول أيضا طريقة نقل تعتمد على التثقيب الكهربائي لهندسة عضويات الفئران وراثيا باستخدام برامج تحرير القواعد المشتقة من كريسبر. على عكس Cas9 التقليدي ، يسمح استخدام برامج التحرير الأساسية بتعديل القواعد الفردية في الجينوم دون توليد كسر مزدوج تقطعت بهم السبل^11,12. أخيرا ، يتم وصف زرع الأعضاء التناسلية للغدة الدمعية البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة والتقييم النسيجي اللاحق للتطعيم. يمكن استخدام مجموعة الأدوات العضوية للغدة الدمعية هذه في البحث عن تجديد الغدة الدمعية ووظيفتها ونمذجة الأمراض الوراثية والالتهابية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على تجارب الفئران من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان التابعة للأكاديمية الملكية الهولندية للفنون والعلوم (KNAW) بموجب ترخيص المشروع AVD8010020151. تم اشتقاق المواد العضوية من المواد الفائضة للفئران. تم جمع خزعات الغدة الدمعية البشرية من فضلات المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية في المركز الطبي الجامعي في أوتريخت (UMCU) بعد موافقة لجنة الأخلاقيات الطبية بموجب البروتوكول رقم 18-740. يحتوي البروتوكول على عدة أقسام موضحة في الشكل 1.

figure-protocol-1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. يسلط هذا الشكل الضوء على الخطوات المختلفة للبروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: جميع التراكيب المتوسطة والعازلة موصوفة في الجدول التكميلي 1.

1. إنشاء عضويات من الفئران والغدد الدمعية البشرية

تشريح الغدة الدمعية للفأر
1. قم بإعداد أدوات التشريح ، بما في ذلك المقص والملقط ومنصات التشريح. القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق O₂ / CO^{2 13}.
2. ضع الفأر الرحيم على بطنه على وسادة التشريح ، وقم بتثبيت أطرافه. بلل الشعر الموجود بين آذان الماوس وعلى الجبهة باستخدام 70٪ إيثانول.
3. باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل فتحة خلف الجمجمة بين الأذنين. مد هذه الفتحة على الجبهة حتى الأنف. لا يزال يستخدم المقص ، وقطع الجلد خلف الأذنين لتوليد اثنين من اللوحات.
4. اسحب السديلات باتجاه الأنف بقوة حتى تنكشف الغدد الدمعية، كما هو موضح في الشكل 2 أ. ثبت اللوحات على وسادة التشريح. باستخدام المقص ، قم بعمل شق صغير في الغشاء الموجود فوق الغدة الدمعية لكشف الغدة الدمعية تماما.
5. باستخدام ملقط ، وسحب الغدة الدمعية. يجب أن يكون هناك بعض المقاومة حتى تمزق القناة الدمعية الرئيسية. إذا كنت تفضل ذلك ، قم بقطع القناة الدمعية الرئيسية مباشرة بالمقص.
6. ضع الغدة الدمعية للفأر في برنامج تلفزيوني من درجة زراعة الأنسجة حتى تتم معالجة أخرى. المضي قدما في معالجة الغدة الدمعية في غضون 2-4 ساعات للحد من موت الخلايا. إذا استغرق ذلك وقتا أطول ، ضع الغدة الدمعية للفأر في وسط جمع الخزعة (الجدول التكميلي 1).
  ملاحظة: يمكن تجميع العديد من الغدد الدمعية إذا كانت هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من الكائنات العضوية على الفور.
جمع خزعات الغدة الدمعية البشرية
1. قبل الجراحة ، قم بإعداد حصص 20 مل من وسط جمع الخزعة (الجدول التكميلي 1) في أنبوب سعة 50 مل ، وأعطها للجراح قبل الجراحة. يمكن الاحتفاظ بهذه الوسيلة عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
2. في يوم الجراحة ، دع الجراح يأخذ عينة من قطعة من الغدة الدمعية (عادة <1 مم³) ، وقم بتخزينها في وسط جمع الخزعة (الجدول التكميلي 1) عند 4 درجات مئوية.
3. جمع الخزعة لمعالجتها في أقرب وقت ممكن. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون هذا في نفس اليوم خلال 2 ساعة من أخذ عينات الخزعة.
الاشتقاق العضوي
1. قم بإعداد ما يلي مسبقا: مصفوفة مذابة خارج الخلية (ECM) ، فأر درجة حرارة الغرفة (RT) أو وسط تمدد بشري (الجدول التكميلي 1) ، كولاجيناز مذاب ، وسط أساسي (الجدول التكميلي 1) ، مشرطان ، طبق بتري 10 سم ، مصفاة 70 ميكرومتر مثبتة على أنبوب سعة 15 مل ، وألواح تعليق 12 بئرا مسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. تحضير وسط الهضم من خلال الجمع بين جميع المكونات الموضحة في الجدول التكميلي 1. بلل المشارط مسبقا في هذه الوسيلة لتجنب التصاق قطع الأنسجة بها.
3. استرجع أنسجة الفأر أو الغدة الدمعية البشرية من الوسط ، وضعها في طبق بتري.
4. باستخدام المشارط المبللة مسبقا ، قم بفرم الأنسجة. بمجرد أن تصبح قطع الأنسجة صغيرة جدا (أي <0.5 مم³) ، ضعها في وسط الهضم عن طريق كشطها من طبق بتري بالمشرط. إذا كانت الخزعة البشرية صغيرة جدا بالفعل ، فضعها مباشرة في وسط الهضم دون فرمها لتجنب فقدان الأنسجة.
5. احتضان قطع المناديل لمدة تصل إلى 15 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية. اقلب الأنبوب سعة 15 مل بانتظام لإعادة تعليق القطع. راقب تفكك الخلايا تحت مجهر منضدة حتى لا تفرط في هضم الأنسجة.
6. في غضون ذلك ، قم بتضييق ماصة باستور عن طريق وضع طرفها في اللهب أثناء الدوران ، وقم بترطيبها مسبقا في الوسط الأساسي. لفصل الأنسجة بكفاءة ، تأكد من أن الثقب أصغر قليلا من أكبر قطع الأنسجة المتبقية. لتسهيل عملية التفكك ، قم بسحب الخليط لأعلى ولأسفل كل 5 دقائق باستخدام ماصة باستور الضيقة المبللة مسبقا.
7. عندما تكون العديد من الخلايا المفردة والكتل الصغيرة مرئية تحت المجهر ، أوقف التفكك بإضافة 10 مل من الوسط الأساسي. تدور لأسفل في 400 × غرام لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا.
8. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من الوسط الأساسي لتكرار الغسيل. قم بترشيحه من خلال مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة قطع الأنسجة الكبيرة غير المهضومة وألياف الكولاجين المتبقية ، مما يمنع البلمرة الكافية ل ECM. أدر الشطف عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
  ملاحظة: تشير حبيبات الخلايا الحمراء إلى وجود خلايا الدم الحمراء ، والتي عادة لا تعيق اشتقاق الكائنات العضوية. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض التطبيقات ، مثل قياس التدفق الخلوي ، يجب تحليل خلايا الدم الحمراء. لذلك ، احتضان الخلايا في 5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء الطازجة في RT لمدة 5 دقائق ، وحبيبات الخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
9. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من ECM البارد للغدة الدمعية لفأر واحد وفي 50 ميكرولتر من ECM البارد لخزعة بشرية. عند إعادة الضبط ، كن حذرا حتى لا تصنع فقاعات ، لأنها ستؤثر أيضا على بلمرة ECM واستقرارها.
10. بذر ما يصل إلى 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر من لوحة تعليق 12 بئرا. استخدم P200 لعمل قطرات ~ 20 ميكرولتر في البئر. كلما كانت القطرات أصغر ، كان انتشار عوامل النمو والمواد المغذية أفضل من خلال المصفوفة.
11. ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة مرطبة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة للسماح ل ECM بالتصلب.
12. بمجرد ترسيخ ECM ، أضف ~ 1 مل من ماوس RT أو وسيط التمدد البشري لكل بئر من 12 لوحة بئر. قم بتحديث الوسط كل 2-3 أيام حتى تصل المواد العضوية إلى حجم 300 ميكرومتر. لذلك ، قم بشفط الوسط في البئر ، وأضف وسط التمدد برفق على جانب البئر دون لمس قطرات ECM حتى لا تعطلها.
  ملاحظة: يمكن إضافة بريموسين (100 مجم / مل ؛ 1: 1000 من المخزون التجاري) عند العزل في حالة حدوث تلوث بكتيري. ومع ذلك ، نظرا لأنه يبطئ نمو الأعضاء أيضا ، فمن الأفضل عدم إضافته أو إزالته بعد مرور واحد أو مقطعين.

2. توسيع الفأر وعضويات الغدة الدمعية البشرية

بعد ~ 7 أيام لعضويات الماوس و ~ 10 أيام للعضويات البشرية ، عندما تصل المواد العضوية إلى حجم ~ 300 ميكرومتر ، قم بإزالة وسط الاستزراع.
أعد تعليق قطرات ECM التي تحتوي على المواد العضوية في 1 مل من محلول التربسين عن طريق السحب بقوة لأعلى ولأسفل باستخدام P1,000 حتى تنهار القطرات. انقل هذا الخليط إلى أنبوب سعة 15 مل ، واحتضنه لفترة وجيزة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
بعد 2-3 دقائق ، استخدم ماصة باستور الضيقة والمبللة مسبقا لسحب التعليق العضوي لأعلى ولأسفل 10x-15x. تحقق من حالة تفكك المواد العضوية تحت المجهر على الطاولة ؛ يجب الحصول على كتل صغيرة من ~ 20 خلية. احتضن لفترة أطول في حمام مائي 37 درجة مئوية ، وكرر خطوة السحب حتى يصبح التفكك مرضيا.
ملاحظة: قد تستغرق هذه الخطوة وقتا أطول للعضويات البشرية لأنها متعددة الطبقات. سيتم إنشاء خلايا مفردة. هذا لا يؤثر على النمو العضوي طالما أن معظم تعليق العضو يتكون من كتل صغيرة.
أوقف التفكك بإضافة 10 مل من الوسط الأساسي. ثم, بيليه الخلايا في 400 × غرام لمدة 5 دقائق.
بعد إزالة المادة الطافية و ECM التي قد توضع فوق المواد العضوية (طبقة شفافة تشبه الهلام بدون عضويات) ، أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من ECM البارد قبل الطلاء في لوحة تعليق ، كما هو موضح في الخطوة 1.3.10.
ملاحظة: بشكل عام ، يتم تقسيم الكائنات العضوية الدمعية للفأر بنسبة 1: 5 والكائنات العضوية البشرية بنسبة 1: 3. هذا يعني أنه عند البدء بالمواد العضوية الموجودة في 100 ميكرولتر من ECM ، يجب إعادة تعليقها في 500 ميكرولتر و 300 ميكرولتر ، على التوالي ، بعد الانقسام.
احتضن اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تصلب ECM لمدة 30 دقيقة ، وقم بتغطية الكائنات العضوية بالماوس أو وسط التمدد البشري في RT.

3. حفظ الفئران وعضويات الغدة الدمعية البشرية بالتبريد

للحفاظ على المواد العضوية بالتبريد ، قم أولا بتقسيم الكائنات العضوية في وسط التمدد وفقا للتعليمات الواردة في القسم 2.
بعد حوالي 3-4 أيام ، عندما تكون الكائنات العضوية في مرحلة النمو ، قم بإزالة الوسط ، وأعد تعليق 100 ميكرولتر من المواد العضوية المحتوية على ECM في 10 مل من وسط القاعدة الباردة. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق للمساعدة في فصل ECM. اقلب الأنبوب بانتظام لتسهيل هذه العملية.
بيليه المواد العضوية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات العضوية في 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد (بقايا ECM لا تضعف الحفظ بالتبريد). انقل المعلق العضوي إلى المبرد وعلى الفور إلى الفريزر -80 درجة مئوية.
ملاحظة: عند استخدام وسيط الحفظ بالتبريد الموصوف في جدول المواد ، يمكن الاحتفاظ بالتبريد إلى أجل غير مسمى في مجمد -80 درجة مئوية. إذا تم استخدام وسيط آخر للحفظ بالتبريد ، فقم بنقل المبرد إلى خزان النيتروجين السائل بعد 24 ساعة لضمان الحفظ الأمثل.
لإذابة المواد العضوية ، استرجع المبرد من الفريزر ، وانقله على ثلج جاف إلى حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. امسك المبرد في الماء حتى تذوب معظم محتوياته. انقل المحتويات إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من الوسط الأساسي ، وقم بتدوير الخلايا لأسفل عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
قم بطلاء المواد العضوية في 100 ميكرولتر من ECM بوسط التمدد ، كما هو موضح في الخطوة 2.5 والخطوة 2.6.

4. التمييز بين عضويات الغدة الدمعية وتقييم وظائفها

التمايز العضوي
1. للتمييز بين عضويات الغدة الدمعية ، قم أولا بتقسيم الكائنات العضوية في وسط التمدد وفقا للتعليمات الواردة في القسم 2.
2. بعد يومين، استبدل وسيط التمدد بالماوس أو وسيط التمايز البشري كما هو موضح في الخطوة 1.3.12. قم بتحديث الوسط كل 2-3 أيام للحفاظ على عضويات الماوس لمدة 5 أيام في هذا الوسط والكائنات العضوية البشرية لمدة 9 أيام.
3. لتقييم التمايز العضوي بعد 5 أيام أو 9 أيام في وسط التمايز ، اجمع 100 ميكرولتر من ECM تحتوي على عضويات لاستخراج الحمض النووي الريبي. للقيام بذلك ، أعد تعليق قطرات ECM في 1 مل من الوسط الموجود في البئر باستخدام P1,000 ، ونقل التعليق العضوي في 3 مل من وسط قاعدة الجليد البارد. بيليه المواد العضوية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق.
4. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي. قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي في اتجاه مجرى النهر وفقا لتعليمات مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي. استخدم الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه ، على سبيل المثال ، لتحليل RT-qPCR للتعبير عن الخلايا الجذعية (TP63 ، KRT5 ، KRT14) وعلامات الخلايا المتمايزة (LCN2 ، WFDC2 ، AQP5 ، LTF ، ACTA2 ...) ¹⁴.
  ملاحظة: للحصول على تحليل التعبير ذي الصلة ، قم بقياس تعبير العلامات المختارة في عينة واحدة أو عدة عينات من الأنسجة. تميل المواد العضوية المستزرعة في ظل ظروف التمايز إلى احتواء كمية أقل من الحمض النووي الريبي.
مقايسة التورم الوظيفي
ملاحظة: بالنسبة لهذا الجزء من البروتوكول ، استخدم عضويات الغدة الدمعية البشرية التي تم تمييزها لمدة 7 أيام على الأقل. الحد الأدنى للوقت المطلوب هو 7 أيام لضمان تعبير علامة كافية للتمزق الوظيفي. يشكل كل بئر من صفيحة 12 بئرا شرطا واحدا. الحد الأدنى لعدد الشروط هو ثلاثة: عنصر تحكم إيجابي ، وتحكم سلبي ، وحالة اختبار.
1. تحضير طازج 1 مل من وسط التمايز البشري الذي يحتوي على مكونات فردية تحفز إفراز عضويات الغدة الدمعية. على سبيل المثال ، أضف 100 ميكرومتر نورادرينالين و 1 ميكرومتر فورسكولين ، واخلطها جيدا.
  ملاحظة: فورسكولين بمثابة السيطرة الإيجابية التي عادة ما تؤدي إلى أقصى قدر من التورم.
2. في مجهر الفاصل الزمني الآلي برايت فيلد ، قم بإعداد المواضع المراد تصويرها في اللوحة ، والفاصل الزمني (5 دقائق) ، والمدة (4 ساعات). تأكد من أن قطرة ECM كاملة مرئية في كل موضع.
3. قبل البدء في التصوير مباشرة ودون تحريك اللوحة من المجهر ، قم بإزالة وسط الاستزراع من الآبار التي سيتم تصويرها ، واستبدلها بالوسط المعاد تعليقه جيدا المعد في الخطوة 4.2.1. قم بتضمين بئر مع استبدال وسط التمايز بوسط التمايز فقط كعنصر تحكم سلبي ، حيث قد يؤدي المرطبات المتوسطة إلى بعض التورم العضوي.
4. بعد ما يصل إلى 4 ساعات ، انتهى فحص التورم. تحليل النتائج.
  ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوات باستخدام مجهر EVOS M7000 الذي يسمح بالتصوير الآلي بفاصل زمني ساطع. للحصول على هذا المجهر ، راجع دليل الشركة المصنعة التفصيلي لإعداد تصوير الفاصل الزمني. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام أي مجهر آخر له خصائص مماثلة.
5. لتحديد التورم العضوي ، قم بقياس قطر كل عضو فردي عند 0 ساعة و 4 ساعات. افتح صور قطرة عضوية واحدة عند 0 h و 4 h في ImageJ.
6. انقر على أيقونة الخط المستقيم في شريط الأدوات ، وارسم أولا قطر العضو العضوي عند 0 ساعة. بعد ذلك ، استخدم أداة القياس في ImageJ (تحليل > قياس) لقياس طول هذا الخط ، وبالتالي قطر العضو قبل التورم. كرر العملية على نفس العضو العضوي في 4 ساعات للحصول على قطر العضو بعد التورم.
7. قم بقياس القطر العضوي ل ~ 20 عضويا لكل حالة قبل وبعد فحص التورم.

5. بناء البلازميد لضرب Pax6

تصميم gRNA للضربة القاضية Pax6 باستخدام برامج تحرير قاعدة C > T
ملاحظة: هناك الكثير من البرامج المتاحة لتصميم gRNA. هنا ، تم استخدام Benchling لأن هذا يسمح بتصميم gRNA المتكامل والتعليق التوضيحي ومحاذاة آثار Sanger. وبالتالي ، يمكن أيضا تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة باستخدام برامج بديلة.
1. ابدأ عملية تصميم gRNA عن طريق تصور الجين المستهدف في Benchling بالنقر فوق جديد (+) > تسلسل الحمض النووي > استيراد تسلسلات الحمض النووي.
2. في علامة التبويب استيراد من قاعدة البيانات ، اكتب الجين محل الاهتمام ، Pax6 ، واضغط على بحث.
3. حدد أحدث إصدار من الجينوم المرجعي للماوس GRCm38 (mm10 ، Mus musculus) ، واضغط على استيراد.
4. حدد exon حيث يمكن تصميم gRNA بالضربة القاضية من خلال الالتزام بالقواعد التالية:
  1. تجنب وضع gRNA في إكسون الترميز الأول ، لأن مواقع البدء البديلة في الإكسونات اللاحقة قد تستخدمها الخلية للتحايل على كودون التوقف المستحث المبكر.
  2. صمم gRNAs في exons الموجودة في جميع النصوص البديلة التي يمكن أن تحدث عن طريق ربط Pax6 mRNA. لضمان ذلك ، تصور Pax6 في متصفح جينوم Ensembl ، وحدد exon المستخدم في جميع النصوص.
  3. لمزيد من التحايل على الربط البديل ، استهدف إكسون يحتوي على كودون غير مكتمل (قاعدة أو قاعدتان متبقيتان من ثلاثة توائم). هذا أقل أهمية ولكنه يعطي مزيدا من اليقين حول تأثيرات indels المستحثة. بالنسبة إلى Pax6 ، يعد exon 4 إلى exon 11 هدفا جيدا. بالإضافة إلى ذلك ، اختر إكسون يحتوي على بقايا التربتوفان (W) أو الجلوتامين (Q) أو الأرجينين (R).
    ملاحظة: تحتوي برامج تحرير قاعدة C > T القياسية التي تستخدم SpCas9 على نافذة تحرير تمتد من النوكليوتيدات 4 إلى النوكليوتيدات 8 من بداية gRNA (الأبعد عن PAM). يمكن لمحرري قاعدة C > T إدخال كودونات التوقف على جميع بقايا التربتوفان (W) (TGG إلى TGA أو TAG أو TAA) مع gRNA على الشريط العكسي ، وعلى بقايا الجلوتامين (Q) (CAG إلى TAG أو CAA إلى TAA) ، وأخيرا ، على بقايا الأرجينين (R) (CGA إلى TGA) على الشريط الأمامي.
5. حدد exon + 20 قاعدة المنبع والمصب. انقر على الجانب الأيمن من الشاشة على علامة الهدف كريسبر ، وانقر على أدلة التصميم والتحليل.
6. في القائمة المفتوحة حديثا ، ضمن علامة التبويب نوع التصميم ، حدد أدلة "التحرير الأساسي" (Komor et al. ، 2016). حافظ على طول الدليل عند 20 نيوكليوتيد ، وتحت جينوم الماوس ، حدد GRCm38 (mm10 ، Mus musculus).
7. بعد النقر فوق علامة + الخضراء ، سيكتشف البرنامج تلقائيا جميع تسلسلات الشكل المجاور للفضاء الأولي (PAM) ، وعلى الجانب الأيمن من الشاشة ، يقوم بإنشاء قائمة بجميع gRNAs المحتملة في المنطقة المحيطة ب exon محل الاهتمام.
8. قم بالتمرير خلال القائمة حتى علامة كودون التوقف (*) في مربع أحمر ، والتي تشير إلى gRNA الذي يمكن أن يحول الحمض الأميني إلى كودون توقف ، وبالتالي يؤدي إلى خروج قاضي.
9. في العمود الأول على يمين تسلسل gRNA ، لكل هدف "C" حول نافذة التحرير ، يتم حساب كفاءات التحرير المتوقعة في السيليكو . تأكد من أن تحرير C > T الذي ينتج عنه كودون التوقف لديه كفاءة تحرير لا تقل عن ~ 10.
10. انقر فوق القيمة الموجودة في عمود خارج الهدف للتحقق من المواقع خارج الهدف التي يمكن أن يرتبط بها gRNA. تجنب اختيار gRNA الذي يرتبط بأي جينات إضافية لزيادة النوعية. على سبيل المثال ، يستهدف gRNA الجيد لتحرير Pax6 باستخدام محرر قاعدة C > T exon 7 وهو 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
11. قم بإنشاء تعليق توضيحي في ملف Benchling بالنقر فوق رمز التعليقات التوضيحية في أعلى يمين الشاشة ، متبوعا بتعليق توضيحي جديد. قم بتسمية التعليق التوضيحي ، وتأكد من تحديد اتجاه gRNA الصحيح في القائمة المنسدلة Strand .
جيل البلازميد gRNA
ملاحظة: هناك العديد من النواقل المتاحة لتوصيل gRNA إلى المواد العضوية. تم استخدام البلازميد التالي كقاعدة لبناء gRNA: pFYF1320 (Addgene # 47511 ، هدية لطيفة من كيث جونغ).
1. لاستنساخ gRNAs في pFYF1320 ، قم بتنفيذ إستراتيجية PCR معكوسة باستخدام التمهيدي الأمامي القياسي: "/ 5phos / GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. لتصميم التمهيدي العكسي ، الصق المكمل العكسي لتسلسل فاصل gRNA (تحقق مرة أخرى من اتجاه gRNA [+ أو - حبلا]) أمام جزء التمهيدي العكسي العالمي التالي: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. لاستهداف exon 7 من الماوس Pax6 باستخدام محرر قاعدة C > T ، يكون التمهيدي العكسي كما يلي: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. طلب كل من الاشعال.
2. قم بتشغيل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي باستخدام 1 نانوغرام من pFYF1320 كقالب باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة لمدة 35 دورة عند درجة حرارة تلدين تبلغ 61 درجة مئوية.
3. قم بتشغيل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام أغاروز 1٪ في المخزن المؤقت TAE عند 100 فولت لمدة ~ 45 دقيقة لتصور الجزء المتوقع من 2281 زوجا أساسيا (bp). قم بإجراء تنظيف جل باستخدام المجموعة المفضلة.
4. قم بإعداد تفاعل الربط التالي: 100 نانوغرام من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل النظيف ، وإنزيم Dpn1 لإزالة الحمض النووي الأولي لقالب pFYF1320 ، و T4 ligase. احتضان المزيج لمدة 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية ، و 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، و 20 دقيقة عند 80 درجة مئوية.
5. قم بتحويل مزيج التفاعل إلى بكتيريا DH5α المختصة كيميائيا ، وانشر البكتيريا على ألواح أجار تحتوي على الأمبيسلين¹⁵.
6. في اليوم التالي ، اختر وقم بتوسيع ثلاث مستعمرات فردية في 3 مل من وسط مرق الليزوجيني (LB) المكمل ب 50 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين.
7. في اليوم التالي ، قم بإجراء miniprep على 1 مل من كل من الثقافات الصغيرة الثلاث باستخدام مجموعة miniprep ، وقم بتخزين الباقي في درجة حرارة 4 درجات مئوية. إخضاع البلازميد الذي تم الحصول عليه لتسلسل سانجر باستخدام التمهيدي U6_Forward لضمان إدخال gRNA بشكل صحيح في المتجه¹⁶.
8. بعد تحديد مستعمرة بكتيرية واحدة مع البلازميد الصحيح ، قم بتلقيح 500 ميكرولتر من الثقافة المصغرة المقابلة في 50 مل من LB المكمل بالأمبيسلين لتضخيم الحمض النووي للبلازميد بين عشية وضحاها. قم بإجراء إعداد ميدي في اليوم التالي لاستخدام مجموعة midiprep. سيتم استخدام هذا البلازميد للتثقيب الكهربائي في القسم 6.

6. جيل من استنساخ Pax6 KO

التثقيب الكهربائي العضوي
1. ابدأ بعضويات الماوس التي تم تقسيمها قبل 5 أيام على الأكثر حتى تكون في حالة تكاثري. استخدم ~ 300-400 ميكرولتر من قطرات الأعضاء لكل ضربة قاضية. قم بتضمين شرط إضافي لاختيار عنصر تحكم سلبي سيتم كهربه بدون أي بلازميد.
2. نفذ الخطوات 2.1-2.4 لفصل الكائنات العضوية ، ولكن افصل الكائنات العضوية لفترة أطول بحيث تكون خلايا مفردة. تخلص من المادة الطافية.
3. أعد تعليق الخلايا في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي.
4. في أنبوب سعة 1.5 مل ، قم بإعداد البلازميدات التالية بحد أقصى 20 ميكرولتر: 2.5 ميكروغرام من بلازميد pFYF1320-gRNA ، 2.8 ميكروغرام من البلازميد المحتوي على الترانسبوزاز ، 7.2 ميكروغرام من البلازميد المحتوي على الترانسبوزون المقاوم للهيجروميسين ، و 7.5 ميكروغرام من pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
  ملاحظة: يقوم بلازميد pFYF1320-gRNA بتشفير gRNA المصمم مسبقا ، والذي يوجه المحرر الأساسي إلى الموضع المستهدف. يقوم pCMV_ABEmax_P2A_GFP البلازميد بتشفير المحرر الأساسي ، بالإضافة إلى مراسل GFP ، والذي يمكن استخدامه لمراقبة الخلايا التي تعبر عن المحرر الأساسي بعد التثقيب الكهربائي. يشفر البلازميد المحتوي على الترانسبوزاز الترانسبوزاز ، الذي يلصق الكاسيت المقاوم للرطوبة الذي توفره مقاومة الترانسبوزون المحتوي على الترانسبوزون في مكان ما بشكل عشوائي في الجينوم. تصبح الخلايا التي أدرجت هذا الكاسيت في جينومها مقاومة للهيجروميسين ويمكن اختيارها بشكل إيجابي عن طريق إضافة الهيجروميسين. نظرا لأن الدمج المشترك للعديد من البلازميدات أمر محتمل للغاية ، فإن مقاومة الهيجروميسين تشكل اختيارا وظيفيا لإثراء الخلايا التي تم تحريرها ل Pax6.
5. أضف البلازميدات إلى الخلايا ، واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
6. قم بإعداد جهاز الحفر الكهربائي باستخدام المعلمات التالية لنبض المسام (الجهد: 175 فولت ؛ طول النبض: 5 مللي ثانية ؛ الفاصل الزمني للنبض: 50 مللي ثانية ؛ عدد النبضات: 2 ؛ معدل الاضمحلال: 10٪ ؛ القطبية: +) ولنقل النبض (الجهد: 20 فولت ؛ طول النبض: 50 مللي ثانية ؛ فاصل النبض: 50 مللي ثانية ؛ عدد النبضات: 5 ؛ معدل الاضمحلال: 40٪ ؛ القطبية: +/-).
7. ضع الخلايا مع البلازميدات في كوفيت التثقيب الكهربائي. قم على الفور بقياس المقاومة (Ω) ، والتي يجب أن تكون بين 0.30 A و 0.55 A ، والكهرباء على الفور. يلزم تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب استقرار الخلايا في الجزء السفلي من الكوفيت وتقليل كفاءة التثقيب الكهربائي.
8. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، وأضف 400 ميكرولتر من محلول التثقيب الكهربائي المكمل بمثبط رو كيناز. اسمح للخلايا بالتعافي في RT لمدة 30 دقيقة.
9. قم بإذابة الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وقم بطلاء الخلايا في 200 ميكرولتر من ECM. بعد التصلب ، أضف وسيط توسيع الماوس.
10. العضوية الكيسية تنمو بعد 2-3 أيام. راقب إشارة GFP ، التي تكشف عن وجود محرر قاعدة C > T ، يوميا.
اختيار العضوية
1. بعد ~ 3 أيام ، عندما تتعافى الكائنات العضوية ، أضف 100 ميكروغرام / مل من الهيجروميسين إلى وسط تمدد الماوس لتحديد المواد العضوية التي دمجت كاسيت مقاومة الهيجروميسين. هناك احتمال كبير أن الخلايا التي تمتص بلازميد واحد سوف تمتص عدة بلازميدات. من خلال اختيار المواد العضوية المقاومة للهيجروميسين ، يتم إثراء الكائنات العضوية المحررة على موضع Pax6 .
2. عندما تكون جميع الخلايا في السيطرة السلبية ميتة وتكون الكائنات العضوية الباقية ~ 300 ميكرومتر ، اختر الكائنات العضوية المقاومة للهيجروميسين.
قطف الأعضاء والتنميط الجيني
1. قم بإعداد أطراف P20 معقمة بجوار المجهر وأنابيب 1.5 مل تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول التربسين على الجليد.
2. ثني طرف P20 بالملقط. راقب اللوحة التي تحتوي على المواد العضوية الباقية على مجهر منضدة. عندما يكون العضو العضوي الباقي على قيد الحياة في بؤرة التركيز ، قم بإزالة غطاء اللوحة. باستخدام طرف P20 المثني ولا يزال تحت المجهر ، قم بنضح كل عضو على قيد الحياة على حدة ، وضع كل منها في أنبوب منفصل يحتوي على محلول التربسين.
3. التقاط ما يصل إلى 20 استنساخ. يعتمد عدد الحيوانات المستنسخة التي سيتم اختيارها على عدد الحيوانات المستنسخة المطلوبة لكل تصميم تجريبي وعلى كفاءة التحرير ، والتي تختلف باختلاف كل gRNA والموقع.
4. عندما يتم التقاط جميع الحيوانات المستنسخة ، ضع أنابيب 1.5 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 دقائق. دوامة كل أنبوب بانتظام لزيادة سرعة التفكك ، والتحقق من المواد العضوية تحت المجهر فوق الطاولة. عندما يتم فصل الكائنات العضوية إلى كتل صغيرة و / أو خلايا مفردة ، أوقف عملية الهضم بإضافة 1 مل من الوسط الأساسي.
5. لكل نسخة يتم اختيارها ، احتفظ ب ~ 400 ميكرولتر للنمط الجيني في أنبوب منفصل سعة 1.5 مل. قم بتدوير ~ 600 ميكرولتر اليسار عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 20 ميكرولتر من ECM ، وقم بوضعها كقطرة واحدة في بئر من صفيحة 24 بئرا ، وأضف وسيط تمدد الماوس بدون hygromycin.
6. للتنميط الجيني للمستنسخات ، قم بتدوير الأنابيب التي تحتوي على ~ 400 ميكرولتر من تعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي.
7. احتضان الخلايا على الفور على النحو التالي: 6 دقائق عند 60 درجة مئوية ، دوامة ، و 4 دقائق عند 95 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بهذا الحمض النووي لمدة تصل إلى 7 أيام عند -20 درجة مئوية ، ولكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل النهائي على الفور هو الأمثل.
8. لتضخيم الموضع المستهدف بالنيوكلياز ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على 2 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج باستخدام بادئات التنميط الجيني المناسبة المطلوبة مسبقا وبوليميراز منخفض الدقة. بادئات التنميط الجيني هي AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) و TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). يجب أن يبدأ amplicon حوالي 100 نقطة أساس من الموضع المحرر المتوقع لضمان تسلسله بكفاءة.
9. قم بتشغيل منتج PCR على هلام الأغاروز لتقييم كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كما هو مذكور في الخطوة 5.2.3. عند اكتشاف شريط بالحجم الصحيح ، قم بقصه من الجل لإجراء استخراج هلام الحمض النووي باستخدام مجموعة.
10. تسلسل الحمض النووي المستخرج من كل استنساخ عضوي تم اختياره مسبقا باستخدام بادئات التنميط الجيني.
11. قم بمحاذاة التسلسلات التي تم الحصول عليها مع جين Pax6 في Benchling. افتح تسلسل الجينات المستوردة من الخطوة 4.1. انقر فوق المحاذاة على الجانب الأيمن ، ثم على إنشاء محاذاة جديدة. قم بتحميل ملفات .ab1 التي تم الحصول عليها من موفر التسلسل ، وحدد DNA كنوع نيوكليوتيد ، واضغط على التالي.
12. في النافذة التالية ، حدد متعدد التسلسلات وبرنامج المحاذاة تلقائي (MAFFT) قبل النقر فوق إنشاء محاذاة.
13. حدد الأنماط الجينية التي تحتوي على كودون توقف سابق لأوانه متماثل الزيجوت (كما تم الحصول عليه باستخدام محرري القاعدة) على كلا الأليلين. احتفظ بالنسخ المستنسخة العضوية المقابلة للتوسع ، واحفظها بالتبريد لمزيد من التحليل. من الناحية المثالية ، يجب تحليل ثلاثة استنساخ عضوي مختلف جنبا إلى جنب للتحايل على التأثيرات المحتملة للنيوكلياز خارج الهدف.

7. زرع تقويم العظام من عضويات الغدة الدمعية البشرية في الفئران NSG

إعداد عضوي
1. يجب تقسيم عضويات الغدة الدمعية البشرية ~ 3 أيام قبل يوم الزرع ، كما هو موضح في القسم 2. في يوم الزرع ، تأكد من أن الكائنات العضوية في المرحلة التكاثرية لزيادة فرص النقش.
2. لاستخراج المواد العضوية من ECM ، أضف dispase إلى وسط الاستزراع للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.125 وحدة / مل. باستخدام P1000 ، أعد تعليق قطرات ECM تماما لتعطيلها ، ثم ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حجم 100 ميكرولتر من ECM يكفي لحقن ~ 10 غدد دمعية.
3. أعد تعليق المواد العضوية في 10 مل من الوسط الأساسي لغسل الإنزيم. بيليه الخلايا في 400 × غرام لمدة 5 دقائق.
4. إعادة تعليق الخلايا (~ 1,500,000) في 50 ميكرولتر من وسط التمدد البشري البارد المكمل ب 5٪ ECM. ضع التعليق العضوي على الجليد ، وانتقل فورا إلى عملية الزرع.
زرع تقويم العظام في الفئران
1. في منشأة الحيوانات ، لديك تعليق عضوي وإبر الأنسولين على الجليد. نضح تعليق عضوي في إبرة الأنسولين الباردة.
2. قم بتخدير فأر NOD scid gamma (NSG) الذي يعاني من نقص المناعة مع 3٪ إيزوفلوران لبدء التخدير. عندما يكون الماوس نائما ، ضعه بسرعة على جانبه مع إمكانية الوصول إلى الغدة الدمعية الرئيسية (الموجودة في منتصف الطريق بين العين والأذن).
3. حقن 5 ميكرولتر من المعلق العضوي مباشرة من خلال الجلد في الغدة الدمعية. الحد الأقصى للحجم الذي يمكن أن تحتويه الغدة الدمعية للفأر هو 5 ميكرولتر.
4. اسمح للفأر بالتعافي ، ومراقبة الماوس كل يوم لتقييم وجود أي إزعاج يتعلق بعملية الزرع ، خاصة على العين.
تقييم النقش
1. التضحية بالفأر باستنشاق O 2 / CO₂ بعد ما يصل إلى 90 يوما اعتمادا على ما إذا كان يجب تقييم النقش قصير الأجل أو طويل الأجل¹³.
2. تشريح الغدة الدمعية كما هو موضح في القسم 1. إصلاحه في 4 ٪ الفورمالين لمدة 24 ساعة في RT.
3. ضع الغدة الدمعية في كاسيت. تجفيف الغدة الدمعية عن طريق حضنها على النحو التالي: 2 ساعة في 70٪ إيثانول ، 2 ساعة في 96٪ إيثانول ، 1 ساعة في 100٪ إيثانول (2x) ، 2 ساعة في الزيلين ، وبين عشية وضحاها في البارافين السائل عند 58 درجة مئوية في الفرن.
4. في اليوم التالي ، قم بتوجيه الغدة الدمعية كما هو مفضل في قالب معدني ، وقم بتعبئتها بالبارافين السائل ، واترك الكتلة تتصلب على سطح بارد. من الأفضل تنفيذ هذه العملية باستخدام آلة التضمين.
5. عندما تكون كتلة البارافين صلبة ، قم بتقطيع الكتلة بأكملها إلى أقسام 4-5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. احتفظ بجميع الأقسام (على شكل شرائط) في بيئة جافة وخالية من التيارات الهوائية. يمكن الاحتفاظ بالأقسام إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.
6. عينة واحدة من كل 10 أقسام تغطي الكتلة بأكملها.
  1. قم بتركيب الأقسام على شريحة على النحو التالي: ضع قطرة ماء على الشريحة ، ضع القسم في الأعلى ، واتركه يرتاح لمدة ~ 2 دقيقة للسماح له بالتمدد على لوح تسخين 42 درجة مئوية ، وقم بإزالة الماء برفق بالورق.
  2. ضع الشرائح لتجف طوال الليل في فرن على حرارة 58 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بالشرائح إلى أجل غير مسمى في RT بعد هذه المرحلة.
7. لتمييز الخلايا البشرية عن خلايا الفأر ، قم بإجراء تلطيخ المستضد النووي البشري على هذه الأقسام. أعد ترطيب الأقسام عن طريق إجراء الغسلات التالية: 3 دقائق في الزيلين (2x) ، 1 دقيقة في 100٪ إيثانول (2x) ، 1 دقيقة لكل منهما 96٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، 60٪ إيثانول ، و 25٪ إيثانول ، وأخيرا ، 1 دقيقة في ماء ديمي (2x).
8. احتضان الشرائح لمدة 15 دقيقة في مخزن PO المؤقت (الجدول التكميلي 1). اغسل الشرائح 3x في ماء فائق النقاء.
9. إجراء استرجاع مستضد قائم على السيترات في الأوتوكلاف:
  1. ضع الشرائح في حامل منزلق مقاوم للأوتوكلاف في سلة مملوءة بمخزن سترات مؤقت (الجدول التكميلي 1). ضع السلة في الأوتوكلاف ، وقم بتشغيل دورة الأوتوكلاف (الضغط: 10 رطل لكل بوصة مربعة ؛ درجة الحرارة: 121 درجة مئوية ؛ الوقت: 15 دقيقة).
  2. عندما يتم إزالة الضغط من الأوتوكلاف ، استرجع السلة التي تحتوي على الشرائح ، وضعها في حمام مائي RT لإحضار الشرائح إلى RT.
    ملاحظة: تعتمد استراتيجية استرجاع المستضد على الجسم المضاد المستخدم. ارجع إلى ورقة بيانات الموفر لإجراء استرجاع المستضد الأكثر ملاءمة.
10. ضع الشرائح أفقيا ، بحيث يكون جانب القسم لأعلى ، على صينية حضانة. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في PBS في الأعلى ، واحتضانه لمدة 1 ساعة. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر.
11. قم بإعداد محلول الجسم المضاد عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للمستضد النووي البشري إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لكل شريحة يتم تلوينها. أضف محلول الأجسام المضادة إلى كل شريحة. احتضان طوال الليل في صينية حضانة رطبة على حرارة 4 درجات مئوية.
12. في اليوم التالي ، اغسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني. احتضان الشرائح بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر HRP غير مخفف لمدة 45 دقيقة. اغسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني.
  أنذر. في غطاء كيميائي ، قم بإعداد المخزن المؤقت DAB (الجدول التكميلي 1). احتضان الشرائح مع العازلة DAB لمدة 10 دقائق. تخلص من أي نفايات في حاويات النفايات السائلة الكيميائية العضوية.
13. اغسل الشرائح بالماء. احتضان الشرائح لمدة 2 دقيقة في الهيماتوكسيلين لمقاومة النوى. اغسل الشرائح في ماء الصنبور الجاري لمدة 10 دقائق.
14. قم بتجفيف الشرائح عن طريق احتضانها لمدة دقيقة واحدة في كل منها 50٪ إيثانول ، 60٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، 1 دقيقة في 96٪ إيثانول (2x) ، 1 دقيقة في 100٪ إيثانول (2x) ، و 1 دقيقة في زيلين (2x).
15. أرفق الشرائح بوسيط تثبيت وقسيمة غطاء. بعد التجفيف لمدة 20 دقيقة ، راقب الشرائح تحت المجهر.
أنا>

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد تشريح الغدة الدمعية للفأر (الشكل 2 أ) ، ولد الهضم الأنزيمي والميكانيكي شظايا صغيرة من الأنسجة ، من بينها العنيبات والقنوات (الشكل 2 ب). الأجزاء الكبيرة المتبقية من الأنسجة من شأنها أن تزعزع استقرار ECM ، مما يقلل من النمو العضوي الأولي. كان اشتقاق الغدة الدمعية للفأر ناجحا عندما تم العثور على عضويات كيسي بقطر ~ 500 ميكرومتر بعد ~ 7 أيام ، وهي المرحلة التي كانت فيها الكائنات العضوية جاهزة للانقسام (الشكل 2C). حتى لو كان الاشتقاق العضوي الكلي ناجحا ، فقد تبدأ بعض الكائنات العضوية في النمو قبل التوقف في النهاية. نمت عضويات الغدة الدمعية البشرية كأكياس في غضون 3-4 أيام ووصلت إلى الحجم الكامل النمو في 10-14 يوما بعد عزل الأنسجة (الشكل 2 د). بالنسبة لكل من الفئران والبشر ، فشل الاشتقاق العضوي في بعض الأحيان ، مع عدم نمو أو عدد قليل من الكائنات العضوية. كان هذا بشكل عام بسبب الإفراط في هضم الأنسجة. يمكن تمرير عضويات الغدة الدمعية للفأر 40x على الأقل والكائنات العضوية البشرية 20x على الأقل. تم تمرير كل 7-10 أيام في المتوسط ، وهذا يتوقف على النمو العضوي.

figure-results-1
الشكل 2: تكوين عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية. أ: صور فوتوغرافية للمراحل المختلفة لتشريح الغدة الدمعية للفأر. يشير السهم إلى الغدة الدمعية تحت غشاءها الواقي. (ب) صور برايتفيلد لخلايا الغدة الدمعية للفأر بعد هضم الأنسجة مباشرة، مع وجود أجزاء داخلية توضح العنيب والقناة. (ج) صور برايتفيلد لاشتقاق عضوي ناجح وغير ناجح للغدة الدمعية للفأر. د: صور برايتفيلد لنمو عضوي بشري على مدار 14 يوما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحتوي عضويات الغدة الدمعية على نسبة كبيرة من الخلايا الجذعية عند زراعتها في وسط التمدد. لزيادة مستوى تمايزها ، قمنا بإعداد ماوس ووسيط تمايز بشري مع محتوى عامل نمو منخفض. بعد 5 أيام و 7 أيام ، على التوالي ، في وسط التمايز ، أصبحت عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية أكثر كثافة (الشكل 3A-B). يرتبط هذا التغيير المورفولوجي بزيادة الخصائص الوظيفية. أدى تطبيق منشط AMP الدوري فورسكولين أو الناقل العصبي بافراز إلى تورم عضوي (أي إفراز الماء القمي) في أقل من 3 ساعات (الشكل 3C). عندما استغرق التورم وقتا أطول من 3-4 ساعات ، يشير ذلك إلى أن المواد العضوية لم تكن متمايزة بما فيه الكفاية و / أو لم تعبر عن علامات وظيفية ، مثل مستقبلات الناقلات العصبية.

figure-results-2
الشكل 3: تمايز عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية ومقايسة التورم الوظيفي في العضويات البشرية. (أ) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية للفأر المستزرعة في وسط التمدد لمدة 7 أيام وفي وسط التمايز لمدة 5 أيام بعد 2 أيام في وسط التمدد. (ب) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية البشرية المستزرعة في وسط التمدد لمدة 11 يوما وفي وسط التمايز لمدة 9 أيام بعد يومين في وسط التمدد. (ج) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية البشرية المتمايزة المعرضة لوسط تمايز جديد (تحكم) ، إلى 1 ميكرومتر فورسكولين ، و 100 ميكرومتر نورإبينفرين على مدار 3 ساعات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لضرب Pax6 في عضويات الغدة الدمعية للفأر ، تم إنشاء بلازميد يحتوي على gRNA الذي يستهدف Pax6 المختار بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل والربط (الشكل 4 أ). تم تكريب هذا البلازميد المحتوي على gRNA جنبا إلى جنب مع بلازميدات Piggy-Bac (البلازميدات المحتوية على الترانسبوزون المحتوية على الترانسبوزون والترانسبوزاز) ومحرر قاعدة C > T Cas9 في عضويات الغدة الدمعية للفأر المنفصلة إلى خلايا مفردة. بعد 3 أيام ، عندما تعافت الكائنات العضوية ، تعرضوا للهيجروميسين لاختيار الحيوانات المستنسخة التي تضمنت كاسيت مقاومة الهيجروميسين. في التثقيب الكهربائي الناجح ، نمت المواد العضوية المقاومة للهيجروميسين (الشكل 4 ب). تم اختيار الحيوانات المستنسخة العضوية المتنامية التي كانت أكبر من ~ 300 ميكرومتر ، من الناحية المثالية قبل أن تبدأ في التمايز تلقائيا (الشكل 4C). تم استخراج الحمض النووي من جزء من العضو العضوي مع الحفاظ على الباقي في الثقافة. أسفر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لموضع Pax6 المستهدف بواسطة gRNA عن نطاق 367 bp لكل من الحيوانات المستنسخة التي تم اختيارها (الشكل 4D). بعد تسلسل الموضع المضخم ، تم الاحتفاظ بالنسخ المستنسخة التي تم تحريرها بشكل متماثل C > T (n = 1). من ناحية أخرى ، تم تجاهل الحيوانات المستنسخة التي لم يتم تحريرها (n = 4) ، أو تم تحريرها بشكل غير متجانس ، أو تم تحريرها بشكل خاطئ (n = 1) (الشكل 4E). بشكل عام ، باستخدام هذا gRNA الذي يستهدف Pax6 ، تم الحصول على نسخة واحدة من الغدة الدمعية للفأر متماثل الزيجوت من أصل ستة متتابعة. نمت بعض الحيوانات المستنسخة بشكل جيد ، لكن بعض الحيوانات المستنسخة العضوية فقدت بعد قطفها أو بدأت في التمايز (الشكل 4F). من بين 10 استنساخ عضوي تم اختياره ، نمت 7 بشكل جيد.

figure-results-3
الشكل 4: الضربة القاضية بوساطة تحرير القاعدة ل Pax6 في عضويات الغدة الدمعية للفأر. (أ) تتبع تسلسل سانجر ل pFYF1320 بعد التكامل الصحيح ل gRNA الذي يستهدف موضع Pax6. (ب) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية للفأر بعد 5 أيام من التعرض للهيجروميسين بعد التثقيب الكهربائي. تم استزراع المواد العضوية في وسط تمدد الفئران. على اليسار مثال على فشل التثقيب الكهربائي ، مع عدم وجود استنساخ مقاوم للهيجروميسين ينمو. على اليمين مثال على التثقيب الكهربائي الناجح ، مع بقاء العديد من الحيوانات المستنسخة العضوية المقاومة للهيجروميسين. (ج) صور برايتفيلد للمستنسخات التي يجب قطفها والحيوانات المستنسخة التي لا ينبغي قطفها. (د) هلام الأغاروز يوضح تضخيم موضع Pax6 المستهدف بالحمض النووي الريبوزي الريبوزي (gRNA). باللون الأخضر ، يتم تمييز النطاق بالحجم المتوقع البالغ 367 نقطة أساس. ه: تتبع تسلسل سانجر لثلاث مستنسخات عضوية مقاومة للهيجروميسين. الاستنساخ العلوي غير محرر. الاستنساخ الأوسط هو إصدار C > T متماثل الزيجوت ، وبالتالي ، خروج المغلوب متماثل الزيجوت. يقدم الاستنساخ السفلي طفرتين نقطيتين متغايرة الزيجوت وهو إما خروج المغلوب غير المتجانس أو استنساخ مختلط وقد تم تحريره بشكل خاطئ. (F) صور برايتفيلد للمستنسخات العضوية المنتقاة بمستويات مختلفة من النمو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أخيرا ، لإجراء عملية زرع تقويم الغدة الدمعية البشرية في الفئران ، تم استخدام المواد العضوية التي تم تقسيمها قبل 3 أيام (< 100 ميكرومتر في القطر). تم تأكيد النقش العضوي بعد شهر 1 من حقن المواد العضوية في الغدة الدمعية للفأر عن طريق تلطيخ علامة خاصة بالإنسان ، المستضد النووي البشري (الشكل 5). يشير عدم وجود تلطيخ نقطي من جميع أقسام الغدة الدمعية للفأر إلى نقص النقش العضوي البشري.

figure-results-4
الشكل 5: زرع عضويات الغدة الدمعية في الإنسان في الغدة الدمعية للفأر. تلطيخ الغدد الدمعية للفأر المزروعة لعلامة النواة البشرية لمراقبة engraftment 1 شهر بعد الزرع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: تكوين وسائط الإعلام والمخازن المؤقتة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إنشاء واستخدام عضويات الغدة الدمعية للمقايسات الوظيفية ونمذجة الطفرات والزرع. عند إنشاء عضويات الغدة الدمعية للفأر والإنسان ، فإن تفكك الأنسجة أمر بالغ الأهمية. إذا لم يتم هضم الأنسجة بشكل كاف ، فسيكون العائد العضوي منخفضا. إذا تم هضم الأنسجة بشكل مفرط ، ستموت الخلايا ولن تنمو كعضويات. يجب هضم كل نسيج بإنزيم معين لفترة محددة لضمان النمو العضوي الأمثل¹⁴،¹⁷^،¹⁸. الغدة الدمعية هي نسيج رخو إلى حد ما يكون فيه هضم كولاجيناز من 5-10 دقائق مع التفكك الميكانيكي القائم على السحب كافيا لعزل قطع صغيرة من الأنسجة. إذا كانت هناك حاجة للحصول على خلايا مفردة لتطبيقات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، فيمكن إجراء التفكك لفترة أطول حتى يتم الوصول إلى مرحلة الخلية الواحدة ، ولكن يجب إيقاف التفكك بمجرد الحصول على خلايا مفردة للحد من أي انخفاض في الجدوى. نظرا لأن تفكك الأنسجة أمر بالغ الأهمية ، فإن الإفراط في الهضم هو السبب الأكثر ترجيحا لفشل إنشاء الغدة الدمعية العضوية.

الصيانة المناسبة لعضويات الغدة الدمعية مهمة لاستخدامها. الصيانة طويلة الأجل هي السمة المميزة لعضويات الغدة الدمعية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة ، مقارنة بالكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة^{متعددة القدرات} ^7,17. لتحقيق صيانة طويلة الأجل ، يجب إجراء تقسيم عضوي منتظم وتغييرات متوسطة. بدون ذلك ، تبدأ الكائنات العضوية في التمايز وتطوير إمكانات الخلايا الجذعية المنخفضة ، مما يعيق صيانتها على المدى الطويل⁷. في هذه الخطوة مرة أخرى ، يمكن أن يؤدي الإفراط في الهضم إلى قتل الخلايا الجذعية وإضعاف صيانة المواد العضوية. للصيانة الدورية ، لا يلزم تفكك الأعضاء في خلايا مفردة. ومع ذلك ، لتوليد خطوط عضوية نسيلية بالضربة القاضية ، من الأهمية بمكان البدء بخلايا مفردة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فسوف تتكون الكائنات العضوية من فسيفساء من الخلايا ذات الخلفيات الجينية المختلفة ، مما يجعل تحليل تأثير طفرة واحدة محددة مستحيلا. نصف هنا استخدام محرر قاعدة C > T لتوليد كودونات الإيقاف. يعتمد محرر الجينوم هذا على وجود كودونات الأرجينين أو الجلوتامين أو التربتوفان داخل 12-18 قاعدة من NGG PAM. عندما لا يتم استيفاء هذه الشروط في تصميم gRNA ، يمكن استخدام محرري قاعدة Cas9 أو C >T التقليدية مع PAMs البديلة ^7,18. ومع ذلك ، يقدم Cas9 التقليدي فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل تؤدي إلى indels عند الإصلاح¹¹. وبما أن كلا الأليلين قد يحتويان على إندلات مختلفة، فإن التنميط الجيني المستنسخ يتطلب مزيدا من الحذر. يجب إجراء إزالة الالتفاف للتعديلات التي تم إدخالها للتأكد من أن كلا الأليلين يحتويان على إندل خارج الإطار ، وبالتالي ، يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة العضوية للجين المستهدف¹⁹. تكمن ميزة محررات قاعدة C > T في حقيقة أنه يمكن استخدامها لنمذجة الطفرات النقطية التي لا تؤدي بالضرورة إلى كودونات التوقف. على سبيل المثال ، يمكن استخدامها لنمذجة طفرات Pax6 المحددة الموجودة في المرضى الذين يعانون من الأنيريديا لدراسة تأثيرها على فسيولوجيا الغدة الدمعية²⁰.

تفرز الغدة الدمعية الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع¹. يمكن تلخيص إفراز الدموع في الكائنات العضوية البشرية بعد التمايز بوساطة انسحاب عامل النمو وتثبيط NOTCH. في ظل هذه الظروف ، تخضع المواد العضوية للتمايز النهائي ولا يمكن الحفاظ عليها. ومع ذلك ، يمكن أن توجه عضويات الغدة الدمعية المتمايزة تطوير الأدوية التي تحفز التمزق في سياق مرض جفاف العين ، وربما في شاشات عالية الإنتاجية. مقايسة التمزق المقدمة في هذا البروتوكول هي التي تعطي حاليا أكبر تغيير في حجم الأعضاء في فترة زمنية قصيرة ، مما يسهل القياس الكمي في سياق شاشة الدواء⁷،⁹^،¹⁷.

العلاج بالخلايا الجذعية يحمل وعدا كبيرا لتجديد الغدة الدمعية في مرض جفاف العين²¹. يمكن أن تكون عضويات الغدة الدمعية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة مادة مصدر لمثل هذه التطبيقات. ينتج عن البروتوكول المقدم هنا تطعيم عضوي للغدة الدمعية البشرية ، في الغالب على شكل خراجات. يمكن أن ينشأ النقش العضوي المنخفض بسبب حقن المواد العضوية في الموقع الخطأ. يسمح تدريب إجراء الحقن بصبغة بتتبع موقع الحقن ، وفي النهاية يحسن دقة الحقن. بدلا من ذلك ، يمكن شق بشرة الفأر للوصول المباشر إلى الغدة الدمعية ، كما هو الحال في الفئران قبل²². تستغرق هذه الطريقة وقتا أطول ولكنها قد تكون أكثر دقة. من ناحية أخرى ، مع البروتوكول الحالي ، لم تندمج الكائنات العضوية وظيفيا في الغدة الدمعية للفأر. وقد لوحظت نتائج مماثلة لتطعيم الغدة الدمعية^{المشتقة من} iPSC 22. يمكن تحسين طريقة الزرع بشكل أكبر عن طريق جرح الغدة الدمعية مسبقا ، باستخدام نموذج فأر العين الجافة ، و / أو حقن الكائنات العضوية كخلايا مفردة أو كتل صغيرة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون عضويات الغدة الدمعية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة ومجموعة الأدوات ذات الصلة أساسا للتطبيقات المستقبلية في أبحاث الغدة الدمعية والطب التجديدي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هانز كليفرز هو رئيس أبحاث الأدوية والتطوير المبكر في روش ، بازل ، ويحمل العديد من براءات الاختراع المتعلقة بتكنولوجيا المواد العضوية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر يوريك بوست على التطوير الأولي للبروتوكول. تم دعم هذا العمل جزئيا بجائزة من التحدي الكبير لأبحاث السرطان في المملكة المتحدة (C6307 / A29058) ومؤسسة مارك لأبحاث السرطان لفريق SPECIFICANCER.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي ذات القفل الآمن	Eppendorf	EP0030 120.094
3،3 & -هيدرات ديامينوبينزيدين رباعي هيدروكلوريد (DAB)	سيجما ألدريتش	D5637	CAS: 868272-85-9 ، الحذر ، يمكن تخزين محلول 6 جم / لتر عند -20 درجة ؛ C
5x الأخضر GoTaq Flexi buffer	Promega	M891A	Store at -20 & deg; C
A83-01	Tocris	2939	Store at -20 & deg; C ، مخزون في 30 ملم ، 10000x
متقدم DMEM / F12	Invitrogen	12634-010	مخزن في 4 درجات ؛ ألواح C
Agar التي تحتوي على Ampicillin	Hubrecht Institute
Ampicillin ملح الصوديوم	Sigma-Aldrich	A9518
الأوتوكلاف VAPOUR-Line Lite	VWR المواد الكيميائية
B27 المكمل	الغذائي Invitrogen	17504-044	يخزن في -20 درجة ؛ C ، 50x
BD إبرة الأنسولين الدقيقة الدقيقة 1 مل	BD Bioscience	324825
مجهر منضدة DMI1	ألبومين مصل Leica
البقري (BSA)	MP الطب		الحيوي 160069 مخزن في 4 درجات ؛ C
BTXpress	BTX	MDS450805
C57BL / 6 فئران	كاسيت معهد
	هوبريشت Klinipath	410-02S
CellBanker 1	amsbio	11910	وسيط الحفظ بالتبريد ، يلتزم بالتعليمات
جهاز طرد مركزي	Eppendorf
حامض الستريك أحادي الهيدرات	JT Baker	0088	سجل المستخلصات الكيميائية: 5949-29-1
كولاجيناز I	Sigma Aldrich	C9407	Aliquots عند 20 مجم / مل ، 20x ، تخزين عند -20 درجة ؛ أنابيب C
مخروطية 15 مل	Greiner Bio-One	5618-8271
أنابيب مخروطية 50 مل	Corning	CLS430828-500EA
Coverslips 24 مم × 50 مم	Menzel-Gl & auml ؛ زر	BB024050S1
مستخلص الغشاء القاعدي Cultrex (BME) ، عامل النمو المخفض ، النوع 2 - مصفوفة خارج الخلية	R& D Systems ، Bio-Techne	3533-001-02	Store at -20 & deg ؛ C ، حافظ على 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى 1 شهر
DAPT	Sigma Aldrich	D5942	Store at -20 & deg; C ، مخزون عند 10 ملي مولار ، 1000x
الصوديوم فوسفات الهيدروجين اللامائي	VWR الكيميائية	28026.292	CAS: 7558-79-4
ثنائي الصوديوم هيدروجين فوسفات ثنائي هيدرات	سيجما ألدريتش	71643	CAS: 10028-24-7
Dispase	ThermoFisher Scientific	17105-041	Aliquots عند 50 U / mL ، تخزين عند -20 درجة ؛ C حتى الاستخدام ، 400x
مشرط معقم يمكن التخلص منه N & deg ؛ 10	Swann Morton	3033838
DM4000 مجهر	Leica
dNTPs 25 ملي مولار	Promega	U1420	امزج جميع النيوكليوتيدات الأربعة معا ، وتخزينها عند -20 درجة ؛ C
Dpn1	New England Biolabs	R0176
Dulbecco's محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS)	Gibco	14190144	1x
مصافي سهلة 70 & ميكرو ؛ m	Greiner	542170
كوفيت التثقيب الكهربائي	Nepagene	EC002S
EnVision + / HRP	ماوس Agilent	K400111-2
الإيثانول 100٪	BOOM	84045206 ؛ 5000	تحذير ، استخدم لتحضير مخففات أخرى من الإيثانول
الإيثانول 70٪	BOOM	84010059.5000	تحذير
الإيثانول 96٪	BOOM	84050065.5000	تحذير
EVOS FL Auto 2 Cell	Imaging ThermoFisher Scientific		Live-imaging brightfield microscrope
FGF10	Peprotech	100-26	Store at -20 & deg; C, مخزون في 100 ملغ/مل في الوسط الأساسي, 100x
فيجي	المعاهد الوطنية للصحة, مطوري
حل الفورمالديهايد 4٪	سيجما-ألدريتش	1.00496	سجل المستخلصات الكيميائية: 50-00-0, تحذير
فورسكولين	توكرس	1099	مخزن في -20 & درجة; C ، مخزون في 10 ملم ، 10000x
Glutamax	Gibco	35050-061	100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase	Promega	M7805	تخزين عند -20 درجة ؛ C
Haematoxylin	VWR للكيماويات	10047105	يحفظ في درجة حرارة الغرفة
HEPES	Gibco	15630-080	يخزن في 4 درجات ؛ C ، 100x
Histocore H و C ، آلة تضمين الأنسجة	Leica
Hot Plate	Meidax
الجسم المضاد للمستضد النووي البشري	Abcam	ab-190710
حمض الهيدروكلوريك 5	N ThermoFisher Scientific	10605882	CAS: 7647-01-0 ، تنبيه
بيروكسيد الهيدروجين 30٪	مختبر كيميائي	CL00.2308.1000	CAS: 7722-84-1 ، تحذير
مخزون Hygromycin B-gold	InvivoGen	ant-hg	بسعر 100 مجم /& ميكرو ؛ L ، 1000x
مقاومة Hygromycin تحتوي على كاسيت يحتوي على البلازميد			Andersson-Rolf et al ، طرق الطبيعة ، 2017. DOI: 10.1038 / NMETH.4156
IsoFlo 100٪	Mecan	5960501
LB متوسط	معهد
Institute MgCl2 25 mM	Promega	A351H	Store عند -20 درجة ؛ مجموعة عزل الحمض النووي C
Microtome RM2235	Leica
Midiprep	ThermoFisher Scientific	K210005
Miniprep طقم عزل الحمض النووي	ThermoFisher Scientific	K210003
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	تخزين في -20 درجة ؛ C ، مخزون في 500 ملي متر ، 400x
NEPA21 المثقب الكهربائي	Nepagene
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636	Store at -20 & deg ؛ C ، مخزون في 1M ، 100x
NOD Scid Gamma (NSG) الفئران	معهد Hubrecht مستعمرة
Noggin مكيفة متوسطة	U-Protein Express	طلب مخصص	مخزن عند -20 درجة ؛ C
Noradrenaline	Sigma Aldrich	A7257	Store at -20 & deg; C ، مخزون في 100 ملي
متر فرن	Memmert		مجموعة عند 58 درجة ؛ ماصات C
P20 و P200 و P1000 كيماويات	جيلسون
بارافين	VWR	10048502
ماصات باستور ، توصيل زجاج	ThermoFisher Scientific	1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG ؛	IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC	IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP	Addgene	112101
البنسلين / الستربتومايسين	Invitrogen	15140-122	يخزن في -20 درجة ؛ C
Pertex	Klinipath	AM-08010
pFYF1320 ؛	Addgene	47511
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1000X ، مخزن في -20 درجة ؛ C
Prostaglandin E2 (PGE2)	Tocris	2296	يخزن عند -20 درجة ؛ C ، مخزون بحجم 10 مم ، طبق بتري 10000 ×
، 10 سم	Greiner	633102
Q5 عازلة	نيو إنجلاند Biolabs	B9027S
Q5 بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة	نيو إنجلاند Biolabs	M0491S
QIAquick Gel Extraction	Kit Qiagen	28704
QuickExtract DNA Extract Solution	Lucigen	QE09050	Store aliquots عند -20 درجة ؛ C
R-spondin 3 مكيفة متوسطة	U-Protein Express	طلب مخصص	مخزن عند -20 درجة ؛ C
sgRNA التمهيدي العكسي: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTCCAAG	IDT
Slides StarFrost		MBB-0302-55A
أزيد الصوديوم	Merck	8.22335.1000	CAS: 26628-22-8 ، تنبيه
ثنائي هيدرات سيترات الصوديوم	JT Baker	0280	CAS: 6132-04-3
التمهيدي الأمامي القياسي: "/ 5phos / GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC	IDT
كفاءة الاستنساخ الفرعي الخلايا المختصة DH5alpha	Invitrogen	18265-017
ألواح زراعة الخلايا المعلقة (24 بئر)	Greiner Bio-One	662102	24 بئرا
(12 بئر)	Greiner Bio-One	665102	12-well
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202
TAE buffer	ThermoFisher Scientific	B49	Stock عند 50x ، مخفف إلى 1x بالماء عالي النقاء
المحتوي على Transposase			Andersson-Rolf et al ، Nature Methods ، 2017. doi: 10.1038 / nmeth.4156
TrypLE Express Enzyme	Invitrogen	12605-028	مخزن في 4 درجات ؛ C
U6_Forward التمهيدي: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT	IDT
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550
حمام مائي	Tulabo
Xylene	Klinipath	4055-9005	CAS: 1330-20-7 ، تحذير
Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد	مخزن عند -20 درجة ؛ C ، مخزون عند 10 مم ، 1000x

ثنائي فيجيHubrecht لاصق ، المطحون ألواح زراعة الخلايا المعلقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Garg, A., Zhang, X. Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine. Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).
Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. Resistance to infection of the external eye: The role of tears. Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).
Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).
Massie, I., et al. Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).
Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PloS One. 7 (1), 29458(2012).
Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).
Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).
Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).
Jeong, S. Y., et al. Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247(2021).
Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).
Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing. Frontiers in Genetics. 12, 728520(2021).
Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).
Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).
Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids. Journal of Visualized Experiments. (180), e62438(2022).
Lõhmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
Bloh, K., et al. Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data. The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).
Latta, L., et al. Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions. The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).
Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy. The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).
Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Lacrimal Gland Organoids Organoid Differentiation Genetic Manipulation Organoid Transplantation Tissue Digestion Electroporation Protocol Organoid Culture Human Lacrimal Gland Mouse Lacrimal Gland Organoid Engraftment

إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة